一種高溫酯酶、基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高溫酯酶、基因及其應(yīng)用，從海洋嗜熱菌Geobacillussp.JM6中克隆得到新的酯酶基因，并在E.coli中進(jìn)行表達(dá)和純化，得到重組酯酶；酶學(xué)性質(zhì)研究表明，酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別為60℃和7.5；在100℃條件下處理18h，酶能保持68%活力；37℃條件下，酶在pH5.0~12.0的緩沖液中處理1h，酶仍能保留60%以上的活力；苯甲基磺酰氟（PMSF）可抑制重組酯酶的活性，表明該酶含有在催化機(jī)制中有重要作用的絲氨酸殘基；重組酶對測試使用的洗滌劑、變性劑和有機(jī)溶劑都具有較好的耐受性。該重組酯酶具有優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，同時本發(fā)明也成功地構(gòu)建了含上述新型酯酶基因的重組載體，實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)。
【專利說明】-種高溫酯酶、基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程和酶工程的【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種高溫酯酶、基因及其應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 酯酶廣義上是指具有催化水解酯鍵能力的一類水解酶的統(tǒng)稱，其主要分成兩類： 羧酸酯酶（EC 3. I. I. 1)和脂肪酶（EC 3. I. 1. 3)，而通常所說的酯酶往往指羧酸酯酶，主要 用來催化水解脂肪酸族及芳香族酯類的化合物。一般來說，脂肪酶催化水不溶性、長鏈?；?甘油酯（酰基鏈碳原子數(shù)大于10)的水解及合成，而羧酸酯酶對水溶性、短鏈?；视王?(?；溙荚訑?shù)小于10)的活力較強(qiáng)。作為一種重要的工業(yè)酶類，酯酶可以催化酯水解、 酯合成、酯交換等具有重要應(yīng)用價值的反應(yīng)，并具有良好的區(qū)域選擇性和立體選擇性，廣泛 應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品、能源及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。
[0003] 酯酶普遍存在于動物、植物和微生物中。由于動植物來源有限，生產(chǎn)成本高，使得 其來源的酯酶的應(yīng)用受到了很大程度的限制。微生物酯酶進(jìn)行的催化反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫 和、反應(yīng)介質(zhì)的選擇性大、不需輔酶、便于生產(chǎn)和獲得高純度制劑等優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 來自嗜熱微生物的酶具有高的熱穩(wěn)定性，而且對有機(jī)溶劑和多種變性環(huán)境有抗 性，在工業(yè)上有很大的應(yīng)用潛能。由于嗜熱微生物培養(yǎng)條件一般比較苛刻，有些甚至在實(shí)驗(yàn) 室中難以培養(yǎng)，可以通過基因工程技術(shù)，將熱穩(wěn)定酶基因在中溫型微生物（例如E. coli)中 高效表達(dá)，生產(chǎn)大量的熱穩(wěn)定酶。嗜熱微生物酯酶由于具有對高溫和有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性而 備受關(guān)注，這些酶也可以用于蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的分子機(jī)制研究。
[0005] 有鑒于此，本發(fā)明人研究和設(shè)計(jì)了一種高溫酯酶、基因及其應(yīng)用，本案由此產(chǎn)生。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種高溫酯酶、基因及其應(yīng)用，該酯酶可用于短鏈酰基甘 油酯降解及其他酯類化合物的生物催化轉(zhuǎn)化。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是：
[0008] -種編碼酯酶EstJM6的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。基因大小為 750bp〇
[0009] -種酯酶蛋白EstJM6,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。該蛋白編碼249個 氨基酸殘基，將該氨基酸序列在GenBank中利用BLAST進(jìn)行相似性搜索，發(fā)現(xiàn)它與來自 Geobacillus sp. GHHOl (GenBank收錄號為YP 007402135)的熱穩(wěn)定單酰甘油脂肪酶的相 似度高達(dá)98%。結(jié)構(gòu)預(yù)測顯不，Ser97、Aspl96和His226構(gòu)成了 Geobacillus sp.JM6酯酶 的催化三聯(lián)體。
