專利名稱：：用復(fù)合毒素防治昆蟲的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地說涉及昆蟲毒素在昆蟲防治中的使用，更具體地說，涉及的是關(guān)于表達(dá)昆蟲-選擇性毒素的殺蟲重組微生物，它們是增效的組合，用以提高殺死昆蟲的速率。本發(fā)明是在政府的支持下完成的，許可號為91-37302-6185，授權(quán)部門為美國農(nóng)業(yè)部。美國政府在本發(fā)明中有一定的權(quán)利。發(fā)明背景鱗翅目夜蛾科包括一些很有破壞性的農(nóng)業(yè)害蟲，如棉鈴蟲屬(Heliothis)、Helicoverpa、斜紋夜蛾屬(Spodoptera)和粉紋夜蛾屬(Trichoplusia)。例如在夜蛾科中還包括煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)、棉鈴蟲(Helicoverpazea)、棉葉夜蛾(Alabamaargillacea)、八字紋地老虎(Amathesniarum)、透明緩夜蛾(Crymodesdevastator)、青銅地老虎(Nephelodesemmedonia)、草地夜蛾(Laphygmafrugiperda)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和雜色地老虎(Peridromasaucia)。農(nóng)業(yè)害蟲如夜蛾科昆蟲(及其它)對農(nóng)藥的抗性，導(dǎo)致對環(huán)境和人類健康危害。對殺蟲劑的抗性問題導(dǎo)致使用更多無選擇的和有毒化合物以克服害蟲的抗性，這就引起了破壞和惡性循環(huán)。選擇性天然毒素已被建議使用在昆蟲防治中。這些毒素包括有毒動物體內(nèi)特殊的腺組織中產(chǎn)生的物質(zhì)。毒液可例如借助于穿刺器官，導(dǎo)入被捕獲物或目標(biāo)物的體內(nèi)，麻痹和/或殺死它，以及其它的已知的釋放毒物方法。以蝎子為例，在它的毒液中含有大量的有毒的和作用于興奮系統(tǒng)的蛋白質(zhì)或神經(jīng)毒素。其中被建議用于昆蟲防治的昆蟲特異毒素是從蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、蝎子如鉗蝎(Buthueupeus)和撒哈拉蜂蝎(Androctonusaustralis)，Leiurusquinqustriatushebraeus、Leiurusquinqustriatusquinqustriatus和螨(虱狀蒲螨)(Pyemotestritici)獲取的毒素。由屬于鉗蝎亞科(Buthinae)蝎子中得到的毒液，主要含有四個重要組的調(diào)節(jié)軸突鈉傳導(dǎo)的多肽神經(jīng)毒素。第一組蝎子神經(jīng)毒素是α-毒素，它選擇地作用于哺乳動物，由于延緩或阻斷鈉通道失活，使動作電位極端延長(Catterall，《科學(xué)》[Science]，223653-661(1984)；Rochat等，《細(xì)胞藥理學(xué)進(jìn)展》[AdvancesinCytopharmacology]，pp.325-334(1979))。第二組毒素是β-毒素，損害鈉通道的活性(Couraud和Jover，《自然毒素手冊》[HandbookofNaturalToxins]Tu，A.編，第二卷，pp.659-678(1984)紐約MarcelDekker)。第三組神經(jīng)毒素是抑制性昆蟲選擇性毒素，由于抑制鈉電流，從而它基本上阻斷動作電位，導(dǎo)致昆蟲逐漸軟弱麻痹(Lester等，《生物化學(xué)和生物物理學(xué)報》[Biochim.Biophys.Acta]701370-381(1982)；Zlotkin等，[Arch.Biochem.Biophys]，240877-887(1985))。第四組神經(jīng)毒素是興奮性昆蟲選擇性毒素，由于增加鈉峰電流和延緩其失活所依賴的電壓，從而誘導(dǎo)反復(fù)點(diǎn)燃其運(yùn)動神經(jīng)，導(dǎo)致昆蟲即刻(擊倒)的抽搐麻痹(Walther等，《昆蟲生理學(xué)雜志》[J.InsectPhysiol.]，221187-1194(1976)；Pelhate等，《生理學(xué)雜志》[J.Physiol.]，30318-319(1981))。除了蝎子和螨的毒素以外，在蝸牛、蜘蛛和若干其它節(jié)肢動物的毒液中也已經(jīng)鑒定出昆蟲選擇性毒素。(參見Zlotkin的綜述，《綜合昆蟲生理學(xué)、生物化學(xué)和藥理學(xué)》[ComprehensiveInsectPhysiolopy，BiochemistryandPharmacology]，第10卷，第15章，pp.499-541(1985))。繭蜂的毒液對鱗翅目幼蟲具有很高的毒性。通過在昆蟲神經(jīng)肌肉結(jié)合點(diǎn)誘發(fā)興奮性谷氨酸能(glutaminergic)傳導(dǎo)的前聯(lián)合體間斷，麥蛾繭蜂(Braconhebetor)的毒液引起鱗翅目幼蟲軟弱麻痹(Piek等，Comp.Biochem.Physiol.，72c303-309(1982))。獨(dú)居蜂(solitarywasp)對很多不同目的昆蟲和蜘蛛都表現(xiàn)出毒性(Rathmeyer，Z.Vergl.，Physiol.，45453-462(1962))。這些毒液的一個例子是三角泥蜂(Philanthustriangulum)毒液，由于前聯(lián)合體阻斷神經(jīng)肌肉的傳輸，這種毒液誘發(fā)昆蟲基本軟弱麻痹；它對興奮性和抑制性傳輸都產(chǎn)生影響(May等，《昆蟲生理學(xué)》[InsectPhysiol)，25285-691(1979))。黑寡婦蜘蛛(Latrodectusmactans)的毒液含有的一些對昆蟲有神經(jīng)毒性，但對哺乳動物沒有神經(jīng)毒性的組分，而其它組分具有相反的選擇性(Fritz等，Nature，238486-487(1980)；Ornberg等，Toxicon，14329-333(1976))。最近，一種稱為LqhαIT的毒素，它在一級結(jié)構(gòu)和電生理學(xué)作用牢固地重新裝配α-毒素，已從L.quinquestriatushebraeus的毒液分離出來并表現(xiàn)出主要影響昆蟲(Eitan等，《生物化學(xué)》[Biochemistry]，29(1990)，PP.5941-5947)。有毒動物的毒液是由各種作用于被捕獲物的興奮系統(tǒng)中的不同靶位點(diǎn)的毒素組成。比較毒素和其各自的天然毒液對鱗翅目幼蟲的活性，以此數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，可以清楚地看到，天然毒液的效力不能用單一毒素的活性來解釋。