專利名稱：轉(zhuǎn)移化合物,其生產(chǎn)及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠?qū)⑾嚓P(guān)化合物質(zhì)引入細(xì)胞的化合物，尤其是涉及一種包含有Ki-67蛋白的羧基末端片段的轉(zhuǎn)移化合物，而且本申請(qǐng)還包括含有編碼該轉(zhuǎn)移化合物的序列的載體，轉(zhuǎn)移化合物，及含有所述轉(zhuǎn)移化合物和\或載體的藥物組合物。同樣還要求保護(hù)所述轉(zhuǎn)移組合物的生產(chǎn)方法及其使用，使用所述轉(zhuǎn)移化合物通過基因治療對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)防或治療的相應(yīng)方法也在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
現(xiàn)有技術(shù)蛋白質(zhì)的靶向過程是一項(xiàng)非常重要的生物學(xué)過程，其是通過很高的協(xié)調(diào)機(jī)理進(jìn)行控制的。
這樣蛋白輸出或分泌是通過特定的反應(yīng)途徑進(jìn)行的，其中具有一定特征的信號(hào)序列被用于導(dǎo)向蛋白進(jìn)入到所涉及到的亞細(xì)胞區(qū)室例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基復(fù)合體及囊泡中去。信號(hào)序列同樣被用于進(jìn)行胞內(nèi)轉(zhuǎn)移。例如，核定位序列(NLS)已被描述可用于將蛋白轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核中去；這些核定位序列引導(dǎo)不能通過擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞核中去的大蛋白通過細(xì)胞核孔進(jìn)入細(xì)胞核。
細(xì)胞內(nèi)蛋白的攝入是通過很復(fù)雜的方式進(jìn)行控制的。這兒給出的一個(gè)例子是受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，其通過結(jié)合于細(xì)胞膜上的受體來進(jìn)行特定的蛋白的輸入然后包含在囊泡中。這個(gè)過程，一方面提供以細(xì)胞新陳代謝所需要的代謝物，另一方面來降解蛋白。更進(jìn)一步，受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)許多調(diào)節(jié)因子，例如肽激素或生長(zhǎng)因子的細(xì)胞應(yīng)答。最后，所述過程為病毒所利用且毒素進(jìn)入細(xì)胞。
對(duì)于許多生物醫(yī)學(xué)研究，診斷和治療中非常渴望將物質(zhì)尤其是蛋白，核酸，非肽分子例如低聚糖，脂類或藥劑或標(biāo)記分子引入細(xì)胞中。既然上述許多物質(zhì)并不能夠通過細(xì)胞膜，許多方法都被用來分別引入上述物質(zhì)及其胞內(nèi)生產(chǎn)。
除了例如顯微注射等機(jī)械方法以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)非常清楚用于此目的的分子生物學(xué)技術(shù)，例如表達(dá)技術(shù)。然而，最后所提到的方法不是非常有效；一般說來只能在2-20％的細(xì)胞內(nèi)成功獲得表達(dá)，這使得體內(nèi)應(yīng)用是非常困難的。這一困難最近已通過使用一單純皰疹病毒I型(HSV-1)的結(jié)構(gòu)蛋白(VP22)所克服。經(jīng)過使用表達(dá)載體進(jìn)行傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)，與另一HSV-1蛋白(其如所料僅在2-5％的細(xì)胞中檢測(cè)到)相比較，VP22能在100％的細(xì)胞中檢測(cè)到(PCT申請(qǐng)?zhí)?WO97/05265)。更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，所述病毒蛋白作為融合蛋白可以將不同多肽引入靶細(xì)胞群體(WO 97/05265)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全清楚，病毒蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，細(xì)胞集合和整個(gè)生物體中可以分別引發(fā)多效性反應(yīng)。
例如，腺病毒E1A蛋白以及猿猴病毒40(SV40)的T抗原可以在細(xì)胞中引發(fā)多重反應(yīng)。這些包括，例如DNA合成的起始和各種酶的激活，例如二氫葉酸還原酶，胸苷激酶及DNA聚合酶(Nevins，J.R.腺病毒EIA細(xì)胞生長(zhǎng)控制的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和改變，Doerfier，W.和Bohm，P.，腺病毒Ill的分子庫(kù)生物學(xué)和病理學(xué)，SpringerVerlag Berlin，Heidelberg，紐約，1995)。進(jìn)一步的實(shí)施例是呼腸孤病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的多效性特征(Yue，Z.and Shatkin，A.J.，呼腸孤病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的酶促和控制功能，Tyler，K.L.和Oldstone，M.B.A.，呼腸孤病毒I結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)，和遺傳學(xué)，Springer Verlag Berim，Heidelberg，紐約，1998)。