[0010] 一種酯酶表達(dá)載體，含有所述的酯酶EstJM6基因的表達(dá)載體pET-28a-est。
[0011] 一種重組酯酶的制備方法，包括采用所述的酯酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn) 化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酯酶。當(dāng)然，也可將酯酶EstJM6基因轉(zhuǎn)染到合適的真核生物宿 主中，包括酵母及哺乳動物細(xì)胞等。
[0012] 作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述的寄主細(xì)胞為大腸桿菌。
[0013] 作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，包括采用所述的酯酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至寄主細(xì)胞大腸桿菌 BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到可溶性表達(dá)的重組酯酶。
[0014] 作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述的IPTG終濃度為0. 25mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37°C。
[0015] 一種重組酯酶，包括采用所述的酯酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng) 物中獲得重組酶。
[0016] 作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，在100°C條件下處理18h，酶能保持68%活性；37°C條件 下，酶在pH 5. 0?12. 0的緩沖液中處理lh，酶仍能保留60%以上的活性
[0017] 通過酯酶活力測定，本次發(fā)明的酯酶EstJM6或者表達(dá)酯酶基因的宿主菌可用于 水解短鏈脂肪酸酯，例如對硝基苯乙酸酯和對硝基苯丁酸酯，其中底物為對硝基苯乙酸酯 時，酶的催化活性最高。
[0018] 該酯酶為一種熱穩(wěn)定酯酶，催化水解的溫度范圍為20?90°C，最適溫度為60°C ; 所述的水解pH范圍為6. 0?9. 0,最適pH為7. 5。在60?100°C條件下處理18h，酶蛋白 仍可保持60%以上的相對活力。在pH5.0?12. 0條件下處理lh，酶蛋白仍可保持60%以 上的相對活力。苯甲基磺酰氟（PMSF)可抑制重組酶的活性，表明該酶含有在催化機(jī)制中有 重要作用的絲氨酸殘基。重組酶對測試使用的洗滌劑、變性劑和有機(jī)溶劑都具有較好的耐 受性。
[0019] 本發(fā)明從海洋嗜熱菌JM6中克隆獲得了新的熱穩(wěn)定酯酶基因，發(fā)現(xiàn)了該基因編碼 的酶蛋白具有優(yōu)良的酶學(xué)特性，可應(yīng)用于催化解酯的生產(chǎn)過程。同時，本次發(fā)明也克隆得到 了可以大量表達(dá)的工程菌，可實(shí)現(xiàn)該酯酶的規(guī)?；a(chǎn)，為后續(xù)的工業(yè)化應(yīng)用提供了良好 的基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為酯酶EstJM6的誘導(dǎo)表達(dá)及其純化檢測的SDS-PAGE圖。其中，M :分子量標(biāo) 準(zhǔn)蛋白；1 :含ρΕΤ-28 α⑴陰性菌，IPTG誘導(dǎo)；2 :含pET-28 a-est陽性菌，未誘導(dǎo)；3 :含 pET-28 a -est陽性菌，IPTG誘導(dǎo)；4 :純化后的重組蛋白；
[0021] 圖2為酯酶Est JM6的最適反應(yīng)溫度曲線圖；
[0022] 圖3為酯酶Est JM6的最適反應(yīng)pH曲線圖；
[0023] 圖4為酯酶Est JM6的熱穩(wěn)定性曲線圖；
[0024] 圖5為酯酶Est JM6的pH穩(wěn)定性曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 實(shí)施例1:酯酶基因的獲取
[0026] 利用細(xì)菌基因組提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取嗜熱菌 Geobacillus Sp.JM6的基因組，利用酯酶基因簡并引物，擴(kuò)增酯酶基因：
[0027] 上游引物（SEQ ID NO. 3) :5，-ATGARWGAACRATATCC-3' ；
[0028] 下游引物（SEQ ID NO. 4) :5' -TCMRGCRTGYTTGGCGA-3，；