天然毒液的高效力可能涉及到毒液中的不同毒素在下述三個方面共同協(xié)作的結(jié)果同一離子通道不同靶位點(diǎn)(表3，Trainer等，JBC，26817114-17119(1993))，同一可興奮細(xì)胞的不同離子通道(Olivera等，《科學(xué)》[Science]，249，257-263(1990))，和/或毗鄰的可興奮細(xì)胞(神經(jīng)和/或肌肉)的不同結(jié)合點(diǎn)(Olivera等，《科學(xué)》[Science]，249，257-263(1990))。有抑制性和興奮性作用的昆蟲選擇性毒素不會與α-昆蟲毒素競爭其結(jié)合點(diǎn)(Gordon和Zlotkin，F(xiàn)EBS.Lett.，315，(1993)pp.125-128)。與蝗蟲和蟑螂的神經(jīng)膜相反，在鱗翅目幼蟲的神經(jīng)膜的結(jié)合點(diǎn)上，興奮性毒素不替代抑制性毒素(Gordon等，《生物化學(xué)》[Biochemistry]，31(1992)，pp.7622-7628；Moskowitz等，《昆蟲生物化學(xué)和分子生物學(xué)》[InsectBiochem.Molec.Biol.]，24(1994)，pp.13-19)。近來，屬于桿狀病毒科的苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核多角體病毒(AcNPV)，已通過表達(dá)昆蟲選擇性毒素作了遺傳上的修飾，以提高殺蟲的速度。把昆蟲選擇性毒素引入昆蟲病原病毒曾導(dǎo)致殺死昆蟲宿主的時間減少，正如在1994年4月15日申請的美國專利申請?zhí)?8/229417中所描述的那樣，上述美國專利申請是1990年12月19日申請的美國專利申請?zhí)?7/629603的接續(xù)申請，它們與此(部分)共同轉(zhuǎn)讓。Tomalski等的美國專利號5266317，1993年11月30日公布，討論表達(dá)昆蟲捕食蜱螨的昆蟲特異性麻痹神經(jīng)毒素的重組桿狀病毒的應(yīng)用。Barton等的美國專利號5177308，1993年1月5日公布，在創(chuàng)造表達(dá)由蝎子得來的昆蟲特異性毒素和/或土壤微生物毒素的轉(zhuǎn)基因植物方面采用了一種不同的途徑。在一未決申請(它與此共同轉(zhuǎn)讓)，Hammock和McCutchen在1994年7月5日申請的美國專利申請?zhí)?8/279956中，討論了用重組病毒與有機(jī)殺蟲劑的增效組合來進(jìn)行昆蟲防治。由于大范圍出現(xiàn)害蟲對有機(jī)殺蟲劑如擬除蟲菊酯害蟲抗性已經(jīng)開始造成巨大的作物損失，因此這些新出現(xiàn)的使用重組的策略來進(jìn)行害蟲種群的防治是非常有希望的。單就棉花來說，pyr-R棉鈴蟲種類的出現(xiàn)已經(jīng)導(dǎo)致每年數(shù)百萬美元的損失。實(shí)際上，在一些案例中，擬除蟲菊酯殺蟲劑對棉鈴蟲屬幼蟲侵害的防治已經(jīng)完全失敗，結(jié)果棉花全部被毀。發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面是，通過遺傳工程提供的殺蟲微生物的應(yīng)用，提供一種防治各種害蟲的方法。根據(jù)本發(fā)明防治的害蟲是，例如昆蟲、蜱螨和線蟲類。因此，本發(fā)明可適用于鱗翅目和其它目，以及夜蛾科和其它科。這些害蟲用一種或更多種重組微生物表達(dá)的毒素的增效組混合來處理(或處理其位點(diǎn))。例如，這種方法可以使用表達(dá)第一種神經(jīng)毒素的第一種重組病原體與表達(dá)第二種神經(jīng)毒素的第二種重組病原體組合，或者使用表達(dá)多種(如第一種和第二種)神經(jīng)毒素的單一重組病毒。本發(fā)明的方法加快了用病毒殺死害蟲的速率。附表簡述在附圖中，表1闡明了合成基因LqhIV的核苷酸序列，SEQIDNO1，它是一種實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選毒素。優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明是遺傳工程化的殺蟲微生物組合在處理害蟲如昆蟲中的應(yīng)用。雖然重組桿狀病毒將始終作為優(yōu)選微生物的例證，但本發(fā)明也可用多種微生物作為重組釋放體系來實(shí)施本發(fā)明。因此，可用于本發(fā)明的微生物包括DNA和RNA病毒如桿狀病毒，真菌和細(xì)菌。大約40種核多角體病毒已從昆蟲種類里分離出來。(參見例子，《無脊椎動物病毒圖集》[AtlasofInvertebrateViruses]，Adams和Bonami，編輯，CRCPress，Inc.，1991)。各種桿狀病毒包括那些感染如下昆蟲的桿狀病毒棉鈴蟲(Helicoverpazea)、煙芽夜蛾、花旗松毒蛾(Orgiapseudotsugata)、舞毒蛾(Lymantriadispar)、苜蓿銀紋夜蛾、松柏鋸角葉蜂(Neodiiprionsertifer)、蘋果蠹卷蛾(Laspeyresiapomonella)，它們已經(jīng)注冊為殺蟲劑，所有這些來自昆蟲種類的桿狀病毒都適合用來實(shí)施本發(fā)明。多數(shù)真菌都能使昆蟲感染。把昆蟲選擇性毒素引入這些真菌的基因組會提高它們作為殺蟲劑的效力。例如，蠶白僵菌(Beauvariabassania)和Beauvariabrongniartii有很大的宿主范圍，它們已被建議作為候選的微生物殺蟲劑(參見Miller的綜述，《科學(xué)》[Science]，219715-721，1983)。已經(jīng)作為昆蟲防治劑的細(xì)菌(除蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)之外)，包括日本甲蟲芽孢桿菌(Bacilluspopilliae)、緩病芽孢桿菌(B.lentimorbus)和球狀芽孢桿菌(B.sphaericus)。通過把昆蟲選擇性毒素引入這些細(xì)菌的基因組來改善它們的效力從而提高它們作為殺蟲劑的潛力。本發(fā)明的實(shí)施涉及兩種在防治昆蟲方面有增效作用的毒素的組合應(yīng)用。這兩種毒素可通過其中已引入兩種毒素基因的單一重組微生物的方式來表達(dá)，或者可以通過制備兩種重組微生物來實(shí)施，所述的二種重組衍生物各可以通過把一個編碼各自的昆蟲毒素的基因克隆入基因組來完成構(gòu)建。選擇的毒素對的組合可以通過幾種方法來確定。如將在下文進(jìn)行描述的(如通過實(shí)施例6的篩選技術(shù)描述的)，優(yōu)選選擇作用于同一細(xì)胞通道(典型的是鈉通道)但作用于非疊加位點(diǎn)的毒素，正如將在下文所進(jìn)一步描述的那樣。在前面提到，用來實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選微生物是桿狀病毒。用“桿狀病毒”是指桿狀病毒科(Baculoviridae)的任何桿狀病毒，如核多角體病毒(NPV)。桿狀病毒是一大組進(jìn)化上相關(guān)的病毒，只感染節(jié)肢動物；實(shí)際上，有些桿狀病毒只感染那些有重要經(jīng)濟(jì)意義的農(nóng)業(yè)和林業(yè)作物的害蟲，而其它的桿狀病毒已知專門感染其它害蟲。因?yàn)闂U狀病毒只感染節(jié)肢動物，因而對人類、植物和環(huán)境很少或沒有危害。