專利名稱：全血灌流吸附治療用吸附劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，涉及一種全血灌流吸附治療用吸附劑及制備方法。
重癥肌無力(myasthenia gravis，以下簡(jiǎn)稱MG)是一種主要累及神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜乙酰膽堿受體由乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)的細(xì)胞免疫依賴性補(bǔ)體參與的自身免疫性疾病，乙酰膽堿受體抗體主要為免疫球蛋白G(IgG)。MG是一個(gè)臨床進(jìn)展較為惡略的疾病，不積極治療會(huì)引起嚴(yán)重后果，未經(jīng)治患者10年內(nèi)死亡率可高達(dá)20-30％。膽堿酯酶抑制劑、胸腺切除、免疫抑制劑、靜脈內(nèi)注射免疫球蛋白、血液凈化為目前MG的主要治療方法。比較而言血液凈化因能直接清除患者血液中的致病抗體，即刻改善MG的癥狀，能使危重病人轉(zhuǎn)危為安，是目前幾種治療方法中最為積極、見效最快的方式。
自1976年P(guān)inching AJ首先報(bào)道血漿交換治療使MG病人癥狀得以緩解之后，以血漿交換為基礎(chǔ)的直接清除MG患者血液中的致病抗體的血液凈化治療方法不斷改進(jìn)。首先人們認(rèn)識(shí)到血漿交換需補(bǔ)充正常人體血漿，不僅給患者帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且存在血制品的污染問題。為克一種專用于制備全血灌流吸附治療用吸附劑的方法，它是經(jīng)過以下步驟制成的(1)吸附劑載體的活化用抽濾瓶抽干蒸餾水反復(fù)沖洗后的載體，按照瓊脂球或纖維素球重量(克)∶1M氫氧化鈉體積(毫升)∶環(huán)氧氯丙烷體積(毫升)＝1∶2-4∶1-2的比例，向載體中加入氫氧化鈉和環(huán)氧氯丙烷，將其置入25-28℃恒溫?fù)u床中，振蕩反應(yīng)2小時(shí)，用蒸餾水淋洗凈；(2)偶聯(lián)配基按照載體重量∶L-色氨酸pH8.5-11的碳酸鹽飽和溶液體積＝1∶1.5-4的比例，置反應(yīng)器中混合并于25-37℃搖床振蕩反應(yīng)18-24小時(shí)，停止反應(yīng)后用蒸餾水淋洗凈，測(cè)定反應(yīng)前L-色氨酸飽和溶液及淋洗液L-色氨酸含量，計(jì)算載體L-色氨酸的固定率；(3)用乙醇胺或氫氧化鈉溶液封閉未結(jié)合配基的載體上的環(huán)氧基團(tuán)；(4)以壓力1kg/cm2，時(shí)間20分鐘高壓滅菌。
一種全血灌流吸附治療用吸附劑的用途，它是用于臨床全血灌流治療自身免疫性疾病，吸附患者血液中的致病免疫球蛋白G。其中可用于全血灌流治療重癥肌無力，吸附患者血液中的乙酰膽堿受體抗體。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明是一種安全、有效、造價(jià)低適于全血灌流治療的吸附劑，它制備方法簡(jiǎn)單，材料來源廣泛，生產(chǎn)成本低，血液相容性好。在本發(fā)明的應(yīng)用中，由于以色氨酸為配基的吸附劑在吸附治療中的吸附機(jī)制在于其疏水作用力，而一些自身免疫性疾病，如MG、多發(fā)性硬化、急性感染性多發(fā)性神經(jīng)炎、慢性感染性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)根神經(jīng)病等其致病主要抗體均為免疫球蛋白G，IgG上疏水基團(tuán)較多。所以，以球形纖維素或瓊脂凝膠為載體色氨酸為配基的吸附劑可通過其疏水力在這些疾病的治療中發(fā)揮作用。尤其是吸附劑對(duì)MG患者體內(nèi)乙酰膽堿受體抗體具有較高的親和吸附能力，在MG的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。
應(yīng)用球形纖維素或瓊脂凝膠為載體色氨酸為配基的吸附劑，進(jìn)行血液相容性和療效觀察取得了滿意的結(jié)果本發(fā)明用于健康家兔，驗(yàn)證其血液相容性；用于MG動(dòng)物模型驗(yàn)證其治療效果。
