分泌抗玉米褪綠斑駁病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分泌抗玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。用純化的玉米褪綠斑駁病毒（MCMV）的病毒粒子為抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、克隆，獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗MCMV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株24F6，其保藏號(hào)為CGMCC No.9339。雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10-8，抗體類型及亞類為IgG1，kappa鏈。該株單抗僅與MCMV有特異性反應(yīng)。用24F6單抗建立的檢測(cè)傳毒介體薊馬和玉米植物及種子中MCMV的免疫學(xué)檢測(cè)方法。雜交瘤細(xì)胞株24F6及單抗的獲得和相關(guān)血清學(xué)檢測(cè)方法的建立為該病毒病的檢疫、檢測(cè)、預(yù)測(cè)及科學(xué)防控提供技術(shù)支撐。
CGMCC No9339
20140703
【專利說明】 分泌抗玉米褪綠斑駁病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種分泌抗玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]玉米裡綠斑駁病毒(13126 0^101-01:10 11101:1:161017)屬于番爺叢矮病毒科玉米褪綠斑駁病毒屬，是危害玉米的重要病毒，1974年10^首次在秘魯被發(fā)現(xiàn)因感病植株癥狀表現(xiàn)為葉片逐漸失綠、變黃、整片葉表現(xiàn)呈黃綠相間的斑駁條斑，故命名為玉米褪綠斑駁病毒。寄主被侵染后，癥狀表現(xiàn)為壞死斑駁、卷曲、葉尖壞死、矮化、植株死亡等。自然侵染作物導(dǎo)致?lián)p失10% — 15%，試驗(yàn)玉米損失達(dá)59%，與玉米裡綠矮縮病毒(13126 0^101-01:10 或小麥線條花葉病毒(他一&七8廿6成11108810 ^11*118，1817)或甘鹿花葉病毒(3(?^)共同侵染損失高達(dá)100 %。該病毒已被列入我國(guó)新修訂的禁止進(jìn)境的有害生物名錄之中。2010年報(bào)道我國(guó)已在云南、四川發(fā)生流行。玉米褪綠斑駁病毒主要寄主是玉米，還可侵染小麥、大麥、燕麥、高粱等多達(dá)15?19種植物。該病毒可以種子傳毒，也可機(jī)械摩擦傳毒，也可以由傳毒介體薊馬傳播。首次在秘魯玉米病株上發(fā)現(xiàn)，然后在北卡羅來納州首府羅利市發(fā)生，直到1976年在堪薩斯州暴發(fā)，造成嚴(yán)重危害。據(jù)當(dāng)時(shí)堪薩斯州作物和家畜服務(wù)中心預(yù)測(cè)，玉米褪綠斑駁病毒造成玉米產(chǎn)量的損失達(dá)5651^/111112，而玉米平均產(chǎn)量為62801? /化2。
[0003]^病毒粒子為等軸對(duì)稱二十面體(1=3),用磷鎢酸負(fù)染色直徑約3011%用醋酸鈾負(fù)染色直徑約33=%無(wú)包膜，粒子外形呈六邊形。基因組全長(zhǎng)4473恥，病毒基因組共有四個(gè)閱讀框，編碼蛋白大小分別是:31.61(0,501(1),8.91(0,25.11(0。
[0004]為了掌握玉米褪綠斑駁病毒(10^)病害在我國(guó)的發(fā)病危害狀況，強(qiáng)化我國(guó)玉米褪綠斑駁病毒病早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警，科學(xué)指導(dǎo)防控，急需建立檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒病的高通量檢測(cè)方法，而目前沒有這種高通量的檢測(cè)方法，僅用低效率的電鏡觀察、奶士⑶方法、核酸電泳等方法進(jìn)行小樣本檢測(cè)。本發(fā)明提純的10^病毒為抗原通過雜交瘤技術(shù)制備了 1株分泌抗姑圓的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞24？6，以制備的單抗為核心可建立檢測(cè)10^的高通量的血清學(xué)方法及其試劑盒，從而為我國(guó)玉米褪綠斑駁病毒病檢測(cè)、檢疫、早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警、科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。
[0006]分泌抗玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株24？6，它能分泌抗玉米褪綠斑駁病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株24？6于2014年7月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為⑶IX ^0.9339。
[0007]抗玉米褪綠斑駁病毒的單克隆抗體腹水間接此效價(jià)達(dá)10—8，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈,該單克隆抗體能與玉米褪綠斑駁病毒的衣殼蛋白有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，能檢測(cè)出帶毒種子及傳毒介體薊馬體內(nèi)的玉米褪綠斑駁病毒。