[0029] PCR 反應(yīng)條件為：95 °C 5min ;94 °C lmin，46 °C 45sec，72 °C，lmin30 個循環(huán)； 72°C lOmin。PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測后，割膠回收目的基因，產(chǎn)物與T載體進(jìn)行 常規(guī)連接，采用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a細(xì)胞中。從氨芐青霉素篩選平板挑取單 菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定含酯酶基因的重組質(zhì)粒，提取PCR陽性菌落的質(zhì)粒進(jìn)行測序，分析插 入序列，獲得長度為750bp的酯酶基因的開放閱讀框序列。
[0030] 實(shí)施例2 :酯酶基因的重組表達(dá)質(zhì)粒與重組菌株的構(gòu)建
[0031] 將本發(fā)明獲得的酯酶基因克隆到表達(dá)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。利用擴(kuò)增酯酶 全基因的特異性引物，擴(kuò)增基因全長序列：
[0032] 上游引物（SEQ ID NO. 5) :5，-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3，，
[0033] 下游引物（SEQ ID NO. 6) :5，-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3' ；
[0034] PCR 反應(yīng)條件為：95 °C 5min ;94 °C lmin，55 °C 45sec，72 °C，lmin30 個循環(huán)； 72°C lOmin。采用酶切克隆的方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，即用BamHI和HindIII雙酶切PCR 產(chǎn)物，割膠回收酶切后的片段與同樣經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切的質(zhì)粒pET-28a(+)進(jìn)行連 接，采用CaC12轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至E. coli DH5ci中。從卡那霉素篩選平板挑取單菌落進(jìn)行菌落 PCR鑒定含酯酶基因 est的重組質(zhì)粒，提取PCR陽性菌落的質(zhì)粒進(jìn)行測序，驗(yàn)證插入序列。 將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)菌株中，構(gòu)建重組酯酶表達(dá)菌株。
[0035] 實(shí)施例3 :利用重組表達(dá)菌株表達(dá)和純化重組酯酶
[0036] 重組表達(dá)菌株過夜培養(yǎng)后，按體積比I :100轉(zhuǎn)接到200mL LB液體培養(yǎng)基（含 50mg/mL卡那霉素）中，37°C、180r/min培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)到0· 6,加入終濃度為0· 25mmol/ L IPTG，37°C、180r/min 培養(yǎng) 6h。離心收集菌體，重懸于 Buffer A(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L氯化鈉，15mmol/L咪唑，pH 8. 0)中，在冰上進(jìn)行超聲波破碎處理。4°C下離心， 收集上清，然后進(jìn)行Ni-NTA親和層析，經(jīng)過洗滌緩沖液（50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L氯化 鈉，30mmol/L咪唑，pH 8. 0)洗滌后，利用洗脫緩沖液（50mmol/L NaH2P04,300mmol/L氯化 鈉，250mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脫，收集洗脫液。經(jīng)SDS-PAGE檢測，純化后的重組酯酶蛋白 的分子量為32. 8kDa，結(jié)果如圖1所示。用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，得到濃度約I. Omg/ mL的重組酯酶EstJM6。
[0037] 實(shí)施例4 :重組酯酶的活性檢測
[0038] 采用對硝基苯酚丁酸酯法測定酯酶的活力。具體操作：將對硝基苯酚丁酸酯用乙 腈稀釋到l〇〇mm〇l/L，將乙腈（包含底物）/異丙醇/50mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH7. 5)按 1:4:95配制底物溶液，保證對硝基苯酚丁酸酯終濃度為lmmol/L ;加入3μ L的稀釋后的酶 液（1:3稀釋），60°C下溫育15min后，測定反應(yīng)溶液在405nm的吸光值。
[0039] 實(shí)施例5 :酯酶EstJM6最適反應(yīng)條件的研究
[0040] 酯酶最適反應(yīng)溫度在20?90°C的范圍內(nèi)測定。具體操作：采取前文所用的體系， 分別在20、30、40、50、60、70、80和90°C條件下反應(yīng)15min，測定405nm的吸光值。測定結(jié)果 表明：酯酶EstJM6的最適反應(yīng)溫度為60°C，在90°C仍然具有約40%的相對活力，結(jié)果如圖 2所示。