1，吸附劑血液相容性觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果是灌流治療后血細(xì)胞、電解質(zhì)沒有明顯變化。以球形纖維素為載體的吸附劑白蛋白損失率為3.1％，球蛋白損失率為23.9％。以瓊脂凝膠為載體的吸附劑白蛋白損失率為4.8％，球蛋白損失率為26.9％。因此，以球形纖維素或瓊脂凝膠為載體色氨酸為配基吸附劑具有較好的血液相容性。
2，吸附劑與乙酰膽堿受體抗體陽(yáng)性重癥肌無力病人血清體外靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是靜態(tài)吸附2小時(shí)，以球形纖維素為載體色氨酸為配基吸附劑對(duì)乙酰膽堿受體抗體吸附率為44.79％，以瓊脂凝膠為載體色氨酸為配基吸附劑對(duì)乙酰膽堿受體抗體吸附率為34.53％。因此，以球形纖維素或瓊脂凝膠為載體色氨酸為配基吸附劑對(duì)乙酰膽堿受體抗體有較高的吸附能力。
3.吸附劑全血灌流親和吸附治療MG模型動(dòng)物的觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一次治療2小時(shí)，抗體最大吸附率為46.84±3.17％。臨床無力癥狀明顯改善，重復(fù)神經(jīng)電刺激實(shí)驗(yàn)復(fù)合動(dòng)作電位衰減率從25.88±5.97(3Hz)、26.88±7.44(5Hz)和29.38±6.98(10Hz)恢復(fù)到18.63±4.90(P＜0.05)、20.13±7.51和21.38±8.57；單纖維肌電圖平均顫抖值也從23.00±3.87(3Hz)、27.25±3.53(5Hz)和30.88±4.73(10Hz)明顯地減少到16.38±3.12(P＜0.05)、19.25±3.86(P＜0.05)和22.38±4.92(P＜0.05)。因此，以球形纖維素為載體色氨酸為配基的吸附劑能有效清除MG體內(nèi)致病抗體，并相應(yīng)改善臨床癥狀，提高神經(jīng)肌肉電傳導(dǎo)功能。
1-4-1.按照球形纖維素載體重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸鹽飽和溶液體積＝1∶2的比例置反應(yīng)器中混合并于37℃搖床振蕩反應(yīng)18小時(shí)。停止反應(yīng)后用蒸餾水淋洗致未結(jié)合的氨基酸洗凈(270nm光密度＜0.02)。計(jì)算L-色氨酸固定量為47.1％。
1-4-2.按照球形纖維素載體重量∶L-色氨酸pH11的碳酸鹽飽和溶液體積＝1∶2的比例置反應(yīng)器中混合并于37℃搖床振蕩反應(yīng)18小時(shí)。停止反應(yīng)后用蒸餾水淋洗致未結(jié)合的氨基酸洗凈(270nm光密度＜0.02)。計(jì)算L-色氨酸固定量為49％。
1-4-3.按照球形纖維素載體重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸鹽飽和溶液體積＝1∶2的比例置反應(yīng)器中混合并于37℃搖床振蕩反應(yīng)20小時(shí)。停止反應(yīng)后用蒸餾水淋洗致未結(jié)合的氨基酸洗凈(270nm光密度＜0.02)。計(jì)算L-色氨酸固定量為47.8％。
1-4-4.按照瓊脂凝膠載體重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸鹽飽和溶液體積＝1∶2的比例置反應(yīng)器中混合并于37℃搖床振蕩反應(yīng)18小時(shí)。停止反應(yīng)后用蒸餾水淋洗致未結(jié)合的氨基酸洗凈(270nm光密度＜0.02)。計(jì)算L-色氨酸固定量為38.7％。
1-4-5.按照瓊脂凝膠載體重量∶L-色氨酸pH11的碳酸鹽飽和溶液體積＝1∶2的比例置反應(yīng)器中混合并于37℃搖床振蕩反應(yīng)24小時(shí)。停止反應(yīng)后用蒸餾水淋洗致未結(jié)合的氨基酸洗凈(270nm光密度＜0.02)。計(jì)算L-色氨酸固定量為42.5％。