[0008]抗玉米褪綠斑駁病毒的單克隆抗體僅與玉米褪綠斑駁病毒有特異性免疫反應(yīng)，而與黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、煙草花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、水稻矮縮病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番爺斑萎病毒、建蘭花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、南方水稻黑條矮縮病毒、小麥線條花葉病毒、甘蔗花葉病毒均不發(fā)生免疫反應(yīng)。
[0009]抗玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體在抗玉米褪綠斑駁病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0010]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果:1)提供的雜交瘤細(xì)胞株24F6分泌抗玉米褪綠斑駁病毒特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫學(xué)方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒；2)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備；3)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間作物、帶毒種子和傳毒介體薊馬中的玉米褪綠斑駁病毒的檢測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是dot-ELISA方法檢測(cè)MCMV的靈敏度分析。

【具體實(shí)施方式】
[0012]分泌抗玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株24F6于2014年7月3日保藏于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編:100101，保藏號(hào)為CGMCC N0.9339，它能分泌抗玉米褪綠斑駁病毒的單克隆抗體。
[0013]抗玉米褪綠斑駁病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_8，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈,該單克隆抗體能與玉米褪綠斑駁病毒的衣殼蛋白有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，能檢測(cè)出帶毒種子及傳毒介體蚜蟲體內(nèi)的玉米褪綠斑駁病毒。
[0014]抗玉米褪綠斑駁病毒的單克隆抗體僅與玉米褪綠斑駁病毒有特異性免疫反應(yīng)，而與黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、煙草花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、水稻矮縮病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番爺斑萎病毒、建蘭花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、南方水稻黑條矮縮病毒、小麥線條花葉病毒、甘蔗花葉病毒均不發(fā)生免疫反應(yīng)。
[0015]抗玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0016]本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株24F6能大量分泌抗玉米褪綠斑駁病毒單抗，且其分泌的單抗特異性強(qiáng)、效價(jià)高、穩(wěn)定性好。以該單抗為核心建立的檢測(cè)MCMV的高通量的血清學(xué)方法及其檢測(cè)試劑盒可成功應(yīng)用于田間MCMV的檢測(cè)，從而為我國(guó)玉米褪綠斑駁病毒病早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警、檢測(cè)檢疫和科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0018]一、雜交瘤細(xì)胞的獲得及其單克隆抗體的制備
1.免疫原及檢測(cè)抗原的制備
用下面的操作步驟提純1(1^病毒粒子:
1)將大研缽和組織攪拌器預(yù)冷；
2)稱取5008玉米病葉，每1008病葉中加入1)?7.5的0.51磷酸鹽緩沖液(即 ？8緩沖液)20001 (含0.011版1-201'八和0.1%巰基乙醇),勻漿2分鐘后用雙層尼龍紗布過濾，濾液離心(600017111111, 20111111)去植物組織殘潘；
3)所得上清液邊攪拌邊滴加2.5% 11-1^011 乂-100，4% ？26 (分子量為6000)和0.111101/1 ^01, 41攪拌處以上；
4)離心(11000:^/111111，15111111)得沉淀；
5)沉淀用邱7.5的0.51 ？8 (含0.011 %012和0.51脲)充分洗滌，離心(6000^7111111, 15-11)后吸出上清置于離心管，沉淀再洗滌，離心反復(fù)3次；
6)合并上清液，超速離心(3300017111111,1000111)所得沉淀懸浮后離心(800017111111,15111111)；
7)合并上清液再超離心(3300017111111,100111111),離心管底部加有20%-30%鹿糖墊；
8)所得沉淀用邱7.5的0.51 ？8 (含0.011 %012?懸浮，懸浮液即為病毒提純液；
9)用電子顯微鏡觀察提純樣品，發(fā)現(xiàn)大量高純度的玉米褪綠斑駁病毒粒子。
[0019]2.免疫動(dòng)物
