專利名稱：西洋參鮮細(xì)胞簡易工業(yè)化生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)技術(shù)，特別是西洋參鮮細(xì)胞組織培養(yǎng)方法。
西洋參(Panax Quinquefolium L.)主產(chǎn)于美國、加拿大、法國，其特點(diǎn)是性涼，味甘微苦，入心、肺、腎徑，有益氣養(yǎng)陰、清熱生津、調(diào)補(bǔ)五臟、大補(bǔ)元?dú)庵π?。栽培西洋參，受土壤、氣候的限制，條件要求高，產(chǎn)量小且生產(chǎn)周期長，生長4年以上才能收獲，價(jià)格昂貴。
在應(yīng)用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)天然藥物方面的研究，國內(nèi)從1964年就已開始，70年代中期昆明植物研究所、醫(yī)科藥物研究所、中國藥科大學(xué)等單位先后進(jìn)行了三分三、人參、三七、紫草、西洋參等組織和細(xì)胞培養(yǎng)研究，其中以三分三、人參較為成功，但主要是藥用成分和藥理活性以及建立高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)細(xì)胞株系的研究，80年代中期，中國藥科大學(xué)在人參(吉林參)鮮細(xì)胞培養(yǎng)方面首次取得成功，并申請(qǐng)了中國專利(CN87102382，2)。繼我國人參組織培養(yǎng)技術(shù)建立以后，前蘇聯(lián)、日本、美國、印度等國也先后開展了這方面的研究，日本在1973年曾有固體培養(yǎng)人參細(xì)胞的報(bào)道，1988年2噸罐大量培養(yǎng)獲得成功之后，于1989年進(jìn)行了20噸罐級(jí)大量培養(yǎng)的生產(chǎn)試驗(yàn)，正處于產(chǎn)品開發(fā)準(zhǔn)備時(shí)期，但到目前為止，國內(nèi)外還未見有關(guān)西洋參鮮細(xì)胞作產(chǎn)品或開發(fā)產(chǎn)品的報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明的目的在于提供一種西洋參鮮細(xì)胞組織培養(yǎng)方法，以實(shí)現(xiàn)西洋參鮮細(xì)胞工業(yè)化生產(chǎn)，彌補(bǔ)栽培西洋參生產(chǎn)周期長，產(chǎn)量小，成本高的缺陷，并提高有效物質(zhì)含量。
本發(fā)明所述的西洋參鮮細(xì)胞的培養(yǎng)生產(chǎn)方法，經(jīng)過以下步驟(1)配制儲(chǔ)備液，儲(chǔ)備液的培養(yǎng)基成分及含量為成 分含量(mg/l) 成分含量(mg/l)硝酸鉀1700-3500 碘化鉀 0.8-1硝酸銨 0-1900 鉬酸鈉0.2-0.3氯化鈣 400-500 硫酸銅 0.02-0.03磷酸二氫鉀170-510 氯化鈷 0.02-0.03硫酸鎂 350-400鹽酸硫銨素B10.7-0.8硫酸錳20-25鹽酸吡哆辛B20.5-0.6硫酸鋅 7-10 甘氨酸2-3
硼 酸 6-8 肌 醇80-100硫酸亞鐵 27-29水解乳蛋白500-1000吲哚乙酸 1.6-2 吲哚丁酸1.6-2激動(dòng)素 0.2-0.8 白 糖 40000-50000乙二胺四乙酸二鈉 38-40(2)裝瓶按7-10克/升比例將瓊脂溶解于熱水中，加入配制好的儲(chǔ)備液，充分?jǐn)嚢韬螅b入瓶中，液體的厚度約為5-7毫米；(3)滅菌密封瓶口，將瓶放入高壓滅菌裝置中，在溫度為115-122℃，壓力1.0-1.2kg/cm2下滅菌20-30分鐘，冷卻后形成固體培養(yǎng)基；(4)接種，培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上，無菌條件下接入西洋參鮮細(xì)胞種源，然后放入培養(yǎng)室靜止暗培養(yǎng)，室內(nèi)溫度控制在24-27℃，30天左右，在固體培養(yǎng)基表層取得西洋參鮮細(xì)胞培養(yǎng)物。每升儲(chǔ)備液可收獲西洋參培養(yǎng)物400-500克(干重25克左右)。