在適合的DNA病毒中，除了桿狀病毒科(Baculoviridae)之外是昆蟲痘病毒外(EPV)，如西方五月鰓角金龜子(Melolonthamelonotha)痘病毒、桑燈蛾(Amsactamoorei)痘病毒、亞洲飛蝗(Locustamigratotia)痘病毒、血黑蝗(Melanoplussanguinipes)痘病毒、沙漠蝗(Schistocercagregaria)EPV、埃及伊蚊(Aedesaogypti)痘病毒和淡色搖蚊(Chironomusluridus)痘病毒。其它適合的DNA病毒是顆粒體病毒(GV)等。適合的RNA病毒包括披膜病毒科、黃病毒屬、小RNA病毒、質(zhì)多角體病毒及類似的病毒。雙鏈DNA病毒Eubaculovirinae的亞科有兩個屬，NPVs和GVs，它們在生物防治中特別有用是因?yàn)樗鼈冊谄渖芷谥挟a(chǎn)生包含體。GVs的例子包括蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)顆粒體病毒，大菜粉蝶(Pierisbrassicae)顆粒體病毒，粉紋夜蛾(Trichoplusiani)顆粒體病毒，ArtogeiarapaeGV和印度谷螟(Plodiainterpunctella)顆粒體病毒。用來實(shí)施本發(fā)明的適合的桿狀病毒可以是包含的或不包含的。核多角體病毒(“NPV”)是桿狀病毒亞組的一種，是“包含”的。那就是說，NPV組的一個特有特征是很多病毒粒子嵌在晶狀蛋白的基質(zhì)間，這就是所指的“包含體”。NPV的例子包括舞毒蛾(Lymantriadispar)NPV、苜蓿銀紋夜蛾NPV、芹菜夜蛾(Anagraghafalcifera)NPV，斜紋夜蛾(Spodopteralitturalis)NPV、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)NPV、棉鈴蟲(Heliothisarmigera)NPV、甘藍(lán)夜蛾(Mamestrabrassicae)NPV、樅色卷蛾(Choristoneurafumiferana)NPV、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)NPV、HelicoverpazeaNPV、刺金翅夜蛾(Rachiplusiaou)NPV。在田間經(jīng)常優(yōu)先使用包含病毒是由于它們較好的穩(wěn)定性，因?yàn)椴《镜亩嘟求w蛋白外衣給包含入的感染核衣殼提供很好的保護(hù)。在例證中，在實(shí)施本發(fā)明中有用的桿狀病毒是得自下列害蟲的桿狀病毒芹菜夜蛾(Anagraphafalcifera)、黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、油桐尺蠖(Buzurasuppressuria)、蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)、Helicoverpazea、棉鈴蟲(Heliothisarmigera)、甘藍(lán)夜蛾(Manestiabrassicae)、小菜蛾(Piutellaxylostella)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、海灰翅夜蛾(Spodopteralittoralis)和斜紋夜蛾(Spodopteralitura)。用來實(shí)施本發(fā)明的一個特別有用的“NPV”是AcNPV，是來自苜蓿銀紋夜蛾(autographacalifornica)的核多角體病毒。對苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)有特別的興趣，是因?yàn)樵谛奔y夜蛾屬(Spodoptera)、Trichoplusia和棉鈴蟲屬(Heliothis)中多種主要害蟲種類對此病毒敏感。表達(dá)的殺蟲毒素特別是來自或類似于節(jié)肢動物或其它無脊椎動物毒素的神經(jīng)毒素，如蝎毒、黃蜂毒、蝸牛毒、螨毒或蜘蛛毒。一種有用的蝎毒如來自撒哈拉蜂蝎(Androctonusaustralis)的AaIT。Zlotkin等，《生物化學(xué)》[Biochimie]，53，1073-1078(1971)。一種有用的蝸牛毒來自蝸牛Conusquerciones的毒液，用嘴釋放出來，蝸牛毒中的某些個別的毒素對節(jié)肢動物包括昆蟲有選擇性。參見例如，Olivera等，“DiversityofConusNeuropeptides”，《科學(xué)》[Science]，249257-263(1990)。甚至是通常出現(xiàn)在昆蟲生命發(fā)育期間的多肽可以也作為一種殺蟲毒素，且可依據(jù)本發(fā)明使用。例如，保幼激素酯酶(JHE)的早熟特征會減少宿主昆蟲保幼激素的滴度，這樣會不可逆轉(zhuǎn)地結(jié)束取食階段，試圖蛹化，而使害蟲死亡。JHE的氨基酸序列已知，且基因已被克隆。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案包括表達(dá)保幼激素酯酶(JHE)突變的重組微生物，制備這種JHE突變或缺失的示范方法，幾種有用的JHE突變和在昆蟲防治中使用的重組表達(dá)載體(含有JHE或突變的JHE編碼序列)。正如在1994年2月17日公布的發(fā)明人為Hammock等的WO94/03588中所描述的，該文并入本文作為參考。在Hammock等的WO94/03588中描述的兩個突變體是雙賴氨酸突變體(K29R，K522R)，其中在JHE位置29和位置522通過定點(diǎn)誘變用精氨酸代替普通賴氨酸。所描述的另一個突變體為其中絲氨酸201變成甘氨酸，該突變體被稱為“S201G”。JHE的催化缺陷S201G突變體的殺蟲活性與試驗(yàn)昆蟲對蝎毒的50％死亡率在時間上相近(當(dāng)用AcNPV基因工程處理時)。因此，自然產(chǎn)生的JHE昆蟲蛋白，一般沒有毒性，可以通過如定點(diǎn)誘變(或其它)而修飾為有毒的媒介物。除了氨基酸殘余物的改變，其它JHE突變體可以通過例如缺失N-末端的19個氨基酸(它們是新合成蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌通道的信號序列)而制備，變成糖基化，然后離開細(xì)胞。同JHE一樣，來自撒哈拉蜂蝎的興奮性毒素(AaIT)的氨基酸序列已經(jīng)確定，該序列已經(jīng)發(fā)表(Darbon1982)，AaIT基因已被克隆且插入表達(dá)載體用來防治昆蟲。(參見WO92/11363，1992年7月9日公布，發(fā)明人Belagaje等)。AaIT毒素對昆蟲表現(xiàn)出毒性，而對等足類和哺乳動物沒有毒性。實(shí)施本發(fā)明的另一種適合的毒素作用于昆蟲鈉通道，它與α-毒素作用于哺乳動物的鈉通道的方式非常相似。這種神經(jīng)毒素是從一種黃蝎(Leuirusquinquestriatushebraeus)得到，該神經(jīng)毒素在此稱為LqhαIT。