專利名稱：用于改進酵母中的多肽生產(chǎn)的表達載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在酵母中生產(chǎn)多肽的新的表達載體，被該載體轉(zhuǎn)化的酵母菌株，產(chǎn)生所述載體、所述酵母菌株和所述多肽的方法。
在用于在酵母中表達的基因工程技術(shù)中常用穿梭載體，該載體含有編碼特定多肽的核苷酸序列以及在酵母中進行所述表達所必需的序列，如酵母啟動子。該穿梭載體還含有允許在細菌(例如通常為大腸桿菌)或其它微生物中表達的序列。這種另外的非酵母序列僅對構(gòu)建載體有用。然而，它們對于在酵母中的表達是多余的。實際上，它們可妨礙多肽在酵母中的有效表達或延緩生物的復制，因為多余的核苷酸也一定會加倍，這是一個消耗能量的過程。
因其遺傳系統(tǒng)眾所周知、生長快速以及操作上的技術(shù)優(yōu)勢，通常將釀酒酵母用作生產(chǎn)同源和異源蛋白質(zhì)的極好微生物。另外，用于導入克隆基因并在簡單的發(fā)酵條件下便宜并安全地過量生產(chǎn)的DNA轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的進展使得釀酒酵母在大規(guī)模的工業(yè)實踐中特別有用。
大量酵母多肽是本領(lǐng)域中已知的。其中特別有意義的是超氧化物歧化酶。釀酒酵母含有兩種類型的超氧化物歧化酶(EC1.15.11)一種含銅/鋅-(Cu/Zn SOD)，一種含錳-(Mn SOD)。前一種(Cu/Zn SOD)位于胞質(zhì)中，而含錳酶局限于線粒體基質(zhì)中。據(jù)稱該酶可提供抗細胞內(nèi)產(chǎn)生的游離毒性基團如正常代謝的中間體的體內(nèi)保護作用(Bilinski，T.等，生物化學生物物理研究通訊，130533-539(1985)，Van Loon A.P.G.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 833820-3824(1986)，Lee F.J.等，游離基生物醫(yī)學雜志，1319-325(1985)，Galiazzo F.等，Biochim.Biophys.Acta 96546-51(1988))。因此，超氧化物歧化酶有望被用于預防或治療潛在的人體損害，尤其是因細胞老化和衰老引起的損害(Rosen D.R.等，自然362，59-62(1993)，McCord J.M.和Fridovich I.生物化學雜志2446049-6055(1969)，McCord J.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 681024-1027(1971)。McCord J.M.新英格蘭醫(yī)學雜志，312159-163(1985))。
已對釀酒酵母的Cu/Zn SOD基因進行了克隆和測序(Berming-ham-McDonogh O.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854789-4793(1988))，并深入透徹地鑒定了該酶的結(jié)構(gòu)和作用機制(DjinovicK.等，分子生物學雜志，225791-809(1992)，O’Neill P.等，生物化學雜志，25141-46(1988))。Cu/Zn SOD是大多數(shù)需氧和很多厭氧生物的胞質(zhì)中大量存在的金屬酶，其活性催化超氧化物陰離子歧化為分子氧和過氧化氫。
本發(fā)明的目的是使經(jīng)編碼多肽的表達載體轉(zhuǎn)化的酵母的發(fā)酵過程中的多肽產(chǎn)量增加。本發(fā)明的另一目的是提供能在酵母中表達所需多肽的新載體，其中相對于以前使用的方法而言，表達量有所增加。本發(fā)明的另一目的是被該載體轉(zhuǎn)化的新的酵母菌株，與野生型相比所述菌株是優(yōu)良菌株，或者是被穿梭載體轉(zhuǎn)化的酵母菌株。
本發(fā)明提供了表達載體以及被該載體轉(zhuǎn)化的酵母菌株，尤其是釀酒酵母菌株，與野生型或被穿梭載體轉(zhuǎn)化的菌株相比，所述菌株可產(chǎn)生較高水平的酵母或非酵母多肽，例如酶，如Cu/Zn超氧化物歧化酶。本發(fā)明還描述了制備這種表達載體、酵母菌株和內(nèi)源性酵母多肽的方法。
通過參照詳細描述和具體闡明本發(fā)明實際操作的本發(fā)明附圖，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難看出本發(fā)明的多個方面和優(yōu)點。
本發(fā)明中使用了下列引物DNA序列，其精確結(jié)構(gòu)示于序列表中(引物的bp區(qū)取自EMBL載體，Gene Bank登記號為J03279)SEQ ID NO1是外部引物SOD-3，上游區(qū)域81-102bp。SEQ ID NO2是外部引物SOD-2，下游區(qū)域1018-1036bp。SEQ ID NO3是內(nèi)部引物SOD-4，區(qū)域971-991bp。
以下是附圖簡述，旨在使本發(fā)明更易于被理解。


圖1概述了酵母菌株S288C的Cu/Zn SOD基因的編碼區(qū)，在SOD基因座的上游和下游區(qū)域設(shè)計了外部引物SOD3和SOD2以及內(nèi)部引物SOD4的位置。
圖2顯示了新的分子質(zhì)粒構(gòu)建體pEMBL-SOD 374，它是具有酵母Cu/Zn SOD基因的374bp上游區(qū)域，編碼序列和下游區(qū)域的質(zhì)粒pEMBLyex4，其中Cu/Zn SOD基因受酵母GAL/CYC啟動子的控制。
圖3顯示了最終的質(zhì)粒pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli的圖譜，該質(zhì)粒含有位于限制性位點EcoRI和HindII之間的酵母Cu/Zn SOD基因的374上游區(qū)域，編碼序列和下游區(qū)域，其中Cu/Zn SOD基因受酵母GAL/CYC啟動子的控制，該質(zhì)粒僅含酵母序列并僅在酵母中復制。
本發(fā)明的第一個實施方案涉及用于在酵母中生產(chǎn)多肽的新的表達載體，所述載體含有編碼所述多肽的序列，和允許所述多肽僅在酵母中表達的其它序列，所述其它序列不含任何非酵母序列。
術(shù)語“表達載體”指的是載體，尤其是DNA載體，如質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有編碼多肽的序列，與編碼序列在同一讀框內(nèi)的啟動子序列，并任選含有有效產(chǎn)生或使用載體所需的其它序列，如ori，前導序列，終止子和選擇載體所用多肽的編碼序列。所述序列僅得自酵母，并是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