1-4-6按照瓊脂凝膠載體重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸鹽飽和溶液體積＝1∶2的比例置反應(yīng)器中混合并于37℃搖床振蕩反應(yīng)20小時(shí)。實(shí)施例1.吸附劑制備1-1制備球形纖維素載體(1)制備堿化精制棉將19％氫氧化鈉溶液800ml倒入100克精制棉中，使棉花完全浸沒于氫氧化鈉溶液中，室溫靜置堿化2小時(shí)，擠去堿液，將堿化后的棉花稱重(365克)并置于2500ml錐型瓶中，25℃恒溫密閉老化三天。
(2)制備纖維素黃原酸酯粘膠液向已老化的精制棉中加入50ml二硫化碳，充分混勻后密封，于28℃水浴中靜置5小時(shí)至棉花纖維呈橙紅色，向其加入6％氫氧化鈉溶液885ml，充分混勻后于28℃水浴搖床振蕩反應(yīng)5小時(shí)至棉花呈晶亮橙紅色的粘膠狀的黃原酸酯。室溫存放。
(3)制備球形纖維素載體將裝有電子繼電器和電動(dòng)攪拌器的500ml三頸瓶置于水浴鍋中，并向其中加入氯苯360ml，四氯化碳60ml，油酸鉀0.7克，電子繼電器維持水浴溫度25℃，低速攪拌至油酸鉀完全溶解，向其中緩慢加入120ml黃原酸酯粘膠液，調(diào)整攪拌速度至粘膠液分散成大小適宜的液滴，繼續(xù)攪拌約30分鐘，待液滴分散均勻后，緩慢升高水浴溫度(2℃/分鐘)至90℃，繼續(xù)原速度攪拌2小時(shí)使液滴固化，撤去水浴，攪拌下使其自然冷卻，傾倒出上層有機(jī)溶劑，用大量自來水沖洗合成的載體至無氯苯氣味，再用蒸餾水淋洗數(shù)次，篩選20-40目球形纖維素，4℃濕態(tài)保存。1-2制備6％瓊脂凝膠載體將裝有電子繼電器和電動(dòng)攪拌器的500ml三頸瓶置于60℃水浴鍋中，并向其中加入甲苯145ml，三氯甲烷55ml，2ml吐溫80，攪拌均勻并保溫。將裝有6％瓊脂混懸液的錐型瓶置高壓滅菌鍋中，1kg/cm2高壓20分鐘，使瓊脂溶化成棕黃色的粘稠液體，將溶化后的瓊脂溶液緩慢倒入三頸瓶中，調(diào)整攪拌速度使瓊脂溶液在甲苯和三氯甲烷中分散成大小適宜的液滴。待分散均勻后撤去水浴，繼續(xù)攪拌至反應(yīng)體系自然冷卻。傾倒出上層有機(jī)溶劑，用大量自來水沖洗瓊脂球，篩選20-40目球體，用蒸餾水反復(fù)淋洗，4℃濕態(tài)保存。1-3吸附劑載體的活化抽濾瓶抽干蒸餾水反復(fù)沖洗后的載體，按照瓊脂球或纖維素球重量∶1M氫氧化鈉體積∶環(huán)氧氯丙烷體積＝1∶2∶1的比例，向裝有載體的錐型瓶中加入氫氧化鈉和環(huán)氧氯丙烷，將錐型瓶置入25℃恒溫?fù)u床中，振蕩反應(yīng)2小時(shí)，用蒸餾水淋洗。1-4偶聯(lián)配基使L-色氨酸固定量在35-50％范圍。
1-4-1.按照球形纖維素載體重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸鹽飽和溶液體積＝1∶2的比例置反應(yīng)器中混合并于37℃搖床振蕩反應(yīng)18小時(shí)。停止反應(yīng)后用蒸餾水淋洗致未結(jié)合的氨基酸洗凈(270nm光密度＜0.02)。計(jì)算L-色氨酸固定量為47.1％。
1-4-2.按照球形纖維素載體重量∶L-色氨酸pH11的碳酸鹽飽和溶液體積＝1∶2的比例置反應(yīng)器中混合并于37℃搖床振蕩反應(yīng)18小時(shí)。停止反應(yīng)后用蒸餾水淋洗致未結(jié)合的氨基酸洗凈(270nm光密度＜0.02)。計(jì)算L-色氨酸固定量為49％。
1-4-3.按照球形纖維素載體重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸鹽飽和溶液體積＝1∶2的比例置反應(yīng)器中混合并于37℃搖床振蕩反應(yīng)20小時(shí)。停止反應(yīng)后用蒸餾水淋洗致未結(jié)合的氨基酸洗凈(270nm光密度＜0.02)。計(jì)算L-色氨酸固定量為47.8％。
1-4-4.按照瓊脂凝膠載體重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸鹽飽和溶液體積＝1∶2的比例置反應(yīng)器中混合并于37℃搖床振蕩反應(yīng)18小時(shí)。停止反應(yīng)后用蒸餾水淋洗致未結(jié)合的氨基酸洗凈(270nm光密度＜0.02)。計(jì)算L-色氨酸固定量為38.7％。
1-4-5.按照瓊脂凝膠載體重量∶L-色氨酸pH11的碳酸鹽飽和溶液體積＝1∶2的比例置反應(yīng)器中混合并于37℃搖床振蕩反應(yīng)24小時(shí)。停止反應(yīng)后用蒸餾水淋洗致未結(jié)合的氨基酸洗凈(270nm光密度＜0.02)。計(jì)算L-色氨酸固定量為42.5％。