因此本發(fā)明的目的是提供一轉(zhuǎn)移化合物的轉(zhuǎn)移載體以克服現(xiàn)有的技術(shù)障礙，該轉(zhuǎn)移化合物可用于進(jìn)行基因治療。
本發(fā)明所述轉(zhuǎn)移載體可以來自于哺乳動(dòng)物，最好是來自于人類。
發(fā)明概述本發(fā)明目的可以通過人類Ki-67蛋白的羧基末端片段實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的另一方面涉及編碼所述片段的載體。
進(jìn)一步描述的是含有Ki-67蛋白的羧基末端片段的轉(zhuǎn)移蛋白。
如本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)移蛋白可以是人類，小鼠，大鼠或其他物種的Ki-67蛋白的羧基末端片段。
更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)移化合物的方法及生產(chǎn)編碼所述轉(zhuǎn)移化合物的載體的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步描述的是在本發(fā)明上述轉(zhuǎn)移蛋白的幫助下或者在本發(fā)明含有編碼轉(zhuǎn)移蛋白的序列的載體的幫助下轉(zhuǎn)移化合物進(jìn)入選自細(xì)胞系，體外細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞，組織等的目標(biāo)組的方法。
更進(jìn)一步，本發(fā)明還包括上述化合物在轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)化合物中的應(yīng)用及治療和預(yù)防疾病的方法，尤其是用于基因治療。
本發(fā)明另外還提供了一種僅僅含有本發(fā)明轉(zhuǎn)移蛋白或與另外的化合物結(jié)合的藥物組合物及其生產(chǎn)方法。


圖1表示Kon2 1-DNA插入物的核苷酸序列。在該核苷酸序列上標(biāo)有堿基對(duì)的編號(hào)及用于克隆的限制性位點(diǎn)。所衍生的Kon21蛋白的氨基酸序列顯示于該核苷酸序列下面。以粗體顯示的核苷酸為所用到的限制性位點(diǎn)部分，下劃線核苷酸通過所用脫氧寡聚核苷酸引物被引入到構(gòu)建體中去。為了更清楚地展示，以5’-3’方向給出了雙鏈DNA中的僅一條鏈。
圖2所用到的載體pCEP4-Kon21的圖譜。
圖3轉(zhuǎn)染后6小時(shí)(a-d)，10小時(shí)(e-h)及24小時(shí)(i-l)細(xì)胞的顯微圖；測(cè)試條件如實(shí)施例1所示.。使用MIB-21(a，e，i，c，g，k)染色及碘化丙錠(b，f，j，d，h，l)進(jìn)行復(fù)染色。圖譜左半部分的細(xì)胞使用pCEP4-Kon21(a，b，e，f，i，j)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，右半部分的細(xì)胞使用pCEP4(c，d，g，h，k，l)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
圖4加入高鹽溶解產(chǎn)物后5分鐘(a-d)及1小時(shí)(e-h)的細(xì)胞顯微圖譜，參見實(shí)施例2。圖譜左半部分的細(xì)胞使用MIB21(a，c，e，g)進(jìn)行染色.。圖譜右半部分顯示出使用碘化丙錠(b，d，f，h)進(jìn)行復(fù)染色的相同細(xì)胞。圖譜上半部分顯示出使用高鹽溶解產(chǎn)物孵育5分鐘后的細(xì)胞(a-d)，下半部分顯示出孵育一小時(shí)后的細(xì)胞(e-h)。pCEP4-Kon21轉(zhuǎn)染細(xì)胞高鹽溶解產(chǎn)物加入后的細(xì)胞(a，b，e，f)及pCEP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞高鹽溶解產(chǎn)物加入后的細(xì)胞(c，d，g，h)。
發(fā)明詳述按照本發(fā)明的片段，所謂Ki-67蛋白的羧基末端區(qū)域。含有Ki-67蛋白的從氨基酸第3037位到第3256位的區(qū)域。其已登記在蛋白質(zhì)序列資料庫(kù)(Swiss Prot)保藏號(hào)為P46013，或者該區(qū)域的片段，其因?yàn)榛蚪M的自然變異而存在。此外，該片段可能僅僅包含上述片段或其同源物的部分，條件是維持了作為轉(zhuǎn)移蛋白的功能。
同源物在這種情況下意味著與羧基末端區(qū)域作為轉(zhuǎn)移化合物的功能所必須的氨基酸殘基至少有80％的同源性。