這種毒素的鑒別和純化在(“一種使鈉電流失活的麻痹昆蟲的蝎子神經(jīng)毒素純化、一級結(jié)構(gòu)和作用方式”，Eitan等，《生物化學(xué)》[Biochemistry]，295941-5947(1990))一文中作了描述。實(shí)施本發(fā)明的兩種優(yōu)選的分離和純化的形式的毒素是新穎的，并在下文作較為詳細(xì)的描述。簡而言之，這兩種毒素被稱為“LqhIV”和“LqhVI”。這兩種毒素產(chǎn)生于(Leuirusquinquestriatushebraeus)的毒液中，在天然形式的混合物中這種毒液包含大量的個別毒素。LqhIV毒素是一種很有效力的鱗翅目毒素，當(dāng)注入鱗翅目幼蟲體內(nèi)時，它與其它蝎毒共同表現(xiàn)出正協(xié)同性，對哺乳動物沒有或有很弱的毒性。在圖1中闡明LqhIV毒素的合成基因，SEQIDNO1。因此，這兩種優(yōu)選毒素的基因可以合成(由于肽的序列大小足夠的小，使得合成DNA成為可能)。此外，這些基因可以被克隆，之后編碼序列可以被克隆入一個轉(zhuǎn)移載體，如在下文中將進(jìn)一步舉例說明的。我們已經(jīng)在麗蠅幼蟲和棉鈴蟲幼蟲兩者體內(nèi)，用毒素AaIT和LqhoIT增效組合證明了本發(fā)明的各個方面。這些昆蟲選擇性神經(jīng)毒素組合使用時的殺蟲活性增加5-10倍。說明本發(fā)明的其它組合和實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)將在下文詳細(xì)討論。各種其它蝎毒(例如鉗蝎類(Buthoidscorption)也可以為增效組合使用，如LqqIT2，是一種來自Leiurusquinquestriatusquinquestriatus的抑制性昆蟲毒素。獲得這種神經(jīng)毒素的純化方法由Zlotkin等發(fā)表于(《生物化學(xué)和生物物理檔案》[ArchiyesofBiochem.Biophys]，240877-887(1985))中。BjIT2是另一種來自鉗蝎(Buthotusjudaicus)的抑制性昆蟲毒素。純化方法已經(jīng)由Lester等發(fā)表，《生物物理學(xué)報》[Biochim.Biophys.Acta)，701370-381(1982)。BjIT2存在于位置15上的氨基酸序列不同的兩個同種型中。形態(tài)1在此位置為異亮氨酸，形態(tài)2在此位置為纈氨酸。LqhIT2是另一種來自Leuirusquinquestriatushebraeus的抑制性昆蟲毒素，用反相HPLC進(jìn)行純化。此外，從chactoid蝎子(Scorpiomauruspalmatus)的毒液純化的其它毒素也可以使用。例如，SmpIT2，來自chactoid蝎子(Scorpiomauruspalmatus)，是一種抑制性昆蟲毒素。它的純化方法由Lazarovici等發(fā)表于《生物和化學(xué)雜志》[J.Biol.Chem.]，2578397-8404(1982)。還可以從chactoid蝎子(Scorpiomauruspalmatus)的毒液純化得到的其它毒素是SmpCT2和SmpCT3，和crustacean毒素，其純化方法已經(jīng)在耶路撒冷希伯來大學(xué)的Lazarovici博士在其博士論文(1980)“StudiesontheCompositionandActionoftheVenomoftheScorpionScorpiomauruspalmatus(Scorpionidae)”中描述。表1中列出實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選毒素以及其純化方法和鑒別的引證。表1引證的參考文獻(xiàn)毒素AaITZoltkin等，《生物化學(xué)》[Biochim.]，53，1075-1078(1971).AaIT1Loret等，《生物化學(xué)》[Biochem.]，29，1492-1501(1990).AaIT2Loret等，《生物化學(xué)》[Biochem.]，29，1492-1501(1990).LqqIT1Zlotkin等，《生物化學(xué)和生物物理檔案》[Arch.fBiochem.&amp;Biophys.]，240，877-887(1985).BjIT1Lester等，《生物化學(xué)生物物理學(xué)報》[Biochem.Biophys.Acta.]，701，370-387(1982).LqhIT2Zlotkin等，《生物化學(xué)》[Biochem.]，30，4814-4821(1991).LqqIT2Zlotkin等，《生物化學(xué)和生物物理檔案》[Arch.fBiochem.&amp;Biophys.]，240，877-887(1985).BjIT2Lester等，《生物化學(xué)生物物理學(xué)報》[Biochem.Biophys.Acta.]，701，370-387(1982).LqhαITEitan等，《生物化學(xué)》[Biochem.]，29，5941-5947(1990).TSVIIBechis等，《生物化學(xué)生物物理研究》[Biochem.Biophys.Res.Comm.]，122，1146-1153(1984).螨毒素Tomalski等，《毒素》[Toxicon]，27，1151-1167(1989).α-芋螺毒素Gray等，(JBC)，256，4734-4740(1981)；Gray等，《生物化學(xué)》[Biochem.]，23，2796-2802(1984).μ-芋螺毒素Gruz等，(JBC)，260，9280-9288(1989)；Grus等，《生物化學(xué)》[Biochem.]，28，3437-3442(1989).chlorotoxinDebin等，《美國生理學(xué)雜志》[Am.J.Physiol.]，264，361-369(1993).ω-芋螺毒素Olivera等，《生物化學(xué)》[Biochem.]，23，5087-5090(1984)；Rivier等，(JBC)，262，1194-1198(1987).PLTX1Branton等，《神經(jīng)科學(xué)協(xié)會文摘》[Soc.Neurosci.Abs.]，12，176，(1986).PLTX2Branton等，《神經(jīng)科學(xué)協(xié)會文摘》[Soc.Neurosci.Abs.]，12，176(1986).PLTX3Branton等，《神經(jīng)科學(xué)協(xié)會文摘》[Soc.Neurosci.Abs.]，12，176，(1986).Ag1Kerr等，《神經(jīng)科學(xué)協(xié)會文摘》[Soc.Neurosci.Abs.]，13，182(1987)；Sugimori等，《神經(jīng)科學(xué)協(xié)會文摘》[Soc.Neurosci.Abs.]，13，228，(1987).Ag2Kerr等，《神經(jīng)科學(xué)協(xié)會文摘》[Soc.Neurosci.Abs.]，13，182(1987)；Jackson等，《神經(jīng)科學(xué)協(xié)會文摘》[Soc.Neurosci.Abs.]，13，1078(1987)。