編碼所述多肽的序列是酵母或非酵母序列。酵母序列是例如編碼具有酶功能的酵母多肽的序列，所述酶如抗氧化酶(如超氧化物歧化酶SOD，巰基特異性抗氧化劑TSA或細胞色素c過氧化物酶)，蛋白酶，如干酵母菌前體PRB1，蛋白酶抑制劑，如蛋白酶B抑制劑2，細胞因子等。
編碼非酵母多肽的序列可得自任何活的生物，尤其是人和動物。優(yōu)選所述多肽可用于醫(yī)學領(lǐng)域，它們包括人胰島素，組織纖溶酶原激活物，干擾素，紅細胞生成素，生長因子，如角質(zhì)形成細胞生長因子，酶，如類胰蛋白酶，C蛋白激活物，酶抑制劑，如金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP)，彈性蛋白酶抑制劑等。編碼所述有用多肽的序列是本領(lǐng)域已知的。
所有這些序列都受酵母啟動子的控制。有用的酵母啟動子是本領(lǐng)域已知的，包括如GAL/CYC啟動子。
本發(fā)明最終的載體僅可在酵母細胞中復制。除了編碼任何所需非酵母多肽的非酵母序列之外，它不含任何非酵母序列。
本發(fā)明的優(yōu)選載體是含有受GAL/CYC啟動子控制的Cu/Zn SOD基因的酵母質(zhì)粒，尤其是被稱為pEMBL-SOD，w/oMCS，w/oColi的質(zhì)粒。
此質(zhì)?？捎米鳂?gòu)建表達載體所用的起始質(zhì)粒，其中用Cu/Zn SOD基因交換編碼任何其它多肽的序列。
本發(fā)明的另一實施方案提供了產(chǎn)生上文所定義的新表達載體的方法。產(chǎn)生本發(fā)明新表達載體的方法的特征在于從能在酵母菌株中表達多肽的穿梭載體中切下任何非酵母序列，并且任選地用編碼另一多肽的序列替代編碼所述多肽的序列。
以常規(guī)方法由已知的穿梭載體，如酵母整合質(zhì)粒YIp、酵母復制質(zhì)粒YRp、酵母著絲粒質(zhì)粒YCp或酵母附加型質(zhì)粒YEp得到新表達載體，新載體被構(gòu)建為含有多肽基因且不含任何非酵母DNA序列。
起始的穿梭載體可能已含有受任何酵母啟動子如GAL/CYC啟動子控制的編碼所需多肽的序列。所述載體如質(zhì)粒pEMBL-SOD 374或pEMBL-SOD ATG。這些質(zhì)粒被用作產(chǎn)生本發(fā)明最終載體所用的中間體。如果尚未得到該基因，則構(gòu)建過程的最開始需從含有該基因的已知來源，如人或動物或野生型微生物菌株分離編碼所需多肽的基因。利用合成引物，通過眾所周知的PCR方法擴增基因，將基因插入載體，通常為穿梭載體。利用一般的限制性酶缺失中間體載體中的所有非酵母序列，如細菌序列，包括多克隆位點，如細菌復制起點ORI，選擇性標記，絲狀噬菌體f1的復制起點，氨芐青霉素抗性基因等。
下文將更詳細地討論所用的方法基因表達需要將身為編碼所需多肽的DNA的基因置于強酵母啟動子的控制之下，所述啟動子將指導相應信使RNA的合成。酵母載體攜有表達所需的DNA調(diào)節(jié)元件。
這些載體是“穿梭載體”，它們可在酵母菌株以及大腸桿菌中增殖以便于操作和大規(guī)模制備不同的中間體質(zhì)粒。
已研制出大量不同的酵母整合(YIp)，復制(YRp)，著絲粒(YCp)和附加型(YEp)質(zhì)粒載體(Rose A.B.，Broach J.R，酶學方法，185234-279(1990)，Schneider J.C.和Guarente L，酶學方法，194373-388(1991))。
為表達Cu/Zn SOD基因而選擇的質(zhì)粒是特異性的YEp(酵母附加型質(zhì)粒)穿梭載體pEMBLyex4，其大小為8.800個堿基對(Cesarani和Murray，Setlow J.K.(編)基因工程原理和方法，第9卷，Plenum出版社，紐約134-135(1987))。
該載體攜有2-微米(2-micron)的酵母附加體(大多數(shù)釀酒酵母菌株的核中存在的小的雙鏈DNA質(zhì)粒)，它提供高的有絲分裂穩(wěn)定性和自主復制的能力(Murray J.A.H.，分子微生物學，11-4(1987)，Hartley和Donelson，自然，286860-864(1980)，Clark-Walker G.D.和Miklos G.L.G.，歐洲生物化學雜志，41359-365(1974)，F(xiàn)utcher A.B.和Cox B.S.J.，細菌學，157283-290(1984))。
質(zhì)粒的持久性歸因于2-微米組成成分中REP3基因座(用于在細胞分裂過程中分配質(zhì)粒)和ARS序列(復制起點)的存在。
質(zhì)粒pEMBLyex4攜有LEU 2和URA 3選擇性標記，它們對選擇最初的酵母細胞轉(zhuǎn)化子和提供恒定的壓力以在酵母細胞中維持質(zhì)粒特別有用(Alani E.等，遺傳學，116541(1987)，Gritz L.和Davies J.，基因，25179(1983)，Kaster K.R.等，最新遺傳學，8353(1984)，Rine J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，806750(1983))。
然而，一般說來，這些類型的質(zhì)粒甚至在缺乏陽性選擇時仍能較好地維持。在這種情況下，細胞以每代約4％的速度失去質(zhì)粒。pEMBLyex4是具有很高拷貝數(shù)(每個細胞約100-200)的特殊的一類2-微米載體。
另外，使用了缺乏增殖質(zhì)粒的2-微米附加體(cir°)的酵母菌株。已知此菌株中pEMBLyex4的穩(wěn)定性很高，甚至在沒有連續(xù)的選擇壓力時也是如此。
pEMBLyex4質(zhì)粒包括整個酵母表達雜合盒UAS GAL/CYC。啟動子盒含有上游激活位點(UAS序列)和啟動子區(qū)域(TATA盒)以高水平地轉(zhuǎn)錄下游基因和調(diào)節(jié)表達，含多克隆位點(MCS)以插入基因，另外還含有終止區(qū)域(Guarente L.等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，797410-7414(1982))。雜合盒UAS gal/CYC自5’至3’方向攜有下列區(qū)域-酵母GAL4和GAL10基因之間區(qū)域的上游激活序列中的365bp片斷(Sau3A-XhoI)，其含有GAL4產(chǎn)物的結(jié)合區(qū)域；-含有酵母基因CYC1的啟動子的250bp區(qū)域(XhoI-SstI)，它攜有TATA盒和mRNA起始位點，但不含ATG區(qū)域；-具有獨特限制性酶位點的95bp多接頭(SstI-HindIII)；-攜有2-微米FLP基因的聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止信號的250bp區(qū)域(在HindIII-SnaBI片斷中)。