人類Ki-67蛋白在細(xì)胞周期的所有活性階段，即在G1，S，G2及有絲分裂期的增殖細(xì)胞的核中都有表達(dá)，但不在靜止的GO細(xì)胞期表達(dá)(Gerdes等人，由單克隆抗體K-67定義的細(xì)胞增殖相關(guān)的人核抗原的細(xì)胞周期分析，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1331710-15，1984)。人類K-67的cDNA及鼠類的等同物是已知，且與其它的蛋白沒有顯示出明顯的同源性(Schluter等人，抗體Ki-67的細(xì)胞增殖相關(guān)的抗原具有巨大重復(fù)元件的非常大的遍在核蛋白，代表新的一類細(xì)胞周期維持蛋白，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Bid.)123513-522，1993，Starborg等人。鼠k-67細(xì)胞增殖抗原在細(xì)胞周期進(jìn)程必要的過程中的有絲分裂染色體的pedphery和中期細(xì)胞的核和heterochromatic區(qū)域的積累，細(xì)胞科學(xué)雜志(J.CellSci.)109143-153，1996)。人類Ki67蛋白具有好幾個(gè)NLS，且僅在細(xì)胞核中可以被生理學(xué)上檢測(cè)到，而在細(xì)胞有絲分裂期間除外。在抗體的顯微注射后，僅可以證實(shí)Ki-67蛋白是在細(xì)胞質(zhì)中形成的，且可能以超分子復(fù)合體形式迅速轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞核中(Heyden等人，Ki-67蛋白質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)觀察和其運(yùn)輸?shù)胶说拿庖邿晒馊旧?，歐洲細(xì)胞生物學(xué)雜志(Eur.J.Cell.Biol.)Vol 4233，1996)。迄今為止并未發(fā)現(xiàn)有關(guān)從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移出或從細(xì)胞轉(zhuǎn)移出等現(xiàn)象或有過類似的描述。因此，當(dāng)測(cè)試Ki-67蛋白部分結(jié)構(gòu)的功能時(shí)獲得的發(fā)現(xiàn)是令人吃驚的。
在CHO-K1(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢-K1，ATTC No.CRL 9618)細(xì)胞系細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的人類Ki-67蛋白羧基末端片段，(其被稱為KON-21，圖1)，其所產(chǎn)生多肽顯示出完全意想不到的免疫細(xì)胞學(xué)分布模式。正如所料那樣，在5-20％的細(xì)胞中，KON-21有很強(qiáng)的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，其與對(duì)照蛋白一樣。然而，KON-21同樣在100％的細(xì)胞核中檢測(cè)到。其可以證明Kon-21肽首先在5-20％細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生，而且，既然其含有NLS，就可以迅速轉(zhuǎn)移進(jìn)入這樣的生產(chǎn)者細(xì)胞的細(xì)胞核中去(實(shí)施例1及圖3)。而且，KON-21被傳遞進(jìn)入鄰近的非轉(zhuǎn)染細(xì)胞且定位在所述受體細(xì)胞的細(xì)胞核中。這種KON-21的胞間轉(zhuǎn)移可能與上述的傳統(tǒng)的蛋白輸入輸出途徑大相徑庭，因?yàn)镵ON-21根本沒有經(jīng)典的信號(hào)序列用于此過程。這種進(jìn)入細(xì)胞核的胞內(nèi)轉(zhuǎn)移很可能是通過Ran-GTP-importin-alpha系統(tǒng)(Goerlich D.運(yùn)進(jìn)和運(yùn)出細(xì)胞核EMBO J.VoL172721-27 1998)在KON-21的NLS的幫助下完成的。
使用編碼具有KON-21蛋白的融合蛋白的構(gòu)建體的實(shí)驗(yàn)證明，所述融合蛋白可以有效表達(dá)且在胞間轉(zhuǎn)移。
在將細(xì)胞提取物中的KON-21被加入到靶細(xì)胞的培養(yǎng)基中的實(shí)驗(yàn)中，KON-21單獨(dú)或與融合蛋白一起可以通過非常高效、非常迅速的途徑轉(zhuǎn)移進(jìn)入靶細(xì)胞(實(shí)施例2及圖4)。該特征進(jìn)一步使得可以實(shí)現(xiàn)不能進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)的非肽物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。
上述特征使所述轉(zhuǎn)移化合物用于疾病例如癌癥，過敏癥，自身免疫性疾病等的基因治療成為可能。這意味著本發(fā)明同樣包括治療及預(yù)防疾病的方法。