ω-AgatoxinAdams等，JBC，265，861-867，(1990).μ-AgatoxinAdams等，JBC，265，861-867，(1990).Ho1Bowers等，PNAS，84，3506-3510(1987).α-LaterotoxinGrasso等，《神經(jīng)化學(xué)中的神經(jīng)毒素》[NeurotoxinsinNeurochemistry)，Dolly編輯，67-79(1988)Steatoda毒素Cavalieri等，《毒素》[Toxicon]，25，965-974(1987).BomIIIVargas等，《歐洲生物化學(xué)雜志》[Eur.J.Biochem.]，162，589-599(1987).表1的說明性毒素可由之純化的許多生物體的cDNA庫可按下列文獻(xiàn)中的描述得到Zilberberg等(1992)，《昆蟲生物化學(xué)分子生物學(xué)》[InsectBiochem.Molec.Biol.]，22(2)，199-203(Leiurusquinquestriatushebraeus)；Gurevitz等，(1990)FebsLett.，269(1)，229-332(Buthusjudaicus)；Bougis等(1989)，JBC，264(32)，19259-19256(Androctonusaustralis)；Martin-Euclaire等(1992)FebsLett.，302(3)，220-222(Tityusserrulatus)；Woodward等(1990)EMBOJ.，9(4)，1015-1020(Conustextile)；和Colledge等(1992)，《毒素》[Toxicon]，30(9)，1111-11116(Conusgeographus)。對于其它的毒素，用類似于實(shí)施例7所示范的方式，可以構(gòu)建編碼這些毒素的合成基因。在前面曾提到，適合實(shí)施本發(fā)明的兩種分離和純化形態(tài)的毒素是新穎的。其中之一稱為“LqhIV”，具有氨基酸序列SEQIDNO2GVRDAYIADDKNCVYTCGANSYCNTECTKNGAESGYCQWFGKYGNACWCIKLPDKVPIRIPGKCR。SEQIDNO2的65個氨基酸的肽將在實(shí)施例5中進(jìn)一步描述。另一個新穎的毒素，稱為“LqhVI”，具有氨基酸序列SEQIDNO3GVRDGYIAQPENCVYHCFPGSPGCDTLCKGDGASSGHCGFKEGHGLACWCNDLPDKVGIIVEGEKCH。這個67個氨基酸的肽也將在實(shí)施例5中進(jìn)一步描述。毒素，如表1所列出的或是SEQIDNOS2和3優(yōu)選的毒素，通過首先將具有不同藥理的毒素實(shí)驗(yàn)性組合可以非常容易地被選擇來形成增效的組合。例如，AaIT是一種興奮性昆蟲毒素，而LghIT2是一種抑制性毒素。通過常規(guī)結(jié)合方案(參見Gordon等，《生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報》[Biochim.Biophys.Acta.]，778349-358(1984)，對于AaIT、BjIT1和BjIT2而言，用亞洲飛蝗(Locustamigratoria)膜小泡)，可以篩選出對感興趣的昆蟲在同一通道但非重疊位點(diǎn)上的活性。這是因?yàn)?，正如本領(lǐng)域所知，各種昆蟲的神經(jīng)膜有可變性。例如，最近有幾篇論文報導(dǎo)，與蝗蟲或蟑螂的神經(jīng)膜不同，鱗翅目幼蟲神經(jīng)膜可以在同一時間與抑制性和興奮性昆蟲毒素結(jié)合。在前面提到的AaIT和LghαIT增效組合的例子中，該組合對于麗蠅幼蟲增效效力是對棉鈴蟲(Heliothis)幼蟲的兩倍。相反，AaIT和LghIT2的組合，應(yīng)用于棉鈴蟲(Heliothis)幼蟲時，是一個增效組合(5倍的效力)，但當(dāng)單獨(dú)使用任何一種毒素對麗蠅幼蟲效力都沒有增加，這些毒素的組合可以用于在昆蟲種群中以提高選擇性。為了生產(chǎn)重組微生物，如桿狀病毒，為防治昆蟲的目的，優(yōu)選包含一個的分泌信號序列。分泌信號序列可以從細(xì)菌、酵母菌、真菌或高級真核生物(包括所有動物和植物)的蛋白質(zhì)提取(如參見Watson，Nucl.Ac.Res.125145-5164(1984))。更優(yōu)選的是來自昆蟲源蛋白的分泌信號序列，如那些來自Hyalophoracecropia的殺菌肽B(vanHofster等，PNAS，822240-2243(1985))，來自煙草天蛾(Manducasexta)的蛻殼激素(Horodyski等，PNAS，868123-8127(1989))。同樣優(yōu)選的是與蝎毒自然關(guān)聯(lián)的分泌信號序列，這可以通過mRNA，cDNA或基因DNA的分析來確定。更優(yōu)選的是AaIT的天然分泌信號序列(Bougis等，《生物學(xué)化學(xué)雜志》[J.Biol.Chem.]，26419259-19265(1989))。重組微生物毒素可以被表示為毒素的功能衍生物。毒素的“功能衍生物”是一種具有生物活性的化合物(或是功能上的或是結(jié)構(gòu)上的)，大體上與毒素的生物活性相似。術(shù)語“功能性衍生物”意指包括分子的“片段”、“變體”、“相似物”或“化學(xué)衍生物”。如毒素的分子的“片段”就是指分子的任何多肽子集合。如毒素的分子的“變體”就是指在結(jié)構(gòu)和功能上不是與整個分子就是與它的片段大體上相似的一種分子。如果兩個分子在結(jié)構(gòu)上大體相似或如果兩個分子擁有相似的生物活性，那么就說這個分子與另一個分子大體上相似。因此，只要兩個分子具有相似的活性，在此就把它們當(dāng)作那個術(shù)語變體使用，即使一種分子的結(jié)構(gòu)不能在另一個分子中找到，或即使氨基酸殘余的序列不相同。如毒素的分子的“相似物”就是指分子在功能上不是與整個分子就是與它的片段大體上相似。在此處使用時，當(dāng)分子包含不是正常分子的一部分的額外化學(xué)部分時，該分子被說成是另一個分子的“化學(xué)衍生物”。這個部分可以改善分子的溶解性、吸附性、生物半衰期等。能夠調(diào)節(jié)這些效果的部分公開于Remington′sPharmaceuticalSciences(1980)中。耦聯(lián)這個部分到一個分子的步驟在技術(shù)上是眾所周知的。通常，毒素(或這些毒素)的表達(dá)包括足以指導(dǎo)RNA合成開始的啟動子區(qū)。一個桿狀病毒啟動子基因是編碼多角體蛋白的基因，因?yàn)槎嘟求w蛋白質(zhì)是已知的高度表達(dá)的真核生物基因，不過也可以使用其它啟動子和雜合啟動子的序列，例如p10。表達(dá)一個毒素的重組桿狀病毒可以通過本領(lǐng)域已知的方案來制備(例如Tomalski等，美國專利號5,266,317，由來自昆蟲寄生螨的神經(jīng)毒素的作例證；McCutchen等，《生物學(xué)技術(shù)》[Bio/Technology)，9，848-854(1991)和Maeda等，“重組桿狀病毒表達(dá)的昆蟲特異性神經(jīng)毒素的殺蟲效果”，《病毒學(xué)》[Virology]，184，777-780(1991)，說明了表達(dá)AaIT的重組桿狀病毒的構(gòu)建)。