將本發(fā)明西洋參組培方法所生產(chǎn)的西洋參培養(yǎng)物與中國藥品檢驗(yàn)所提供的栽培西洋參標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照，薄層分析，培養(yǎng)物與標(biāo)樣斑點(diǎn)一致，培養(yǎng)物的皂甙含量為13.2％，栽培西洋參含量為8％左右；水溶性總糖含量12-18.3％，高于栽培西洋參；SOD含量為340.7-1022.0U/克·干重；氨基酸總量為14.086％，15種氨基酸的含量如下含量(g/100g)含量(g/100g)天門冬氨酸1.597 異亮氨酸 0.787蘇氨酸 0.669 亮氨酸 1.049絲氨酸 0.766 酪氨酸 0.291谷氨酸 3.050 苯丙氨酸 0.851甘氨酸 0.763 組氨酸 0.765丙氨酸 0.642 賴氨酸 0.910纈氨酸 0.754 精氨酸 1.083蛋氨酸 0.109本發(fā)明生產(chǎn)的西洋參培養(yǎng)物經(jīng)過動(dòng)物藥理毒性試驗(yàn)，隨機(jī)抽取健康小白鼠，按10克體重0.2ml計(jì)量給藥，灌胃10天以上和腹腔注射72小時(shí)以上，均未發(fā)現(xiàn)任何異常反應(yīng)，將心、肺、腎、腸、胃、子宮、睪丸等組織固定病理切片檢查，均未發(fā)現(xiàn)對(duì)組織器官的毒性反應(yīng)。
應(yīng)用植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的西洋參鮮細(xì)胞，不僅有栽培西洋參的藥理活性，而且還具有以下優(yōu)點(diǎn)1.生產(chǎn)周期短，成本低。本發(fā)明是在人工可控條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)西洋參鮮細(xì)胞，每30天左右收獲一次，生產(chǎn)率1∶6，生產(chǎn)周期比栽培西洋參縮短4年，生產(chǎn)成本僅為目前栽培市場售價(jià)的五分之一；2.工藝簡單，見效快。本發(fā)明應(yīng)用生物工程高技術(shù)進(jìn)行無土、無菌、細(xì)胞培養(yǎng)法，生產(chǎn)工藝簡單，在缺少資金和植物培養(yǎng)反應(yīng)器的條件下，可形成規(guī)模生產(chǎn)，具有投資少，見效快，消耗少等特點(diǎn)；3.本方法培養(yǎng)的西洋參鮮細(xì)胞與栽培西洋參相比，除含有較高的皂甙成分，還含有新的多糖化合物、過氧化物歧化酶(SOD)、生物有機(jī)鍺等生理活性物質(zhì)，對(duì)提高機(jī)體免疫功能有較強(qiáng)的生理活性。
4.本發(fā)明培養(yǎng)的西洋參鮮細(xì)胞以其“鮮、嫩、活”的優(yōu)勢，使多種新型生理活性物質(zhì)在制藥醫(yī)療、化妝品、食品、營養(yǎng)保健品等方面有著非常廣闊的開發(fā)前景。
下面提供本發(fā)明的實(shí)施例。
實(shí)施例1在400-500ml玻璃罐頭瓶中，按附表中所列的試劑進(jìn)行稱量，加入一定量水，配制成儲(chǔ)備液；按8克/升標(biāo)準(zhǔn)將瓊脂溶解于熱水中，再加入配好的儲(chǔ)備液，充分?jǐn)嚢韬?，趁熱裝入瓶中，液體厚度為7毫米，待冷卻后形成固體薄層；用聚丙烯薄膜封住瓶口，將瓶放入高壓滅菌鍋中，在溫度118℃±2℃，壓力1.0-1.2kg/cm2下滅菌20分鐘，形成固體培養(yǎng)基；在該固體培養(yǎng)基上接入西洋參鮮細(xì)胞種源，然后放入培養(yǎng)室靜止暗培養(yǎng)，室內(nèi)溫度為25℃±2℃；30天左右，在固體培養(yǎng)基上取得西洋參鮮細(xì)胞培養(yǎng)物。
實(shí)施例2按附表中的試劑劑量進(jìn)行稱量，加水配成儲(chǔ)備液；按8克/升標(biāo)準(zhǔn)將瓊脂溶解于熱水中，再加入配好的儲(chǔ)備液，充分?jǐn)嚢韬笱b入300ml錐形瓶中，液體厚度大致為6毫米左右，待冷卻后形成固體薄膜；用塑料薄膜封住瓶口，在溫度121℃，壓力1.2kg/cm2下滅菌消毒20-30分鐘，形成固體培養(yǎng)基；在固體培養(yǎng)基上，無菌條件接入西洋參鮮細(xì)胞種源，放入培養(yǎng)室靜止暗培養(yǎng)35天，可在固體培養(yǎng)基上取得西洋參鮮細(xì)胞培養(yǎng)物。
實(shí)施例3按附表中所列的試劑劑量進(jìn)行稱量，以后各步驟與實(shí)施例1相同。