表達系統(tǒng)受GAL4和GAL80基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)。GAL4蛋白是與UAS gal序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄激活物。GAL80蛋白與GAL4蛋白的羧基末端區(qū)域結(jié)合會抑制后者的活性。該系統(tǒng)受葡萄糖阻抑，葡萄糖會抑制GAL4蛋白與UASgal結(jié)合；該系統(tǒng)受半乳糖誘導，半乳糖會導致GAL80蛋白與GAL4蛋白解離。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了被本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)化的新的酵母菌株。
酵母菌的種類是可用于表達酵母或非酵母多肽的任何已知菌種，例如釀酒酵母或Saccharomyces occidentalis，或非糖酵母的酵母菌種，如多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)，巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)，西方許旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)和具柄畢赤氏酵母(Pichia stipitis)。
優(yōu)選的新酵母菌株是例如釀酒酵母，其通過將相關(guān)的同源基因插入細胞內(nèi)區(qū)室而合成Cu/Zn SOD酶的能力有所改善。
本發(fā)明優(yōu)選的中間體酵母菌株是例如已經(jīng)產(chǎn)生、分離和鑒定的，被質(zhì)粒pEMBL-SOD 374或質(zhì)粒pEMBL-SOD ATG轉(zhuǎn)化的GRF18。
本發(fā)明的另一目的是產(chǎn)生被表達載體轉(zhuǎn)化的酵母菌株的方法，所述表達載體編碼內(nèi)源性的酵母多肽，不含任何非酵母序列，并能在所述酵母菌株中過量產(chǎn)生所述酵母多肽，所述方法的特征在于用上文所述的新載體轉(zhuǎn)化酵母菌株。
轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域中的常用方法，如Ito等原述，經(jīng)R.H.Schiestl等(1989)，最新遺傳學，16，339-346改良的LiCl方法或Hinnen等(1978)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929-1933的方法。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了在酵母菌株中生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括發(fā)酵被本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)化的酵母菌株。
發(fā)酵方法是本領(lǐng)域中的常用方法，如Alberghina，Lilia等(1991)，生物技術(shù)和應用生物化學，14，82-92所述的補料分批法，即在生長期有控制地補加葡萄糖，并在生長中期通過加入半乳糖來誘導表達。
提供下列實施例是為了舉例說明本發(fā)明，這些實施例涉及從釀酒酵母的常規(guī)菌株中分離和鑒定酵母酶基因，如Cu/Zn SOD基因的方法，在酵母強啟動子的控制之下，在酵母菌株中表達酵母酶基因的方法，以及開發(fā)和鑒定能產(chǎn)生高水平的酶，如SOD蛋白的酵母菌株的方法?？s寫本文使用了下列縮寫ARS 自主復制序列EDTA 乙二胺四乙酸EMBL 歐洲分子生物學實驗室LBLuria Bertani培養(yǎng)基MCS 多克隆位點PCR 聚合酶鏈反應PIU Pyrogallol抑制單位REP Replikon(在細胞中用作DNA復制起點的短DNA-序列)SDS 十二烷基硫酸鈉SOD 超氧化物歧化酶TBE Tris-硼酸-EDTA緩沖液TETris-EDTA緩沖液w/oColi 不含大腸桿菌序列w/oMCS不含多克隆位點YCp 酵母著絲粒質(zhì)粒YEp 酵母附加體質(zhì)粒YEPD 酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)基YIp 酵母整合質(zhì)粒Yrp 酵母復制質(zhì)粒實施例1提取和純化酵母基因組DNA此實施例涉及酵母基因組DNA的提取和純化，所述DNA要用作基因源以分離酵母Cu/Zn SOD基因。
分離Cu/Zn SOD基因所用的DNA源可以是任何酵母野生型菌株。在本實施例中，DNA提取自釀酒酵母菌株S288C，野生型，gal2和W309，野生型。
也可使用其它的野生型菌株，如W303作為DNA源以進行類似的DNA提取。
單倍體菌株S288C是典型的酵母菌株，目前，世界上大多數(shù)分子生物學實驗室都使用該菌株來分離酵母基因并進行遺傳學和生物化學研究(Mortimer R.K.和Johnson J.R.，遺傳學，11313(1986))。W309菌株被認為是潛在的另一DNA來源。已知這兩個菌株的基因組中攜有1拷貝野生型Cu/Zn SOD基因。菌株由米蘭大學生理學和普通生物化學系提供。
根據(jù)Cryer，Ecclesial和Marmur，細胞生物學方法，1239-44(1975)的改良方法，按下述提取總的酵母基因組DNA將含有YEPD培養(yǎng)基的平皿中的酵母細胞接種于200ml完全培養(yǎng)基YEPD(1％Bacto-酵母提取物，2％Bacto-蛋白胨，2％葡萄糖)中，于30℃，在1升燒瓶中振蕩培養(yǎng)過夜直至達到指數(shù)生長晚期(約8×107個細胞/ml)。
總共使用8×108個細胞提取DNA。在聚丙烯管中自旋和濃縮10ml細胞，將沉淀物轉(zhuǎn)移至1.5ml Eppendorf管中。在Eppendorf管中加入300微升裂解緩沖液(NaCl 0.15M，EDTA 0.1M pH8，SDS 1％)和300微升玻璃微珠(直徑為0.5mm)。在冰上將細胞渦旋5次，每次停頓1分鐘通過與600微升苯酚-氯仿-TE溶液渦動使細胞懸浮液勻漿并自旋2分鐘。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf管中，加入600微升氯仿-異戊醇溶液(24∶1)并混合。