能夠表達(dá)兩個不同的毒素的單一桿狀病毒的制備，可以通過類似于下列的方案來完成Belayev和Roy，《核酸研究》[NucleicAcidResearch]，215，1219-1223(1993)；Wang等，《基因》[Gene]，100，131-137(1991)，作適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。實(shí)施例1闡明了這一類似的方案。實(shí)施例1使用標(biāo)準(zhǔn)分子克隆技術(shù)可以把兩個昆蟲毒素基因克隆入轉(zhuǎn)移載體如PacUW51P2中。這種轉(zhuǎn)移載體是苜蓿銀紋夜蛾(AcNPV)多角體蝗蟲基的載體，該載體包含一前一后插入的AcNPVp10啟動子和SV40轉(zhuǎn)錄終止信號的拷貝。該拷貝在多角體基因啟動子的上游，但是以相反的方向。這會有利于在多角體啟動子控制下在BamHI位點(diǎn)維持一個外來基因編碼區(qū)域，以及在p10啟動子控制下在BglII克隆位點(diǎn)維持第二個外來基因編碼區(qū)域。因此，產(chǎn)生的重組病毒表達(dá)兩個外來蛋白質(zhì)。由此制備的重組AcNPV可以通過繁殖草地貪葉蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞(Sf21)而分離，而Sf21是通過鈣沉淀而與重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的。多角體感染的細(xì)胞可以在感染后被鑒別和收集，重組病毒噬斑可以通過篩選純化。通過標(biāo)準(zhǔn)方案純化重組病毒，得到的結(jié)果進(jìn)行純的重組培養(yǎng)并貯存，如在4℃和-80℃。標(biāo)準(zhǔn)方案例如描述于O′Reilly，Miller和Luckow的《桿狀病毒表達(dá)載體，實(shí)驗(yàn)室手冊》[BaculovirusExpressionVectors，ALaboratoryManual)。實(shí)施例2四種不同昆蟲毒素對兩種不同昆蟲和小鼠的活性已經(jīng)測定(因?yàn)閺膫兿矚g使用對哺乳動物作用很小或沒有影響的昆蟲毒素)。通過已確立的方法，這些毒素已從各自原生毒液中純化出來。通過Reed和Muench的方法(1938)已經(jīng)測定它們對老鼠、麗蠅幼蟲和鱗翅目昆蟲的毒性。表2表明毒素對昆蟲和小鼠的活性，以50％終點(diǎn)計(各自的麻痹或致死劑量PU50，LD50)。毒素對于麗蠅幼蟲的PU50值與以前已經(jīng)發(fā)表過的結(jié)果一致(Zlotkin等，《生物化學(xué)》[Biochim.]，53，1075-1078(1971)；和Eitan等，《生物化學(xué)》[Biochem.]，29，5941-5947(1990))。這些毒素對于鱗翅目煙芽夜蛾幼蟲的毒性和它們對?；页嵋苟暧紫x的毒性相差不大。LqhαIT對小鼠(SwissWebster)表現(xiàn)較高的毒性，但其它毒素對哺乳動物無毒性(3μg/gb.w注入皮下沒有效果，與哺乳動物毒素AaHII的LD50-0.018μg/20gb.w相反(DeLima等，1986)。毒素LqhIV和LqhVI是值得考慮的，因?yàn)長qhIV是從蝎毒中分離出來的至今最有效力的鱗翅目毒素而毒素LqhVI有微弱的哺乳動物毒素。表2</tables>a.25-40只麗蠅幼蟲分別被注入每一種毒素(三次重復(fù))并測定PU50。當(dāng)注射后立即導(dǎo)致收縮性麻痹時測定興奮性毒素AaIT、LqhVI和LqhIT3的PU50。在注射后軟弱麻痹5分鐘時測定抑制性毒素LqhIT2的PU50。在注射后延遲和維持收縮性麻痹5分鐘時測定α昆蟲毒素LqhαIT和LqhIV的PU50。b.25-40只鱗翅目幼蟲分別被注入每一種毒素(三次重復(fù))，并測定經(jīng)注射后24小時沒有能力移動或當(dāng)掀翻它沒有能力翻轉(zhuǎn)回來時的PU50。c.8只老鼠(兩次重復(fù))皮下注射，在注射后24小時測定對小鼠的LD50。實(shí)施例3同時注入毒素的組合，并測定毒性，結(jié)果概括于表3中。毒性組合包括相應(yīng)于每種毒素的一個PU50單位的量及其稀釋度。不在同一結(jié)合點(diǎn)相互競爭且在其藥理學(xué)上有差異的一對毒素是增效的。如表3中所示，協(xié)同的程度不僅取決于毒素的組合，而且取決于試驗(yàn)動物。表3</tables>a.25-40只麗蠅幼蟲每一只被注入組合毒素(三次重復(fù))，在注射后一分內(nèi)幼蟲迅速萎縮時測定PU50。b.25-40只鱗翅目幼蟲每一只被注入組合毒素(三次重復(fù))，并測定經(jīng)注射后24小時沒有能力移動或當(dāng)掀翻它沒有能力翻轉(zhuǎn)回來時的PU50。c.8只小鼠(兩次重復(fù))皮下注射，在注射后24小時測定對小鼠的LD50。*由一定數(shù)量的毒素蛋白(以各種稀釋度使用1∶1比率的毒素)所產(chǎn)生的效果與每一種毒素單獨(dú)的PU50相比較來評價效力。如表3中闡明的，大于單一效力的組合是大于增強(qiáng)的劑量反應(yīng)。因此，這些組合增加了殺蟲率，也闡明了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。實(shí)施例4實(shí)施本發(fā)明時，要防治的害蟲是用表達(dá)這些重組桿狀病毒來處理(和/或處理其地點(diǎn))。在這個例子中，表達(dá)兩種不同組合的毒素的兩種病毒的組合施用，與應(yīng)用每一個病毒單獨(dú)施用相比較，顯示出減少殺死昆蟲宿主所需的時間。因此，如表4所示，組合施用重組AcAaIT和重組AcLqhαIT會大大減少殺死時間。表4致死時間(LT)是在三齡煙芽夜蛾幼蟲對AcAaIT(10000PIB′S)、AcLqhαIT(10000PIB′S)和AcAaIT(5000PIB′S)與AcLqhαIT(5000PIB′s)的組合施用的響應(yīng)的基礎(chǔ)上獲得的。將小的食物塞分別放置于微量滴定盤的各個小孔中，同時接入任何一種相應(yīng)的病毒。把三齡煙芽夜蛾幼蟲加到盤上并保持27℃。每隔5-10分種記錄死亡率。用概率分析程序分析致死時間。因此，表4的數(shù)據(jù)是用致死時間(LT)表示的對殺死速率的研究，且類似的方法可以用來確定致死劑量，而致死劑量大概會有主要的經(jīng)濟(jì)重要性。例如，有了50％幼蟲死亡的致死時間，可見，實(shí)施本發(fā)明方法中的毒素組合與施用單個重組體相比，大約減少12％-18％殺死宿主幼蟲所需要的時間。當(dāng)人們認(rèn)為與野生型AcNPV相比較，使用重組AcAaIT的處理代表大約減少40％殺死宿主幼蟲所需要的時間時，可見，本發(fā)明的實(shí)施造成基本上減少昆蟲取食損害且明顯減少被損傷的植物。另外，用重組微生物感染的幼蟲，典型的是在死亡前數(shù)小時，開始顯示麻痹特征且停止取食。