[0041] 酯酶的最適反應(yīng)pH在4.0?12.0的范圍內(nèi)測定。測定使用的緩沖液為：50mmol/ L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4. 0?6. 0)，50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH6. 0?7. 5)，50mmol/L Tris-HCl 緩沖液（ρΗ7· 5 ?9. 0)，50mmol/L 甘氛酸-氧氧化納（ρΗ9· 0 ?11. 0)和 50mmol/ L磷酸二氫鈉-氫氧化鈉（pHll. 0?12. 0)。測定結(jié)果表明：酯酶EstJM6的最適反應(yīng)pH為 7. 5,在pH范圍6. O?9. O范圍內(nèi)都具有活性，結(jié)果如圖3所示。
[0042] 實(shí)施例6 :酯酶Est JM6的酶學(xué)穩(wěn)定性分析
[0043] 酯酶的熱穩(wěn)定性在60?100°C范圍內(nèi)進(jìn)行測定。具體操作為：將純化后的酶液分 別保溫在60、70、80、90和1001：下，每隔21 1取出部分酶液，進(jìn)行酶活測定。測定結(jié)果表明： 酯酶Est JM6具有極好的熱穩(wěn)定性，即使經(jīng)過KKTC處理18h，仍可保留68 %的相對活力，結(jié) 果如圖4所示。
[0044] 酯酶的pH穩(wěn)定性在4. 0?12. 0范圍內(nèi)進(jìn)行測定。具體操作為：將酶置于不同pH 值的緩沖液中，37°C溫育Ih后，進(jìn)行酶活力測定。測定結(jié)果顯示：酯酶EstJM6具有較好的 pH穩(wěn)定性，在pH5. 0?12. 0條件下處理lh，酶蛋白仍可保持60%以上相對活力，結(jié)果如圖 5所示。
[0045] 金屬離子對酯酶活性的影響的測定具體操作為：將酶液加入含有l(wèi)mmol/L或 lOmmol/L 金屬離子（Na+、K+、Li2+、Ni2+、Ca2+、Mg2+、Ba 2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Fe2+、Co 2+、Hg2+、Al3+ 和Fe3+)的底物溶液中，60°C下溫浴15min，測定酶的活力。測定結(jié)果，如表I所示：lmmol/L 的Li+、Ca2+和Mn2+，lmmol/L和lOmmol/L的Mg2+對酯酶EstJM6活性基本沒有影響；其它的 測試均為負(fù)影響，高濃度（lOmmol/L)的Hg 2+和Al3+的抑制效應(yīng)尤為明顯。
[0046] 表1金屬離子對酯酶活性的影響

【權(quán)利要求】
1. 一種編碼酯酶EstJM6的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -種酯酶蛋白EstJM6,其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -種酯酶表達(dá)載體，其特征在于：含有權(quán)利要求1所述的酯酶EstJM6基因的表達(dá)載 體 pET_28a_est。
4. 一種重組酯酶的制備方法，其特征在于：包括采用權(quán)利要求3所述的酯酶表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酯酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種重組酯酶的制備方法，其特征在于：所述的寄主細(xì)胞為 大腸桿菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種重組酯酶的制備方法，其特征在于：包括采用所述的酯 酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至寄主細(xì)胞大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到可溶性表達(dá)的重組酯 酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種重組酯酶的制備方法，其特征在于：所述的IPTG終濃度 為0. 25 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37°C。
8. -種重組酯酶，其特征在于：包括采用權(quán)利要求3所述的酯酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì) 胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酶。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種重組酯酶，其特征在于：在10(TC條件下處理18 h，酶能 保持68%活性；37°C條件下，酶在pH 5. (T12. 0的緩沖液中處理1 h，酶仍能保留60%以上 的活性。
【文檔編號】C12N15/70GK104388403SQ201410549641
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】朱艷冰, 倪輝, 劉韓, 蔡慧農(nóng), 肖安風(fēng), 杜希萍, 李利君 申請人:集美大學(xué)