將轉(zhuǎn)移至新管中的上相在37℃下與終濃度為1mg/ml的RNA酶保溫30分鐘。乙醇沉淀之后，將沉淀物重新懸浮于TE緩沖液(Tris 10mM，EDTA 1mM，pH8)。
至此，從每個制品中得到約100mg濃度約為1mg/ml的酵母基因組DNA，足以進行很多實驗。實施例2分離攜有Cu/Zn SOD基因的染色體區(qū)域使用聚合酶鏈反應(PCR)分離攜有Cu/Zn SOD基因的染色體區(qū)域。
Cu/Zn SOD基因位于釀酒酵母染色體X右臂的cyc1-rad6-SUP4-cdc8簇和cdc11區(qū)域之間(Chang等，生物化學雜志，2664417-4424(1991))。其編碼序列中不含內(nèi)含子，因此可以通過PCR直接從基因組DNA中分離整個翻譯區(qū)域。另外，該基因的5’上游區(qū)域和3’下游區(qū)域都是已知的。
為了進行PCR反應，需要跨越上游和下游區(qū)域之間的SOD基因的合成寡核苷酸(引物)對。
使用OLIGO引物分析軟件4.0版(National Biosciences Inc.Plymouth)設(shè)計PCR引物以覆蓋Bermingham-McDonogh O，Gralla E，Valentine J.PNAS.85，p.4789(1988)中公開的1037個堿基長的Cu/Zn SOD基因序列區(qū)域(EMBL/Gene Bank，登記號為J03279)。
在Applied Biosystem 392核酸合成儀(Perkin-Elmer公司，F(xiàn)oster City，CA)上合成引物，用Sephadex G-25 DNA級NAP-25柱(Pharmacia P-L Biochemicals公司；Milwaukee，Wisconsin)經(jīng)凝膠過濾純化引物。
為了使從酵母基因組中分離Cu/Zn SOD基因的機會增加，一般的策略是使用所謂的“半-嵌套PCR”。該策略使用需要3個不同引物的兩步方案(圖1)。
使用兩個引物(一個是上游引物，一個是下游引物，如SOD-3和SOD-2)的第一步可以擴增基因組較大的區(qū)域。第一步之后緊接著第二次擴增，此次擴增使用新的內(nèi)部引物(SOD-4)和先前的兩個引物之一(SOD-3)，最終可以分離和回收SOD基因。
使用下列引物進行第一輪PCR擴增SOD-3(上游引物，進入EMBL/Gene Bank，登記號為J03279的序列的區(qū)域81-102)SEQ ID NO15’-GGA CGT AAG CAT CTC TGA AGT G-3’(22聚體，TM＝66℃)SOD-2(下游引物，進入EMBL/Gene Bank，登記號為J03279的序列的區(qū)域1018-1036)SEQ ID NO25’-GCC GTC GAC GGA CCC CTC AAG ACC CCT C(28聚體，TM＝64℃)SOD-2引物具有長度為19個堿基的匹配區(qū)域(TM＝64℃)和攜有BamHI限制性位點的5’-非匹配區(qū)域。
DNA擴增在50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，各為500mM的脫氧核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，各為0.5mM的引物，50或100ng基因組DNA和2.5單位Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer公司)中進行，反應體積為100ml。每個擴增階段所用的時間和溫度如下94℃下1分鐘變性，63℃下1.5分鐘退火和延伸2分鐘。
在瓊脂糖凝膠電泳中觀察到PCR反應產(chǎn)生了長度為965堿基對(bp)的DNA片斷，它可包括SOD基因的整個編碼序列462bp，上游序列331bp和下游序列172bp。
使用引物SOD-3和第三個內(nèi)部引物SOD-4進行第二輪(半-嵌套PCR)，SOD-4跨越了進入EMBL/Gene Bank，登記號為J03279的序列的區(qū)域971-991并具有下列序列SEQ ID NO 35’-GCC GTC GAC ACA CTT GGT GAA TGA TCA AGG-3’。
引物SOD-4具有長度為21個堿基的匹配區(qū)域(TM＝60℃)和攜有SalI限制性位點的5’-非匹配區(qū)域。
按上述條件進行半-嵌套PCR反應，不同的是退火溫度為60℃，產(chǎn)生了長度為920堿基對(bp)的較短DNA片斷，它可包括SOD基因的整個編碼序列462bp，上游序列331bp和下游序列127bp。實施例3將Cu/Zn SOD基因亞克隆至質(zhì)粒載體pCRII此實施例涉及將Cu/Zn SOD基因亞克隆至質(zhì)粒載體pCRII。
擴增之后，將反應產(chǎn)物上樣于1.2％低融點瓊脂糖凝膠，在電泳裝置(MiniSubgel DNA cell，BIO-RAD Laboratories公司，Hercules，CA，USA)中跑電泳。然后通過標準方法從瓊脂糖凝膠中分離適當?shù)腄NA帶并通過苯酚提取純化它(Sambrook J.，F(xiàn)ritsch E.F.和Maniatis T.，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室，紐約，1989)。
最后，使用TA克隆系統(tǒng)(Invitrogen公司，San Diego，CA)，于12℃用T4 DNA連接酶連接16小時，將經(jīng)純化的DNA片斷插入3932bp長的線性化質(zhì)粒pCRII的多克隆位點(MCS)。
pCRII載體是克隆載體，它含有單個3’脫氧胸苷酸突出端可以直接連接PCR產(chǎn)物，還含有氨芐青霉素和卡那霉素抗性基因可在大腸桿菌細胞中進行選擇。
然后，將此構(gòu)建體(即質(zhì)粒pCRII加插入物)在大腸桿菌細胞HB101中轉(zhuǎn)染并復制。
最后，通過Birnboim和Doly的堿裂解法(Birnboim H.C.，J.Doly.1979，核酸研究71513)從細菌細胞中提取質(zhì)粒DNA并通過Nucleobond AX-100柱體(Macherey-Nagel GmbH，Duren，德國)純化。實施例4構(gòu)建質(zhì)粒pEMBL-SOD 374使用pEMBLyex4質(zhì)粒為載體制備構(gòu)建體，所述載體中克隆了以前分離的含有SOD基因的基因座，下游和經(jīng)修飾的上游區(qū)域。
將此構(gòu)建體稱為pEMBL-SOD 374并示于圖2。此構(gòu)建體中的亞克隆片斷攜有SOD基因的編碼區(qū)域(462bp)和374bp的上游區(qū)域。