這就進(jìn)一步增加了本發(fā)明方法的實(shí)際殺蟲效果。實(shí)施例5LqhIV和LqhVI的純化蝎子(L.quinqestriatushebraeus)的毒液是從Sigma(USA)獲得的。凍干的L.quinqestriatushebraeus毒液(50mg)于2ml10mMpH＝6.4的乙酸銨中懸浮并勻漿。在27000g下離心20分鐘去除不溶物質(zhì)。收集上清液并且將粒狀沉淀重新懸浮于另外的2ml10mMpH＝6.4的乙酸銨中，勻漿并再次離心。此提取法做4次，以期最大量地從毒液中提取蛋白質(zhì)。把所有離心過程的上清液收集起來，裝在陽離子交換柱上(10ml的CM-52)并用線性梯度為0.01-0.5MpH＝6.4的乙酸銨在流速為10ml/hr下洗脫。在280nm監(jiān)測吸光度且相應(yīng)地收集峰值。來自陽離子交換色譜的級分CM-III和CM-VI進(jìn)一步在RP-HPLC的VydacC4柱上純化。從CM-VI上純化LqhIV可依照以下步驟緩沖液A是5％的ACN和0.1％的TFA，緩沖液B是95％的ACN和0.1％的TFA。柱子用緩沖液A平衡，并用線性梯度為0-60％的緩沖液B洗脫70分種，流速為0.6毫升/分種。在214nm監(jiān)測吸光度且相應(yīng)地收集峰值，從CM-III純化LqhVI可依照以下步驟緩沖液A是5％的ACN和0.1％的HFBA，緩沖液B是95％的ACN和0.1％的HFBA。柱子用緩沖液A平衡并用線性梯度為0-90％的緩沖液B洗脫105分種，流速為0.6毫升/分種。在214nm監(jiān)測吸光度且相應(yīng)地收集峰值。收集洗脫的級分，并測試其活性(表2)和純度。毒素的純度LqhIV和LqhVI的均一性和純度用FreeSolutionCapillaryElectrophoresis測試(AppliedBiosystemsModel270A)。用20mMpH＝2.9的檸檬酸鈉使毛細(xì)管平衡且使用真空裝載樣品(0.02mg/ml蛋白質(zhì))2秒鐘。流動緩沖液是20mMpH＝2.9的檸檬酸鈉，電壓力為20KV。序列測定使用已經(jīng)確立的方法(Fernandez等，《蛋白質(zhì)化學(xué)的技術(shù)》[TechniquesinProteinChemistry]，第5卷，第215頁)，把每種毒素20μg還原和羧甲基化。使用HP序列分析儀，通過自動化Edman降解，測定N-末端的序列。使用內(nèi)蛋白酶Asp-N消化還原的和羧甲基化的LqhIV，產(chǎn)生肽。在使用聚合柱的微孔HPLC(UltrafastMicroprotein分析儀-MichromBioResourcesInc.)上分離消化的肽。緩沖液A是5％的ACN和0.1％的TFA，緩沖液B是95％的ACN和0.1％的TFA。柱子用緩沖液A平衡，并用線性梯度為0-50％的緩沖液B洗脫50分種，流速為0.05毫升/分種。在214nm監(jiān)測吸光度且相應(yīng)地收集峰值。為了確定這種毒素的完整氨基酸序列，對肽P2進(jìn)行測序。實(shí)施例6結(jié)合方案昆蟲神經(jīng)元膜的制備昆蟲神經(jīng)元組織的所有解剖和制備都是在如下組份的冷緩沖液中進(jìn)行的0.25M甘露醇、10mMpH＝7.4的EDTA、5mMHEPES(用Tris調(diào)至pH為7.4)、50μg/ml苯甲基磺酰氟、1μM胃蛋白酶抑制劑A、1mM碘乙酰胺和1mM1，10-菲咯啉(1，10-phenantroline)。昆蟲神經(jīng)組織在冰冷緩沖液中解剖和勻漿，碎片通過1000g離心分離10分鐘去除。上清液在27000g下離心45分鐘并收集膜(P2)。P2懸浮于緩沖液中且調(diào)節(jié)至10％Ficoll(在緩沖液中)，并在10000g離心75分鐘。收集所產(chǎn)生的代表富含突觸體碎片的漂浮表皮，接著用低滲透壓介質(zhì)(5nMTris-HClpH＝7.4、1mMEDTA、50μg/ml苯甲基磺酰氟、1μM胃蛋白酶抑制劑A、1mM碘乙酰胺和1mM1，10-菲咯啉)處理，形成膜小泡。這種膜小泡在使用前經(jīng)27000g離心分離45分鐘后，收集在少量解剖緩沖液內(nèi)，并在-80℃貯藏。毒素的放射性碘標(biāo)記毒素由用0.5毫居里無載體Na125I(-0.3nmol)(Amersham)和5毫克(～0.7nmol)毒素的iodogen(PierceChemicalCo.，Rockville，MD)碘化。此單碘化毒素在使用BeckmanUltraporeC3RPSC柱(4.6×75毫米)的HPLC上純化，得到的級分用流速為0.5毫升/分鐘，梯度為10-80％的溶劑B(溶劑A＝0.1％TFA，溶劑B＝50％ACN，50％2-丙醇和0.1％TFA)洗脫。單碘化毒素的洗脫在天然毒素的峰(大約28％的溶劑B)之后為放射性蛋白質(zhì)的第一個峰(大約30％的溶劑B)。依據(jù)125I的特異放射性估計放射性同位素標(biāo)記的毒素的濃度和相應(yīng)于2424dpm/fmol單碘化毒素。結(jié)合試驗(yàn)競爭結(jié)合試驗(yàn)是在標(biāo)記毒素的恒定濃度存在下，在平衡的條件下使用增加未標(biāo)記毒素濃度來進(jìn)行。所有結(jié)合試驗(yàn)的分析是使用迭代計算機(jī)程序LIGAND(P.J.Munson和D.Rodbard，由G.A.McPherson改進(jìn)，1985)進(jìn)行的。昆蟲膜小泡懸浮于含有0.13M膽堿鹽酸鹽、1mMEDTApH＝7.4、20mMHEPES/TrispH＝7.4和5mg/mlBSA的結(jié)合介質(zhì)中。接著與毒素溫育一小時，此反應(yīng)混合物用2ml冰冷洗滌緩沖液(150mM膽堿鹽酸鹽、5mMHEPES/TrispH＝7.4、1mMEDTApH＝7.4和5mg/mlBSA)稀釋并在真空下用GF/F過濾器(Whatman，U.K.)過濾，接著每一次用2ml的洗滌緩沖液再沖洗過濾器兩次。在1μM未標(biāo)記的毒素存在下，測定非特異性毒素結(jié)合。實(shí)施例7合成基因的構(gòu)建(圖1，SEQIDNO1)采用一個桿狀病毒的優(yōu)選密碼子使用把一個毒素的蛋白質(zhì)序列變換成一個核苷酸序列。毒素基因與前導(dǎo)序列的核苷酸序列(家蠶素，天然前導(dǎo)序列或其它)和適當(dāng)?shù)南拗泼肝稽c(diǎn)被用來設(shè)計和合成寡核苷酸的5個互補(bǔ)對。通過使用外部寡核苷酸作為引物的PCR，使寡核苷酸被磷酸化、退火、連接和擴(kuò)增。PCR產(chǎn)品被平端連接入PCRscript質(zhì)粒，并通過測序證實(shí)正確的序列。BamHI限制片斷在一個桿狀病毒啟動子作用下，從此克隆入一個桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒中獲救(P10，多角體蛋白，Basic，IE1等)。一個包括基因的正確序列和前導(dǎo)序列的質(zhì)粒通過測序確定。使用產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移載體和標(biāo)準(zhǔn)的程序構(gòu)建出一個表達(dá)毒素的重組病毒。