用此,提純病毒免疫四周齡體重18-208 8^18/0雌性小鼠。即此靈提純病毒粒子35147只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0.2“每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0.201每只，過3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0020]3.細(xì)胞融合
取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞($2/0)按10:1的比例，在無(wú)血清的尺?11-1640培養(yǎng)基中混勻，1500印111離心5111111，去除培養(yǎng)基，用50 %卿￡1，分子量1500)作為融合劑，在371下水浴下加入101，使其融合2-11,用無(wú)血清的1？？11-1640培養(yǎng)基終止融合后150011)111離心5111111，沉淀用撤！'培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，371，5 % (1)2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0021]4.雜交瘤細(xì)胞、陽(yáng)性孔的篩選及其克隆
細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用撤I培養(yǎng)基換液一次，第10天用肌培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10%-30%時(shí)，以感染【觀病毒的煙草葉片和提純病毒為抗原包被，用常規(guī)間接方法篩選分泌單抗的陽(yáng)性孔，共獲54個(gè)陽(yáng)性孔。選擇11個(gè)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行有限稀釋法克隆，獲得1株能分泌抗10^的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株24？6。經(jīng)6個(gè)月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株均能良好生長(zhǎng)，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。
[0022]5.單克隆抗體的特異性檢測(cè)
用感染黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、煙草花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、水稻矮縮病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番爺斑萎病毒、建蘭花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、南方水稻黑條矮縮病毒、小麥線條花葉病毒、甘蔗花葉病毒、玉米褪綠斑駁病毒的病葉汁包被ELISA板，以相應(yīng)的健葉提取液作陰性對(duì)照，以感染玉米褪綠斑駁病毒的病葉汁液為陽(yáng)性對(duì)照，用ACP-ELISA法測(cè)定單抗的特異性反應(yīng)。ACP-ELISA方法具體為:上述病毒感染的病葉用液氮研磨成粉末，按1: 30 (w/v,g /mL)加入ELISA包被液研磨后10ul/孔包被ELISA板，4°C過夜或37°C 2小時(shí)，使其吸附于ELISA聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1-10%的脫脂奶粉或1_3% BSA或3_6%牛血清封閉30-60min ;加入適當(dāng)稀釋的單抗10ul/孔，37°C 1-2小時(shí)；PBST洗滌三次后加入10000倍稀釋的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗(Sigma公司)10ul/孔，37°C1-2小時(shí)，PBST洗滌四次后，用PNPP底物顯色，2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD405的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽(yáng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24F6單抗對(duì)MCMV有特異性反應(yīng)，而與黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、煙草花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、水稻矮縮病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番爺斑萎病毒、建蘭花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、南方水稻黑條矮縮病毒、小麥線條花葉病毒、甘蔗花葉病毒和健康植物均無(wú)特異性反應(yīng)。
[0023]6.單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入5-10 X 15個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取I倍體積腹水加2倍體積0.06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水),室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清I小時(shí)，12000rpm離心20min,收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4°C流動(dòng)透析24小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，-70°C保存。