為了進行構(gòu)建，用限制性酶BamHI和SalI直接切下攜有Cu/Zn SOD基因的片斷，該基因以前被亞克隆至pCRII質(zhì)粒中。
上述酶促消化產(chǎn)生了Bam HI-SalI 963bp片斷，經(jīng)凝膠電泳純化后，將此片斷亞克隆至載體pEMBLyex4的BamHI-SalI位點。實施例5制備被pEMBL-SOD 374轉(zhuǎn)化的酵母菌株X4004和GRF18插入之后，在常用于在酵母中表達同源或異源基因的兩個不同的釀酒酵母菌株中檢測質(zhì)粒pEMBL-SOD 374表達酵母Cu/Zn-SOD基因的情況(Martegani等，應用微生物學和生物技術(shù)，37604-608(1992)，Alberghina L.等，生物技術(shù)和應用生物化學，1482-92(1991)，Pradyumna K.等，生物技術(shù)和生物工程，40235-246(1992)，Yong SooPark等，生物技術(shù)和生物工程，41854-861(1993)，Scott等，生物技術(shù)和生物工程，41801-810(1993)，Jih-Han Hsieh等，生物技術(shù)和生物工程，32334-340(1988))。
使用了下列單倍體菌株-X4004，其基因型為MATa/lys5/ura3/met2/trp1，和-GRF18，其基因型為MATa/leu2-3，112/His3-11，15。
由于質(zhì)粒載體pEMBLyex4上存在標記物(LEU2-d和URA3)，所述標記物分別與leu2-GRF18菌株(GRF18菌株攜有極少回復的leu2-3，112雙移碼突變)上的亮氨酸輔源營養(yǎng)和ura3-X4004菌株上的尿嘧啶輔源營養(yǎng)互補，因此能在選擇性或半合成培養(yǎng)基中以高生物量十分有效地發(fā)酵這些菌株。
通常，插入質(zhì)粒之后，新的菌株失去了那些特異性的輔源營養(yǎng)。攜有新質(zhì)粒的GRF18仍是組氨酸營養(yǎng)缺陷型，而攜有新質(zhì)粒的X4004仍是甲硫氨酸和色氨酸營養(yǎng)缺陷型。
按下述用質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)化酵母。
轉(zhuǎn)化前-將酵母菌株(X4004或GRF18)劃線鋪于“平皿”中，-將用環(huán)從平皿上刮取的少量細胞溶于10ml無菌蒸餾水中，-超聲處理5秒鐘，通過Coulter計數(shù)器計數(shù)(OD600低于0.1)，-將總共約4×107個細胞接種于(1升燒瓶中的)200ml YEPD培養(yǎng)基中(至細胞濃度為2-3×105個細胞/ml，OD600約為0.6)，-30℃，溫和振蕩培養(yǎng)16小時(約6代)直至細胞濃度約為1×107個細胞/ml(OD600＝2-3)。
轉(zhuǎn)化前，按下述制備細胞生長常用的YEPD完全培養(yǎng)基1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％Bacto瓊脂(用于平皿)和蒸餾水。以120℃將所有成分高壓滅菌20分鐘。
按下述進行轉(zhuǎn)化一次處理(用1mg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化菌株)共使用2×108個細胞，例如，5次處理共使用1×109個細胞(100ml含有1×107個細胞/ml的培養(yǎng)物肉湯)。使用Ito的，經(jīng)Schiestl和Gietz(R.H.Schiestl，R.D.Gietz，使用單鏈核酸作為載體高效轉(zhuǎn)化完整的酵母細胞(1989)，最新遺傳學，16339-346)改良的氯化鋰法進行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化子鋪于缺乏亮氨酸(以選擇含質(zhì)粒的GRF18細胞)或缺乏尿嘧啶(以選擇含質(zhì)粒的X4004細胞)的瓊脂平板(合成的極限培養(yǎng)基)上，并于30℃培養(yǎng)?；蛘咄ㄟ^劃線于新鮮的選擇性平板上將單個菌落儲存于4℃，或者于-80℃將單個菌落儲存于15％甘油中。
根據(jù)下列方案，雙份進行所有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA(1mg)酵母菌株(2×108個細胞)pEMBL-SOD 374 X4004pEMBLyex4 X4004(陰性對照)pEMBL-SOD 374 GRF18pEMBLyex4 GRF18(陰性對照)在缺乏亮氨酸的合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株GRF18以選擇含質(zhì)粒的菌株，而對X4004而言，在缺乏尿嘧啶的合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株。
在這兩種情況下，按下述，通過將含葡萄糖的極限培養(yǎng)基換成含半乳糖作為碳源的培養(yǎng)基以誘導表達劃線于平板之后，于30℃，在50ml含有2％葡萄糖的合成極限培養(yǎng)基(對轉(zhuǎn)化的GRF18而言缺乏亮氨酸，或?qū)D(zhuǎn)化的X4004而言缺乏尿嘧啶)中將轉(zhuǎn)化子溫和振蕩通氣培養(yǎng)12-14小時，直至細胞濃度約為2.5-3×107個細胞/ml(OD600＝4-5)。用5×107個細胞(2ml預培養(yǎng)物)接種50ml含有2％半乳糖的選擇性合成培養(yǎng)基，直至細胞濃度約為1×106個細胞/ml。于30℃溫和振蕩通氣培養(yǎng)約17-18小時(約7代)，直至細胞濃度約為2-3×107個細胞/ml(OD600＝4-5)。取出2×108個細胞(如約10ml培養(yǎng)物)并用于蛋白質(zhì)提取。
按下述制備培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞所用的培養(yǎng)基合成的選擇性培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的X4004細胞)2％碳源(葡萄糖或半乳糖)，2％Baeto瓊脂(用于平皿)，50mg/l L-賴氨酸HCl，50mg/l L-甲硫氨酸和蒸餾水。以120℃將所有成分高壓滅菌20分鐘，加入不含氨基酸的difco酵母氮堿(YNB)(過濾濃縮10倍的儲液(67g/l))，50mg/ml L-色氨酸(過濾濃縮的儲液)。
合成的選擇性培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的GRF18細胞)2％碳源(葡萄糖或半乳糖)，2％Baeto瓊脂(用于平皿)，50mg/l L-組氨酸和蒸餾水。以120℃將所有成分高壓滅菌20分鐘，加入不含氨基酸的difco酵母氮堿(YNB)(過濾濃縮10倍的儲液(67g/l))。