附表西洋參鮮細(xì)胞培養(yǎng)基成分表化合物名稱 含量(實(shí)施例1)含量(實(shí)施例2) 含量(實(shí)施例3)硝酸鉀3500mg/l1700mg/l2450mg/l硝酸銨 - 1900mg/l1550mg/l磷酸二氫鉀 510mg/l 250mg/l 175mg/l氯化鈣420mg/l 450mg/l 500mg/l硫酸鎂 400mg/l 350mg/l 370mg/l硫酸亞鐵27mg/l 29mg/l 29mg/l硫酸錳 20mg/l 22mg/l 25mg/l硫酸鋅 86mg/l7mg/l 10mg/l硼 酸 7mg/l8mg/l 6mg/l碘化鉀 0.83mg/l 0.8mg/l 1.0mg/l鉬酸鈉 0.25mg/l 0.3mg/l 0.2mg/l硫酸銅 0.025mg/l 0.03mg/l0.02mg/l氯化鈷 0.025mg/l 0.02mg/l0.03mg/l鹽酸硫銨素B10.7mg/l 0.7mg/l 0.8mg/l鹽酸吡哆辛B60.5mg/l 0.5mg/l 0.6mg/l甘氨酸2.0mg/l 3.0mg/l 3.0mg/l肌 醇 98mg/l 100mg/l 80mg/l水解乳蛋白 1000mg/l 500mg/l 750mg/l吲哚乙酸 2mg/l 1.6mg/l 2mg/l吲哚丁酸 2mg/l 1.6mg/l 2mg/l激動(dòng)素0.2mg/l 0.6mg/l 0.8mg/l白 糖 40000mg/l45000mg/l 50000mg/l乙二胺四乙酸二鈉 38mg/l 40mg/l 40mg/l
權(quán)利要求
1.一種西洋參鮮細(xì)胞簡易工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于經(jīng)過以下步驟(1)配制儲(chǔ)備液；(2)裝瓶按7-10克/升比例將瓊脂溶解于熱水中，加入配制好的儲(chǔ)備液，充分?jǐn)嚢韬?，裝入瓶中；(3)滅菌密封瓶口，將溫度控制在115-122℃，壓力控制在1.0-1.2kg/cm2，滅菌20-30分鐘，冷卻形成固體培養(yǎng)基；(4)接種，培養(yǎng)在制成的固體培養(yǎng)基上，無菌條件下接入西洋參鮮細(xì)胞種源，然后放入培養(yǎng)室靜止暗培養(yǎng)，28-35天，在固體培養(yǎng)基表層收取西洋參培養(yǎng)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的西洋參鮮細(xì)胞簡易工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于儲(chǔ)備液的成分及含量如下成 分 含量(mg/l)成 分 含量(mg/l)硝酸鉀 1700-3500 碘化鉀 0.8-1硝酸銨 0-1900 鉬酸鈉0.2-0.3氯化鈣 400-500 硫酸銅 0.02-0.03磷酸二氫鉀 170-500 氯化鈷 0.02-0.03硫酸鎂 350-400 鹽酸硫銨素B10.7-0.8硫酸錳 20-25 鹽酸吡哆辛B20.5-0.6硫酸鋅7-10 甘氨酸2-3硼 酸 6-8 肌 醇 80-100硫酸亞鐵 27-29水解乳蛋白500-1000吲哚乙酸 1.6-2 吲哚丁酸1.6-2激動(dòng)素 0.2-0.8 白 糖40000-50000乙二胺四乙酸二鈉 38-40
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的西洋參鮮細(xì)胞簡易工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于接種后培養(yǎng)溫度控制在24-27℃暗培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種西洋參鮮細(xì)胞的簡易工業(yè)化生產(chǎn)方法，該方法包括以下步驟配制儲(chǔ)備液，裝瓶，滅菌，制成固體培養(yǎng)基，在無菌條件下接入西洋參鮮細(xì)胞種源，放入培養(yǎng)室靜止暗培養(yǎng)，30天左右可在固體培養(yǎng)基上收獲西洋參鮮細(xì)胞培養(yǎng)物。本發(fā)明提供的工藝方法簡單，生產(chǎn)周期短，成本低。利用該方法獲得的西洋參鮮細(xì)胞除含有較高的皂甙成分，不含有新的多糖化合物，SOD，生物有機(jī)鍺等生物活性物質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1135528SQ94119510
公開日1996年11月13日 申請(qǐng)日期1994年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月21日
發(fā)明者劉家和 申請(qǐng)人:廣州市天河區(qū)嘉蘭德生物工程有限公司