Kon21-DNA構(gòu)建體使用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行制備。為此，通過PCR技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞系HeLa S3的cDNA擴(kuò)增。用于隨后克隆進(jìn)入質(zhì)粒載體的限制性位點(diǎn)，以及為mRNA有效翻譯所必需的序列基序通過使用在其5’末端攜帶另外的核苷酸序列的脫氧寡核苷酸引物進(jìn)行引入(參見圖1)。Kon21-DNA構(gòu)建體首先被克隆進(jìn)入Stratagene公司(La Jolla，Ca，USA)的克隆載體pBluescript SK。插入物DNA的測(cè)序獲知與已經(jīng)公開的Ki-67 cDNA的DNA序列(Schluter等人，見上文)有兩個(gè)差異。獨(dú)立的幾個(gè)克隆序列分析證實(shí)了所獲得序列的正確性。為了表達(dá)，插入物DNA被限制性內(nèi)切酶HindlIl及Notl從克隆載體中切割出來，并被克隆進(jìn)入Invitrogen公司(Carlsbad，CA，USA)的真核表達(dá)載體pCEP4。圖1顯示的是DNA插入物的完整的核苷酸序列以及由此編碼的表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列。圖2是以圖表法顯示KON21表達(dá)構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例1轉(zhuǎn)染后Kon21蛋白被運(yùn)輸進(jìn)入所有的培養(yǎng)細(xì)胞CHO細(xì)胞使用構(gòu)建體pCEP4-Kon21進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染且在不同時(shí)間進(jìn)行分析。為此，將有所述細(xì)胞生長(zhǎng)其上的載片用PBS/10％ FCS進(jìn)行浸洗，風(fēng)干大約6小時(shí)，然后使用氯仿/丙酮進(jìn)行固定。接下來使用單克隆抗體MIB-21進(jìn)行免疫熒光染色，該抗體可以特定識(shí)別KON-21蛋白。然后使用Alexa488綴合山羊抗小鼠抗體(Molecular Probes Inc.，Eugene，Oregon，USA)檢測(cè)抗體MIB-21的結(jié)合。為了更好地定向，細(xì)胞DNA此外又進(jìn)行碘化丙錠的復(fù)染色。作為染色對(duì)照，CHO細(xì)胞同樣使用表達(dá)載體pCEP4進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6小時(shí)(a-d)，10小時(shí)(e-h)及24小時(shí)(i-l)細(xì)胞的顯微圖譜。使用MIB-21(a，e，i c，g，k)進(jìn)行染色及使用碘化丙錠(b，f，j，d，h，l)進(jìn)行復(fù)染色。圖譜左半部分的細(xì)胞使用pCEP4-Kon21進(jìn)行了轉(zhuǎn)染(a，b，e，f，i，j)，而右半部分的細(xì)胞使用pCEP4進(jìn)行了轉(zhuǎn)染(c，d，g，h，k，l)。6小時(shí)后僅有一部分pCEP4-Kon21轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核顯示出其被MIB-21稍微染色，10小時(shí)后染色增加，24小時(shí)后所有的細(xì)胞核都已被MIB-21所染色。相反，作為對(duì)照的細(xì)胞是使用pCEP4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其僅在整個(gè)試驗(yàn)期間顯示出很弱的非特異性背景染色。
實(shí)施例2加入到培養(yǎng)基后，KON-21蛋白被所有培養(yǎng)物細(xì)胞所攝取。
大約500,000個(gè)CHO細(xì)胞使用構(gòu)建體pCEP4-Kon21進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。作為對(duì)照目的，500,000個(gè)CHO細(xì)胞同樣使用表達(dá)載體pCEP4進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在培養(yǎng)器中培養(yǎng)24小時(shí)后收獲細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行沉降，細(xì)胞沉淀物在-70℃下進(jìn)行冷凍。解凍后細(xì)胞沉淀物在500μl冰冷高鹽緩沖液(10mM HEPES，pH7.9，400mM NaCl，0.1mM EDTA，0.5mM DTT，5％甘油)中進(jìn)行重懸浮，然后在0℃下孵育5分鐘后再次沉淀。上清液加入到15ml培養(yǎng)基的CHO細(xì)胞中去，然后分析不同時(shí)間的細(xì)胞。然后將生長(zhǎng)有細(xì)胞的載片使用PBS/10％ FCS進(jìn)行浸洗，風(fēng)干大約6小時(shí)，然后使用氯仿/丙酮進(jìn)行固定。接下來使用單克隆抗體MIB-21進(jìn)行免疫熒光染色，其可以特異性識(shí)別KON-21蛋白。然后使用Alexa488綴合山羊抗小鼠抗體(Molecular Probes Inc.，Eugene，Oregon，USA)檢測(cè)抗體MIB-21的結(jié)合。為了更好地定位，細(xì)胞DNA又進(jìn)行碘化丙錠的復(fù)染色。加入高鹽溶解產(chǎn)物后5分鐘(a-d)及1小時(shí)(e-h)后細(xì)胞的顯微圖譜。