通過幾種方法檢測微生物菌株生產(chǎn)給定多肽的能力。
首先，建議評價簡單的多肽鏈的生產(chǎn)能力。實際上，需回答的第一個問題是新細胞的表達機制在生物合成所需化合物實體時是否能有效運作。因此，為了檢測細胞提取物中大量化合物實體，如多肽的存在，首先應在SDS變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳總蛋白質(zhì)提取物，所述凝膠可根據(jù)多肽鏈的分子量進行分辨。另外，由于凝膠可排除不攜帶含SOD表達質(zhì)粒的“同基因的”酵母菌株(見陰性對照)，可將得自含質(zhì)粒菌株的細胞提取物的電泳分布圖與得自傳統(tǒng)菌株細胞提取物的電泳分布圖相比較。
已知SOD的分子量(SOD多肽鏈由154個氨基酸組成，相應的分子量為15700道爾頓)，比較對應于上述分子量的SOD帶的凝膠區(qū)域出現(xiàn)的兩個帶分布圖。通過用考馬斯藍非特異性染色進行觀察。
按下述通過SDS-聚丙烯酰胺電泳顯示用于評價克隆生產(chǎn)能力的分析技術(shù)a)蛋白質(zhì)酵母提取將Jazwinski的方法(S.Michail Jazwinski，1990，酶學方法，vol.182 p.154)作部分改動，用于從酵母中制備總蛋白質(zhì)提取物的方法如下所述-離心(4℃，4000rpm，5分鐘)濃縮2×108個細胞(在15mlfalcon管中)，-4℃，用無菌水洗滌沉淀物(轉(zhuǎn)移至eppendorf管中)，-將沉淀物重新懸浮于400微升1倍PBS緩沖液中，-加入400微升玻璃微珠(于-20℃預冷過)，-加入4微升(1mg/ml)胃酶抑制劑(蛋白酶抑制劑)，-渦旋3分鐘(在冰上進行2次)，-將10微升上清液儲存于-20℃進行蛋白質(zhì)檢測。
用考馬斯藍染色凝膠，顯示出樣品(被質(zhì)粒pEMBL-SOD 374轉(zhuǎn)化的GRF18細胞)中清晰的電泳帶，對應于相同凝膠上上樣的Cu/Zn SOD酵母蛋白質(zhì)的分子量。
在陰性樣品對照(被不含SOD基因的質(zhì)粒pEMBLyex4轉(zhuǎn)化的GRF18細胞和被不含SOD基因的質(zhì)粒pEMBLyex4轉(zhuǎn)化的X4004細胞)中未觀察到此帶。將每個樣品大致相同量的蛋白質(zhì)提取物(約1mg)上樣于聚丙烯酰胺凝膠。b)通過PIU-試驗測定SOD活性通過適當?shù)幕钚栽囼灴蓽y定同源或異源酶的表達。因此，通過在誘導培養(yǎng)物之后定量SOD活性可評價被兩種分子構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的酵母細胞的表達。通過用計數(shù)器(Coulter計數(shù)器ZBI)測定細胞數(shù)目(Lotti等，應用微生物學和生物技術(shù)，28160-165(1988))或通過測定600nm下的光吸收值可監(jiān)測培養(yǎng)物的生長情況。按“蛋白質(zhì)酵母提取”一節(jié)所述制備蛋白質(zhì)提取物。
通過Marklund和Marklund的方法，根據(jù)酶抑制鄰苯三酚自身氧化的能力檢測總酵母細胞提取物中Cu/Zn SOD活性的存在(Marklund S.和Marklund G.，歐洲生物化學雜志，47469-474(1974))。
在完全合成培養(yǎng)基中以分批發(fā)酵進行表達實驗按下述制備含和不含銅(0.0025g/l)和鋅(0.05g/l)的完全合成培養(yǎng)基(Sherman F.，酶學方法，vol 194，Academic出版社)(g/l)Bacto酵母氮堿w/o氨基酸(Difco實驗室，Detroit，MI)，6.7；碳源(葡萄糖或半乳糖)，20；腺嘌呤硫酸鹽，50；尿嘧啶，50；L-色氨酸，50；L-組氨酸，50；L-精氨酸-HCl，50；L-甲硫氨酸，50；L-酪氨酸，50；L-異亮氨酸，50；L-賴氨酸-HCl，50；L-苯丙氨酸，50；L-谷氨酸，50；L-天冬氨酸，50；L-纈氨酸，50；L-蘇氨酸，50；L-絲氨酸，50。
表1顯示出3次實驗中通過在缺失MCS和細菌序列之前表達SOD基因所得到的SOD活性數(shù)據(jù)(菌株GRF 18)和平均值表1
載體pEMBL-SOD 374平均表達值為301 PIU/ml，載體pEMBLyex4(不含插入物)為13 PIU/ml。這些值對于判定靶基因的特異性表達至關(guān)重要。在標準化的實驗室分批發(fā)酵中測定這些值。結(jié)果表明相對于原始菌株(含質(zhì)粒但不含插入物的GRF18)而言，表達水平平均升高了23倍。在實驗室分批試驗中觀察到表達水平比購買的酒酵母菌株(“Seccoferm”)提高22倍。這表明新的構(gòu)建體使制備方法的經(jīng)濟效益大大提高。實施例6制備載體pEMBL-SOD 374 w/o MCS從實施例5中的實驗可得出結(jié)論含有分子構(gòu)建體pEMBL-SOD 374的酵母菌株GRF18的性能非常好。對照是不含任何構(gòu)建體的相同菌株。因此，可使用分子構(gòu)建體pEMBL-SOD 374，通過缺失任何非酵母序列來制備最終的表達系統(tǒng)。
通過用酶SstI和HindIII雙切割多接頭的兩端以完全缺失“多克隆位點”的合成序列。這一操作可以從分子構(gòu)建體pEMBL-SOD 374中切下人工序列的全部95個堿基，并可將完整的酵母Cu/Zn SOD基因插入其余的天然位點之間。詳細方法1)用酶Hind III(New England Biolabs公司，美國)和SacI(NewEngland Biolabs公司，美國)切割克隆pEMBL-SOD 374以從載體的剩余部分中切下多接頭。酶Hind III可識別多克隆位點一端的獨特位點“A/AGCTT”，而酶SacI是酶SstI的同裂酶并且識別多克隆位點另一端的相同的獨特序列“GAGCT/C”。
雙切割之后，通過電洗脫從瓊脂糖凝膠電泳中分離8705個堿基長的Hind III-SacI片斷，該片斷攜有載體pEMBL所有的酵母和細菌序列但不含多接頭。
最后，通過苯酚-氯仿處理純化8705bp的片斷并通過乙醇沉淀濃縮。
2)為了進行進一步的處理，用聚合酶I“Klenow片斷”處理8705bp Hind III-Sac I片斷的末端以在片斷上產(chǎn)生匹配的末端。這一處理通過補平Hind III末端(其為5’突出末端)并切下Sac I末端(其為3’突出末端)而使片斷的兩端成為平端。
最后，通過苯酚-氯仿和乙醇沉淀純化成為平端的片斷。