[0024]7.單克隆抗體的類型及亞類鑒定和腹水效價(jià)測(cè)定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C小鼠IgG1、IgG2aUgG2bUgG3^IgM抗體作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果顯示，24F6單抗亞類為IgGUkappa鏈。用常規(guī)間接ELISA方法檢測(cè)單抗腹水效價(jià)，結(jié)果為上述單抗腹水效價(jià)達(dá)到10 一8。
[0025]二、病毒免疫學(xué)檢測(cè)方法及其試劑盒
1.以單抗為核心建立抗原包被ELISA (ACP-ELISA)方法檢測(cè)玉米植物和玉米種子中MCMV病毒的操作步驟:
(1)用0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)按1:30 (w/v, g /mL)倍稀釋的病葉汁液，或I顆玉米種子加I mL 0.05M碳酸鹽緩沖液勻漿或I頭薊馬加10ul后用牙簽搗爛成勻漿液，上述病葉汁液或種子勻漿液或薊馬勻漿液10ul/孔加入ELISA板，以MCMV病葉為陽(yáng)性對(duì)照，健葉為陰性對(duì)照，或非帶毒的種子和帶毒種子分別為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，或非帶毒的薊馬和帶毒的薊馬為為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，37°C 2h，或4°C過夜；
(2)PBST洗滌后用5%脫脂奶粉封閉30min ；
(3)單抗腹水5000倍稀釋后10ul/孔，37°CIh ；
(4)PBST洗滌后加入10000倍稀釋的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗(81^), 100111/ 孔，37。。，1匕；
(5)用？831洗滌后加入硝基磷酸鹽底物100111/孔，室溫30-11；
(6)用肉眼觀察，底物顏色變成黃綠色的孔為陽(yáng)性，或用2001/1氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)00405，以9/心2.1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0026]2.以單抗為核心建立抗原包被￡113八(八⑶-此〗“)方法檢測(cè)傳毒介體薊馬中此,病毒的操作步驟:
(1)用0.051碳酸鹽緩沖液(1)119.6)按1頭薊馬加1001x1后用牙簽搗爛成勻漿液，上述薊馬勻漿液100111/孔加入此板，以非帶毒的薊馬和帶毒的薊馬為為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，37。。2卜，或41過夜；
(2)？881洗滌后用5%脫脂奶粉封閉300111 ；
(3)單抗腹水4000倍稀釋后100111/孔，371比；
(4)^881洗滌后加入10000倍稀釋的冊(cè)？標(biāo)記的羊抗鼠I姊二抗(31卿^0，100111/孔，37。。，1匕；
(5)用？881洗滌后加入XIV底物100111/孔，室溫30—；
(6)用肉眼觀察，底物顏色變成藍(lán)色的孔為陽(yáng)性，或用2001/1硫酸終止反應(yīng)后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)00450，以9/心2.1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0027]檢測(cè)結(jié)果表明該單抗為核心建立的八能檢測(cè)發(fā)表玉米植物、帶毒玉米種子及傳毒介體薊馬中的1(1^。
[0028]方法進(jìn)行靈敏度檢測(cè):
單抗腹水工作濃度為5000倍稀釋，對(duì)病葉作倍比稀釋分別以相應(yīng)稀釋度的健葉汁液作陰性對(duì)照，進(jìn)行上述八⑶-￡113八方法檢測(cè)。結(jié)果表明八⑶-此巧八方法對(duì)1:340000倍稀釋(^, 8/^1)的病葉汁液檢測(cè)仍呈陽(yáng)性反應(yīng)，即對(duì)檢測(cè)病葉的靈敏度可達(dá)到1:340000，表明方法具有高度的靈敏性和可靠性。
[0029]3.(10七-此方法的建立及田間檢測(cè)應(yīng)用
3.1 (10^-2118^檢測(cè)植物中10^方法的建立及其田間樣品檢測(cè)將病葉稱重后用液氮研磨成粉末，按1: 10-30 (.^/^, ^ /1111)^^0.01 11101/1 ？88(邱7.4)后研磨；病汁液5000『卿離心3 取3 ^ 1上清點(diǎn)到硝酸纖維素膜(％)上，同時(shí)設(shè)置健康和感病病葉汁分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照；室溫干燥10-20 %膜浸入到含5%脫脂奶粉的？831'(含0.05% I'界6611-20的0.01 001/1 ？8幻封閉液中室溫封閉30 111111 ；%膜放入適度稀釋的單抗中室溫孵育30-60 111111 ；用？83丁洗膜3-4次，每次3 111111 ；^0膜放入適度稀釋的仙酶標(biāo)記羊抗鼠I姊二抗中室溫孵育30-60 111111； ？881洗膜4-5次，每次3 111111； 66 111咄I和33 111 801？底物⑴抓郵職)加入到10…底物緩沖液(0.1 11101/I 11-18 01,0.1 11101/1 ^01,0.025 11101/1 ^9.5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果。待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時(shí)自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。