圖譜左半部分的細(xì)胞使用MIB-21染色(a，c，e.，g).圖譜右半部分顯示出使用碘化丙錠進(jìn)行復(fù)染色(b，d，f，h)后的相同細(xì)胞。圖譜上半部分顯示出使用高鹽溶解產(chǎn)物孵育5分鐘后的細(xì)胞(a-d)，下半部分顯示出一小時(shí)后的細(xì)胞(e-h)。分別加入來自于pCEP4-Kon21轉(zhuǎn)染細(xì)胞高鹽溶解產(chǎn)物(a，b，e，f)及來自于pCEP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞高鹽溶解產(chǎn)物(c，d，g，h)后的細(xì)胞。來自pCEP4-Kon21轉(zhuǎn)染細(xì)胞的高鹽溶解產(chǎn)物加入以后，在5分鐘后檢測(cè)到MIB-21微弱染色的細(xì)胞核，1小時(shí)后所有的細(xì)胞核顯示出很強(qiáng)的MIB-21染色。相反，與來自pCEP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞的高鹽溶解產(chǎn)物一起孵育的細(xì)胞積顯示出很微弱的非特異性背景染色。
序列表<110>Forschungszentrum Borstel<120>轉(zhuǎn)移化合物，其生產(chǎn)及用途<130>84528m3<140><141><150>DE199 55 576.1<151>1999-11-18<160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>733<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述，含有Ki-67蛋白編碼序列的一部分和限制性位點(diǎn)的Kon21-DNA插入子<400>1aagcttgata tcgaattcct gcagcccggg ggatccagca ttccggtact gttggtaaaa 60tggcaagagg caaatcatcc gaacccgtgg tcatcatgaa gagaagtttg aggacttctg 120caaaaagaat tgaacctgcg gaagagctga acagcaacga catgaaaacc aacaaagagg 180aacacaaatt acaagactcg gtccctgaaa ataagggaat atccctgcgc tccagacgcc 240aagataagac tgaggcagaa cagcaaataa ctgaggtctt tgtattagca gaaagaatag 300aaataaacag aaatgaaaag aagcccatga agacctcccc agagatggac attcagaatc 360cagatgatgg agcccggaaa cccataccta gagacaaagt cactgagaac aaaaggtgct 420tgaggtctgc tagacagaat gagagctccc agcctaaggt ggcagaggag agcggagggc 480agaagagtgc gaaggttctc atgcagaatc agaaagggaa aggagaagca ggaaattcag 540actccatgtg cctgagatca agaaagacaa aaagccagcc tgcagcaagc actttggaga 600gcaaatctgt gcagagagta acgcggagtg tcaagaggtg tgcagaaaat ccaaagaagg 660ctgaggacaa tgtgtgtgtc aagaaaataa gaaccagaag tcatagggac agtgaagata 720tttgagcggc cgc73權(quán)利要求
1.Ki-67蛋白的羧基末端片段或其活性部分，其片段或其同源物作為適于轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞及為細(xì)胞所攝取或釋放的化合物的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述羧基末端片段含有Swiss Prot入藏號(hào)No.P46013所示Ki-67蛋白序列的第3037位至3256位的氨基酸，或其同源序列。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述羧基末端片段，其活性部分，片段或同源物與希望被轉(zhuǎn)移進(jìn)入靶細(xì)胞的第二或幾個(gè)組分相連接。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述另外的組分是肽或非肽。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的用途，其中將與一或多種另外的組份相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)移化合物加入細(xì)胞的靶群體中，并被靶群體所攝取。
6.如權(quán)利要求1-4所述的用途，其中將與一或多種另外的組份相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)移化合物從含有或任選地產(chǎn)生所述化合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入另一細(xì)胞且為所述細(xì)胞所攝取。