3)用分別識別位點“G/AATTC”和“G/TCGAC”的酶Eco RI(NewEngland Biolabs公司，美國)和Sal I(New England Biolabs公司，美國)切割攜有酵母Cu/Zn SOD基因并存在于克隆pEMBL-SOD 374上的DNA片斷。此次雙切割可分離916bp的片斷，該片斷攜有342bp的酵母上游序列，462bp的酵母Cu/Zn SOD基因的整個開放讀框和112bp的酵母下游序列。通過電洗脫從瓊脂糖凝膠電泳中分離這一長為916bp、不含任何其它細菌或人工序列的片斷，通過苯酚-氯仿處理和乙醇沉淀純化它。
4)純化之后，用聚合酶I“Klenow片斷”處理Eco RI-Sal I片斷，該處理補平了Eco RI和Sal I末端(皆為5’突出末端)以使它們成為匹配的末端，能被亞克隆至純化的已缺失多接頭的pEMBL載體的末端。再通過苯酚-氯仿處理和乙醇沉淀純化成為平端的片斷。
5)最后，通過用T4 DNA聚合酶(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim)連接將含有酵母Cu/Zn SOD基因的平端916bp片斷亞克隆至平端8705bp片斷-pEMBL載體中。該連接于16℃下進行20小時。
6)用連接混合物(平端916bp片斷+平端8705bp片斷)轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞(XL1-Blue菌株)之后，進行隨機篩選以分離攜有正確序列的克隆。于37℃，在LB肉湯培養(yǎng)基中將轉(zhuǎn)化后的一些細菌克隆培養(yǎng)過夜，通過“微量制備”法(“Wizard”微量制備DNA純化系統(tǒng)，Promega公司，美國)提取克隆中的DNA質(zhì)粒。
使用PCR擴增和DNA測序證實克隆中含酵母Cu/Zn SOD基因的片斷的存在和正確方向。
通過測序和瓊脂糖凝膠電泳證實正確性。實施例7制備最終的載體pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli得自實施例6的克隆“pEMBL-SOD 374 w/o MCS”僅攜有酵母序列(酵母的功能性序列和酵母Cu/Zn SOD基因)和細菌序列?！皃EMBL-SOD374 w/o MCS”克隆的非酵母部分攜有大腸桿菌的復制起點，氨芐青霉素細菌選擇性標記和得自絲狀噬菌體f1的復制起點。
此區(qū)域覆蓋了4000個以上堿基，必需通過酶促消化使之缺失以得到僅攜有酵母序列的最終載體。處理后得到的最終載體僅在酵母菌株中可以復制。實際上，最終載體中存在的序列僅為-用于選擇酵母細胞轉(zhuǎn)化子的Leu 2-d酵母選擇性標記，-可提供高有絲分裂穩(wěn)定性和質(zhì)粒復制的2-微米酵母附加體復制起點，-提供受其控制的高水平基因轉(zhuǎn)錄的整個酵母表達雜合UASGAL/CYC系統(tǒng)，-產(chǎn)生Cu/Zn超氧化物歧化酶的酵母SOD基因(具有上游和下游功能性的酵母序列)。制備載體的詳細方法1)用平端內(nèi)切核酸酶Stu I(在初始pEMBLyex4載體的第5942位)和Nru I(在初始pEMBLyex4載體的第1791位)切割缺失了多克隆位點的克隆“pEMBL-SOD 374 w/o MCS”。Stu I(Pharmacia，Uppsala)識別獨特的平端位點“AGG/CCT”，Nru I(Pharmacia，Uppsala)識別獨特的平端位點“TCG/CGA”。通過凝膠電泳從pEMBL載體的其余部分中分離所得的4689bp Stu I-Nru I片斷，該片斷攜有所有的細菌序列。雙切割還缺失了載體上的酵母選擇性標記URA3的一部分，但保留了其它酵母選擇性標記LEU-2d的全部功能，此標記可用于在進一步操作的過程中選擇克隆。
2)通過電洗脫從瓊脂糖凝膠中分離僅含有酵母序列和酵母Cu/ZnSOD基因的pEMBL載體片斷，并通過苯酚-氯仿和乙醇沉淀純化它。
3)通過T4 DNA連接酶(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim)將純化的pEMBL載體的末端(兩個末端皆為平端)重新連接到一起，使用連接混合物轉(zhuǎn)化GRFl8酵母菌株。
4)將轉(zhuǎn)化得到的克隆鋪于含有缺乏亮氨酸的合成極限培養(yǎng)基的瓊脂平板上以(通過選擇性標記Leu2-d)選擇含有缺失質(zhì)粒的GRF18細胞。
5)通過PCR檢測轉(zhuǎn)化所得的一些酵母菌落以證實含有酵母Cu/ZnSOD基因的酵母片斷的存在以及Stu I和Nru I酶解位點之間任何細菌序列的缺乏。為了證實最終構(gòu)建體“pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli”上酵母片斷的存在，用兩個側(cè)翼引物SOD proA和SOD proB進行PCR擴增。推定的約1133bp長的電泳帶證實了6個酵母克隆中含有酵母Cu/Zn SOD基因的片斷的存在。
通過測序和瓊脂糖凝膠電泳證實正確性。
經(jīng)處理得到的最終載體“pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli”不含任何細菌或人工序列，由于僅存在酵母序列，因此僅能在酵母菌株中復制。最終載體的限制性圖譜示于圖3。實施例8評價酵母Cu/Zn SOD基因在新的酵母菌株中的表達此實施例涉及評價酵母Cu/Zn SOD基因在按實施例6和7構(gòu)建的新的酵母菌株中的表達。所有實驗按實施例5中所述進行，在完全合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母細胞。
表2顯示出總的酵母細胞提取物中SOD活性的存在，所述活性是通過在缺失GRF18-pEMBL SOD 374中的MCS和細菌序列之后在完全合成培養(yǎng)基中表達SOD基因所得到的表2
試驗結(jié)果表明與載體pEMBLyex4(GRF18中)相比，載體pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli以較高的產(chǎn)量表達酵母Cu/Zn SOD基因。實施例9分離和純化酵母Cu/Zn SOD例如根據(jù)Alberghina等人的方法(文獻同上)，在計算機控制的發(fā)酵罐中，在通氣條件下生產(chǎn)靶多肽，如酵母超氧化物歧化酶。發(fā)酵的控制參數(shù)是溫度，溶解氧，pH和乙醇濃度。
多肽的純化包括下列步驟1. 20℃-30℃，用勻漿器(如APV Gaulin)，以600-800巴的壓力，經(jīng)3個循環(huán)，或用dynobed碾磨機(如填充了酸、洗過的直徑為0.3mm的KDL型Dyno碾磨機)進行勻漿，并于室溫下用碾磨機以160ml/min的流速使懸浮液重新環(huán)流1-2分鐘，從而直接裂解發(fā)酵肉湯中的酵母細胞。