[0030]用方陣試驗(yàn)確定檢測(cè)病葉的單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明24？6單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:5000和1:7000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測(cè)姑圓的方法。靈敏度分析表明，當(dāng)煙草葉片稀釋到1:819210倍(界八，時(shí)，以24？6單抗建立的檢測(cè)仍呈現(xiàn)紫色的陽(yáng)性斑點(diǎn)，即其檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1: 819210倍稀釋(圖1)。
[0031]用建立的dot-ELISA方法對(duì)田間疑似發(fā)病樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，123個(gè)檢測(cè)樣品中有8個(gè)樣品產(chǎn)生紫色的陽(yáng)性斑點(diǎn)，陽(yáng)性樣品進(jìn)一步用PCR分析，結(jié)果表明所有的dot-ELISA陽(yáng)性樣品均檢測(cè)到MCMV特異性的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物核酸測(cè)序表明陽(yáng)性樣品感染MCMV。說明該dot-ELISA方法能準(zhǔn)確、可靠地用于植物樣品中玉米褪綠斑駁病毒的檢測(cè)。
[0032]2.2 dot-ELISA檢測(cè)薊馬體內(nèi)MCMV方法的建立及其田間樣品檢測(cè)
單頭薊馬放入0.5 mL的eppendorf的離心管中，并加入20 μ L PBS (0.01mol/L,PH7.4)，用牙簽搗爛蟲子后，取3 UL上清點(diǎn)到NC膜上，膜干燥、單抗孵育、二抗孵育、顯色步驟與dot-ELISA檢測(cè)植物中MCMV方法相同，不同的只是二抗為適度稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，顯色底物是HRP的顯色底物，即TMB顯色底物。同時(shí)設(shè)非帶毒和帶毒的薊馬作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。
[0033]用方陣試驗(yàn)確定檢測(cè)蚜蟲的dot-ELISA單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明制備單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:4000和1:5000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測(cè)薊馬體內(nèi)MCMV的dot-ELISA方法，檢測(cè)結(jié)果表明攜帶MCMV的薊馬呈現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，而無(wú)毒的薊馬沒有任何顯色反應(yīng)，即建立的dot-ELISA方法能特異性地檢測(cè)薊馬體內(nèi)的MCMV。
[0034]用建立的dot-ELISA方法對(duì)人工飼喂獲毒的和無(wú)毒的薊馬進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，123頭薊馬檢測(cè)樣品中有54頭產(chǎn)生藍(lán)色的陽(yáng)性斑點(diǎn)，而無(wú)毒的薊馬沒有產(chǎn)生任何藍(lán)色斑點(diǎn)。陽(yáng)性樣品進(jìn)一步用RT-PCR分析，結(jié)果表明所有的dot-ELISA陽(yáng)性樣品均檢測(cè)到MCMV特異性的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物核酸測(cè)序表明陽(yáng)性樣品感染MCMV。說明該dot- ELISA方法能準(zhǔn)確、可靠地用于薊馬樣品中MCMV的檢測(cè)。
[0035]4玉米褪綠斑駁病毒dot-ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)玉米植物及其種子
1)試劑盒主要成分:
MCMV單克隆抗體I管0.2 ml
AP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗I管0.1 ml
HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗I管0.1 ml
NBT/BCIP底物各I瓶分別為2 ml和Iml
TMB底物I瓶10 ml
陽(yáng)性對(duì)照I (含MCMV葉片汁液)I管2 ml
陰性對(duì)照I (健康玉米葉片汁液)I管2 ml
陽(yáng)性對(duì)照2 (帶毒MCMV薊馬勻漿液)I管2 ml
陰性對(duì)照2 (非帶毒薊馬勻漿液)I管2 ml
抗體稀釋液(10X) I瓶80ml
以上試劑均保存于4°C下硝酸纖維素膜(NC) 10張
2)玉米病株及玉米種子樣品檢測(cè)的操作步驟:
a.將植物葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10?30 (w/v, g /mL)加入0.01 mol/L PBS (pH7.4)后研磨勻衆(zhòng),或每顆玉米種子加入ImL 0.01 mol/L PBS (pH7.4)后研磨勻漿； 13.勻衆(zhòng)液5000印!]!離心3 111111 ；
0.取3 上清點(diǎn)到％上，同時(shí)設(shè)置健康和感病煙草葉汁分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，或非帶毒的玉米種子和帶毒的玉米種子為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，室溫干燥10-20