表達(dá)AaIT和LqhIV的病毒的構(gòu)建家蠶素的前導(dǎo)序列和編碼毒素LqhIV的基因如上所述被設(shè)計和合成。確定正確序列，并將基因克隆入已包含AaIT基因的雙表達(dá)的轉(zhuǎn)移載體。pAcUW51P2轉(zhuǎn)移載體是一有兩個克隆位點(diǎn)的多角體蛋白陽性載體，Bg1II位點(diǎn)和有家蠶素的前導(dǎo)序列的LqhIV基因克隆入BamHI位點(diǎn)。使用Lipofectin程序，將Sf21細(xì)胞用所得的轉(zhuǎn)移載體和傳染病毒顆粒共轉(zhuǎn)染。重組病毒在標(biāo)準(zhǔn)噬菌斑試驗(yàn)中被選作一個多角體蛋白陽性表現(xiàn)型。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)f21細(xì)胞用重組病毒AcAaLq接種。從病毒感染細(xì)胞中得到的蛋白質(zhì)提取液在15％SDS-PAGE凝膠上分離并隨后電洗脫到硝化纖維素膜上。膜用AaIT和LqhIV抗體探查，結(jié)合的抗體使用兔子IgGHRP共軛體檢測。綜上所述，依據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)出來的遺傳工程處理過的殺蟲微生物，可應(yīng)用于防治各種害蟲。在此運(yùn)作中，可以應(yīng)用單一的表達(dá)許多種神經(jīng)毒素的重組病毒。通過選擇作用在相同細(xì)胞通道(典型的鈉通道)但在非重疊位點(diǎn)上的毒素來決定毒素的組合。此外，可采用兩種(或更多)各表達(dá)不同毒素的重組殺蟲微生物。再者，幾種表達(dá)的毒素如已描述的已被選擇出。這些表達(dá)的毒素的組合加速殺死害蟲的速率，其效果遠(yuǎn)非簡單的“加合”所能比。例如，毒素AaIT和LqhαIT的組合使用使麗蠅幼蟲和棉鈴蟲屬幼蟲的致死率增加5-10倍。另外毒素的組合可用于增加對昆蟲組群的選擇性。重組微生物的常規(guī)施用方法(噴霧、彌霧、噴粉、撒施和澆潑)可采用以下劑型如粉劑、粉塵、顆粒，以及如在聚合物中的膠囊。為了使用表達(dá)殺蟲毒素的增效組合的重組微生物，組合物典型地包括惰性載體如粘土、乳糖、脫脂大豆粉和類似的應(yīng)用輔助劑。本發(fā)明上面描述的關(guān)于優(yōu)選的特別實(shí)施方案應(yīng)理解為，描述和實(shí)施例意欲說明和而不限制發(fā)明范圍，其發(fā)明范圍是由所附權(quán)利要求書來限定。權(quán)利要求1.一種防治昆蟲、蜱螨和線蟲類害蟲的方法，包含用至少兩種不同的昆蟲毒素處理所述害蟲或其地點(diǎn)，毒素的來源是至少一種重組微生物或是多種重組微生物，毒素在昆蟲細(xì)胞膜通道有非疊加結(jié)合位點(diǎn)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中毒素的來源是重組昆蟲病毒。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中重組昆蟲病毒的來源是桿狀病毒。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中桿狀病毒是核多角體病毒。5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中桿狀病毒來源于苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)，芹菜夜蛾(Anagraphafalcifera)，黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)，油桐尺蠖(Buzurasuppressuria)，蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)，Helicoverpazea，棉鈴曳(Heliothisarrigera)，Mariestiabrassicae，小菜蛾(Plutellaxylostella)，甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)，?；页嵋苟?Spodopteralittoralis)或斜紋夜蛾(Spodopteralitura)。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中毒素是AaIT、LqhIT2、LqhαIT和LqhIT3神經(jīng)毒素的組合。7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的毒素包含一個JHE突變體。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法，其中害蟲是煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)或麗蠅(blowfly)。9.一種在昆蟲防治中使用的基本上純的昆蟲毒素，具有氨基酸序列SEQ.IDNO1或SEQ.IDNO2。10.一種重組微生物，它在用其感染的昆蟲細(xì)胞中，表達(dá)至少兩種對昆蟲細(xì)胞有毒的外源蛋白質(zhì)，或其功能性衍生物，所述微生物基因組帶有分泌信號序列。11.根據(jù)權(quán)利要求10的重組微生物，其中的微生物是核多角體病毒。12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的重組微生物，其中的至少一種外源蛋白是蝎毒素。13.根據(jù)權(quán)利要求10的重組微生物，其中外源蛋白是從蝎、黃蜂、蝸牛、螨或蜘蛛毒液的遺傳序列編碼中得到的。14.根據(jù)權(quán)利要求10、12或13的微生物，其中桿狀病毒是苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核多角體病毒。15.一種昆蟲防治組合物，包含第一和第二重組桿狀病毒，第一和第二重組桿狀病毒分別表達(dá)第一和第二毒素，第一和第二毒素在昆蟲細(xì)胞膜通道上有非疊加結(jié)合位點(diǎn)。16.一種昆蟲防治組合物，包含一種重組桿狀病毒，它在用其感染的昆蟲細(xì)胞中，表達(dá)多種殺蟲毒素。全文摘要本發(fā)明提供一種加速殺死害蟲如鱗翅目的速率的方法。該方法包含用由至少一種重組微生物表達(dá)的至少兩種不同昆蟲毒素處理害蟲或其地點(diǎn)。已發(fā)現(xiàn),這樣的毒素對,它們彼此之間在相同的結(jié)合位點(diǎn)上無競爭而且在它們藥理學(xué)上有差異,且提供增效防治。優(yōu)選的殺蟲微生物是桿狀病毒。文檔編號C12N15/09GK1185718SQ96194239公開日1998年6月24日申請日期1996年4月30日優(yōu)先權(quán)日1995年5月8日發(fā)明者B·D·漢默克,R·海爾曼,H·莫斯克維茨申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會