7.含有與一或多種待轉(zhuǎn)移的另外的組份相組合的Ki-67蛋白羧基末端，其活性部分，片段或同源物的轉(zhuǎn)移蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)移蛋白，其中所述另外的組分包括肽及非肽。
9.如權(quán)利要求7或8所述的轉(zhuǎn)移蛋白，其中轉(zhuǎn)移蛋白由第一細(xì)胞所產(chǎn)生，且為另一本身并不產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)移蛋白的細(xì)胞所攝取。
10.如權(quán)利要求7或8所述的轉(zhuǎn)移蛋白，其中轉(zhuǎn)移蛋白以重組方式產(chǎn)生。
11.編碼權(quán)利要求7-9所述轉(zhuǎn)移蛋白的核酸或其同源物。
12.含有權(quán)利要求11所述的核酸的載體，其允許權(quán)利要求7-9任一所述的轉(zhuǎn)移蛋白的表達(dá)。
13.如權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體，用它轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化第一細(xì)胞，然后將其產(chǎn)物轉(zhuǎn)移進(jìn)入第二/其它細(xì)胞。
14.含有權(quán)利要求12或13所述載體，權(quán)利要求11所述的核酸的真核或原核宿主細(xì)胞，它產(chǎn)生如權(quán)利要求7-10所述的轉(zhuǎn)移蛋白。
15.Ki-67蛋白的羧基末端或如權(quán)利要求7-10的轉(zhuǎn)移蛋白作為藥物組合物中活性組分的載體的用途。
16.含有權(quán)利要求7-10所述的Ki-67蛋白的羧基末端的藥物組合物作為其他藥物活性成分的載體和轉(zhuǎn)移配偶體。
17.如權(quán)利要求7-10所述的Ki-67蛋白的羧基末端用于生產(chǎn)基因治療的藥物組合物的用途。
18.將化合物轉(zhuǎn)移進(jìn)入作為靶群體的細(xì)胞群體的方法，其包含下列步驟a)將權(quán)利要求12或13的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，b)在宿主細(xì)胞中表達(dá)載體編碼的按照權(quán)利要求7至10任一所述的轉(zhuǎn)移蛋白并將其分泌，及c)將轉(zhuǎn)移蛋白轉(zhuǎn)移進(jìn)入另一細(xì)胞群體。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中表達(dá)載體通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染或者顯微注射被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。
20.在體外將化合物轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞中的方法，其中轉(zhuǎn)移蛋白被引入到靶細(xì)胞的環(huán)境內(nèi)。
21.將化合物轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞中的方法，包括以下步驟a)借助權(quán)利要求12或13所述的表達(dá)載體重組表達(dá)如權(quán)利要求7至10所述的轉(zhuǎn)移蛋白，及b)體外將靶細(xì)胞及步驟a)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移蛋白相結(jié)合，以使靶細(xì)胞攝取所述轉(zhuǎn)移蛋白。
22.疾病的治療和預(yù)防方法，其中相關(guān)聯(lián)化合物通過如權(quán)利要求7至10所述轉(zhuǎn)移蛋白或在權(quán)利要求12或13所述表達(dá)載體的幫助下被引入細(xì)胞。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于疾病是癌癥，過敏癥，自身免疫性疾病，炎癥及風(fēng)濕性疾病。
24.如權(quán)利要求7至10所述的轉(zhuǎn)移蛋白或者權(quán)利要求12或13所述的表達(dá)載體在基因治療中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及Ki－67蛋白的羧基末端片段或其活性部分,片段或其同源物作為用于胞內(nèi)轉(zhuǎn)移及為細(xì)胞攝取和分泌的化合物的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及到含有上述Ki－67蛋白的轉(zhuǎn)移化合物及編碼其的載體。本發(fā)明同樣涉及到相應(yīng)的藥物組合物及轉(zhuǎn)移蛋白作為在疾病治療中作為賦形劑或活性成分的用途。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1390257SQ00815751
公開日2003年1月8日 申請(qǐng)日期2000年11月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月18日
發(fā)明者J·格爾德斯, T·舒爾贊, C·沃倫彼爾格 申請(qǐng)人:癌癥研究有限公司