(1.%膜浸入到含5%脫脂奶粉的？83丁 (含0.05% I'界6611-20的0.01 11101/1 ？8幻封閉液中室溫封閉30 111111 ；
6.%膜放入1:5000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60 111111 ；
1用？831洗膜3-4次，每次3 111111； %膜放入1:7000稀釋的八？酶標(biāo)記羊抗鼠I姊二抗中室溫孵育30-60 111111；
8- 洗膜4-5次，每次3 111111 ； 66 ^ [他I和33 ^ I 801？底物加入到10 “底物緩沖液(0.1 11101/1 11-18 01,0.1 11101/1 ^01,0.025 11101/1 1甙1、邱9.5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
11.待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯(紫色),而陰性沒有任何顯色時(shí)自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。
[0036]3)檢測(cè)薊馬樣品的操作步驟:
￡1.單頭薊馬放入0.5 III[的6卯611(101^的離心管中，并加入10 11 I ？88 (0.0111101/1,1^7.4),用牙簽搗爛蟲子后，取3 111上清點(diǎn)到％膜上，同時(shí)設(shè)置帶毒和非帶毒的薊馬分另I」作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，室溫干燥10-20 ；
匕％膜浸入到含5%脫脂奶粉的？83丁 (含0.05% I'界6611-20的0.01 11101/1 ？8幻封閉液中室溫封閉30 111111 ；
0.^0膜放入1:4000倍稀釋的單抗中室溫孵育30?60 111111 ；
(1.用？83丁洗膜3?4次，每次3 0111 ； %膜放入1:5000倍稀釋的?。〕?？酶標(biāo)記羊抗鼠1^6 二抗中室溫孵育30?60 111111 ；
6.？881洗膜4?5次，每次3 111111 ；膜放入118底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
1待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯(藍(lán)色)，而陰性沒有任何顯色時(shí)自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。
[0037]4)保存及有效期于2?81避光保存，有效期12個(gè)月。
[0038]5)緩沖液配方:
磷酸鹽緩沖液$83,0.01 001/1,邱7.4):
就18 8
1(01 0.2 8^2？04 0.2 8恥2腦4魯12??！2038
疊氮化鈉0.2 8
加蒸餾水950溶解后調(diào)邱至7.4，定容至1000 211“ 洗滌液(0.01 11101/1 ？881?:
1000 1111 0.0111101/1 ？88 中加 0.5 1111 I'界6611-20
￡[13八封閉液:
0.01 001/1 ？831'中加入脫脂奶粉至終濃度5% (秦。
【權(quán)利要求】
1.一種分泌抗玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株24F6，其特征在于能分泌抗玉米褪綠斑駁病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株24F6于2014年7月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.9339。
2.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株24F6分泌的抗玉米褪綠斑駁病毒的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_8，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與玉米褪綠斑駁病毒的衣殼蛋白有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，能檢測(cè)出帶毒種子及傳毒介體薊馬體內(nèi)的玉米褪綠斑駁病毒。
3.如權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株24F6分泌的抗玉米褪綠斑駁病毒的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體僅與玉米褪綠斑駁病毒有特異性免疫反應(yīng)，而與黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、煙草花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、水稻矮縮病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番爺斑萎病毒、建蘭花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、南方水稻黑條矮縮病毒、小麥線條花葉病毒、甘鹿花葉病毒均不發(fā)生免疫反應(yīng)。
4.一種如權(quán)利要求2所述的抗玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體在玉米褪綠斑駁病毒檢測(cè)上的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12N5/20GK104450624SQ201410627333
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】吳建祥, 周雪平 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)