1-4-6.按照瓊脂凝膠載體重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸鹽飽和溶液體積＝1∶2的比例置反應(yīng)器中混合并于37℃搖床振蕩反應(yīng)20小時(shí)。停止反應(yīng)后用蒸餾水淋洗致未結(jié)合的氨基酸洗凈(270nm光密度＜0.02)。計(jì)算L-色氨酸固定量為41.6％。1-5未結(jié)合配基載體環(huán)氧基團(tuán)的封閉將與配基反應(yīng)后的帶有環(huán)氧基團(tuán)的載體與2倍體積的pH9.0的1M乙醇胺溶液室溫下振蕩反應(yīng)6小時(shí)，停止反應(yīng)后在垂凝漏斗中用大量蒸餾水、生理鹽水淋洗至洗脫液pH值為中性。1-6高壓滅菌將吸附劑置高壓滅菌鍋滅菌，壓力1kg/cm2，時(shí)間20分鐘。1-7滅菌后的吸附劑濕態(tài)低溫(4℃)保存。
權(quán)利要求
1一種全血灌流吸附治療用吸附劑，其特征在于吸附劑以纖維素或瓊脂為載體以L-色氨酸為配基制成。
2按照權(quán)利要求1所述的吸附劑，其特征在于所說的纖維素或瓊脂為20-40目球形。
3一種專用于制備權(quán)利要求1全血灌流吸附治療用吸附劑的方法，其特征在于經(jīng)過以下步驟制備(1)吸附劑載體的活化用抽濾瓶抽干蒸餾水反復(fù)沖洗后的載體，按照瓊脂球或纖維素球重量(克)∶1M氫氧化鈉體積(毫升)∶環(huán)氧氯丙烷體積(毫升)＝1∶2-4∶1-2的比例，向載體中加入氫氧化鈉和環(huán)氧氯丙烷，將其置入25-28℃恒溫?fù)u床中，振蕩反應(yīng)2小時(shí)，用蒸餾水淋洗凈；(2)偶聯(lián)配基按照載體重量∶L-色氨酸pH8.5-11的碳酸鹽飽和溶液體積＝1∶1.5-4的比例，置反應(yīng)器中混合并于25-37℃搖床振蕩反應(yīng)18-24小時(shí)，停止反應(yīng)后用蒸餾水淋洗凈，測(cè)定反應(yīng)前L-色氨酸飽和溶液及淋洗液L-色氨酸含量，計(jì)算載體L-色氨酸的固定率；(3)用乙醇胺或氫氧化鈉溶液封閉未結(jié)合配基的載體上的環(huán)氧基團(tuán)；(4)以壓力1kg/cm2，時(shí)間20分鐘高壓滅菌。
4一種權(quán)利要求1全血灌流吸附治療用吸附劑的用途，其特征在于用于臨床全血灌流治療自身免疫性疾病，吸附患者血液中的致病免疫球蛋白G。
5按照權(quán)利要求4所述的吸附劑的用途，其特征在于用于臨床全血灌流治療重癥肌無力，吸附患者血液中的乙酰膽堿受體抗體。
全文摘要
本發(fā)明是一種全血灌流吸附治療用吸附劑，一種制備該吸附劑的方法，以及該吸附劑的用途。這種吸附劑以纖維素或瓊脂為載體以L－色氨酸為配基制成，用于臨床全血灌流治療重癥肌無力，吸附患者血液中的乙酰膽堿受體抗體。本發(fā)明安全、有效、造價(jià)低、適于全血灌流吸附治療。吸附劑制備方法簡(jiǎn)單，材料來源廣泛，生產(chǎn)成本低。在神經(jīng)內(nèi)科MG的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。尤其是吸附劑對(duì)MG患者體內(nèi)乙酰膽堿受體抗體具有較高的親和吸附能力，而又較少破壞患者血液內(nèi)的有形成分和血漿中的有益物質(zhì)，且有良好的血液相容性。另外還可以在治療神經(jīng)內(nèi)科其他自身免疫性疾病，如多發(fā)性硬化、急性感染性多發(fā)性神經(jīng)炎、慢性感染性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)根神經(jīng)病中發(fā)揮作用。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1408442SQ02129389
公開日2003年4月9日 申請(qǐng)日期2002年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月9日
發(fā)明者楊麗, 程焱, 只達(dá)石, 俞耀庭, 周廣喜 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院, 南開大學(xué)