2.通過離心，如用裝配有JA-10固定角轉(zhuǎn)頭的Beckmann J2-21離心機，以14′000g的轉(zhuǎn)速離心60分鐘，或者通過微量過濾，如通過用裝配有0.45μm截斷膜的Minitan(Millipore公司，Bedford)進行切向流過濾以分離細胞碎片和蛋白質(zhì)。
3.通過超濾和滲濾改變濃度和緩沖液條件用裝配有10′000道爾頓截斷纖維素膜(PLGCOMP 04膜)的Minitan(Millipore公司，Bedford)進行切向流過濾。緩沖液20mM Tris-HCl，pH8.0。
4.通過陽離子交換層析，如DEAE-Sepharose進行純化，條件上樣緩沖液20mM Tris-HCl，pH8.0；洗脫緩沖液20mM Tris-HCl，pH8.0，1M NaCl。
5.通過超濾和滲濾改變濃度和緩沖液以得到最終的SOD緩沖溶液。條件用裝配有10′000道爾頓截斷膜的Minitan(Millipore公司，Bedford)進行切向流過濾。緩沖液20mM Tris-HCl，pH8.0。
發(fā)酵結(jié)束時，活性至少為5000PIU/ml。用本發(fā)明的新菌株得到的產(chǎn)量至少比用購買的面包酵母得到的產(chǎn)量高10倍。從1g面包酵母可分離出5000PIU，而從1g pEMBL-SOD 374 GRF18酵母中可至少分離出40′000PIU。
序列表1)一般資料(i)申請人(A)名稱PENTAPHARM AG(B)街道ENGELGASSE 109(C)城市BASEL(D)州BS(E)國家瑞士(F)郵政編碼(ZIP)CH-4002(G)電話xx41-61-7064848(H)傳真xx41-61-3199619(ii)發(fā)明題目酵母中多肽的改良生產(chǎn)(iii)序列數(shù)3(iv)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假擬的否(iv)反義的否(v)片斷類型內(nèi)部的(vi)原始來源(A)生物釀酒酵母(B)菌株S288C(vii)直接來源(A)文庫EMBL No J03279(viii)基因組中的位置(B)圖譜位置81-102(C)單位bp(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置1..22(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞引物_結(jié)合(B)位置1..22(xi)序列描述SEQ ID NO1GGACGTAAGC ATCTCTGAAG TG 22(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假擬的否(iv)反義的是(v)片斷類型內(nèi)部的(vi)原始來源(A)生物釀酒酵母(B)菌株S288C(vii)直接來源(A)文庫EMBL No J03279(viii)基因組中的位置(B)圖譜位置1018-1036(C)單位bp(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置1..28(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞引物_結(jié)合(B)位置1..28(xi)序列描述SEQ ID NO2GCCGTCGACG GACCCCTCAA GACCCCTC 28(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假擬的否(iv)反義的是(v)片斷類型內(nèi)部的(vi)原始來源(A)生物釀酒酵母(B)菌株S288C(viii)基因組中的位置(C)單位bp(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置1..30(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞引物_結(jié)合(B)位置1..30(xi)序列描述SEQ ID NO3GCCGTCGACA CACTTGGTGA ATGATCAAGG 30
權(quán)利要求
1.在酵母中生產(chǎn)多肽的新的表達載體，所述載體含有編碼所述多肽的序列，和允許所述多肽僅在酵母中表達的其它序列，所述其它序列不含任何非酵母序列。
2.權(quán)利要求1的載體，其中編碼所述多肽的序列是受酵母啟動子控制的酵母序列。
3.權(quán)利要求1的載體，所述載體含有受酵母啟動子控制的編碼酵母酶的序列。
4.權(quán)利要求1的載體，所述載體是含有受GAL/CYC啟動子控制的Cu/Zn SOD基因的酵母質(zhì)粒。
5.權(quán)利要求1的載體，所述載體是pEMBL-SODw/oMCS，w/oColi。
6.權(quán)利要求1的載體，其中編碼所述多肽的序列是受酵母啟動子控制的非酵母序列。
7.權(quán)利要求6的載體，其中編碼所述多肽的序列是受酵母啟動子控制的人或動物序列。
8.含有權(quán)利要求1的載體的酵母菌株。
9.權(quán)利要求8的酵母菌株，所述菌株是含有質(zhì)粒pEMBL-SODw/o MCS，w/oColi的GRF18。
10.生產(chǎn)權(quán)利要求1的新表達載體的方法，其特征在于從能在酵母菌株中表達多肽的穿梭載體中切下任何非酵母序列，并且任選地用編碼另一多肽的序列替代編碼所述多肽的序列。
11.生產(chǎn)權(quán)利要求8的酵母菌株的方法，其特征在于用權(quán)利要求1的載體轉(zhuǎn)化酵母菌株。
12.在酵母菌株中生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括發(fā)酵權(quán)利要求8的酵母菌株并分離多肽。
全文摘要
在酵母中生產(chǎn)多肽的新的表達載體,所述載體含有編碼所述多肽的序列,和允許所述多肽僅在酵母中表達的其它序列,所述其它序列不含任何非酵母序列;含有該載體的酵母菌株;產(chǎn)生所述新表達載體的方法;產(chǎn)生所述酵母菌株的方法,所述方法包括用所述新載體轉(zhuǎn)化酵母菌株;在經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母菌株中生產(chǎn)多肽的方法,所述方法包括發(fā)酵該菌株并分離多肽。
文檔編號C12N15/81GK1268181SQ97182364
公開日2000年9月27日 申請日期1997年9月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月5日
發(fā)明者T·施雷爾, R·沃格里 申請人:彭特法姆股份公司