水稻Bph28基因在改良水稻抗褐飛虱性狀方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為水稻Bph28基因在改良水稻抗褐飛虱性狀方面的應(yīng)用。本發(fā)明利用來自普通野生稻的Bph28基因改良水稻抗褐飛虱性狀,將栽培稻中的Bph28等位顯性基因轉(zhuǎn)化抗蟲品種，覆蓋隱性基因Bph28的表達(dá)，使抗蟲品種的抗蟲性狀發(fā)生顯著弱化，提供了該基因在水稻抗蟲性狀方面的重要功能。本發(fā)明還涉及改良水稻的褐飛虱抗性的方法、Bph28等位基因的表達(dá)載體、其制備方法及應(yīng)用。
【專利說明】水稻辦/^<9基因在改良水稻抗褐飛虱性狀方面的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基因的一種新的應(yīng)用。本發(fā)明還涉 及基因的的表達(dá)載體和一種改良水稻抗褐飛虱性狀方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是世界主要糧食作物，控制各種的水稻病蟲害是亟待解決的嚴(yán)峻問題。在草 食性水稻害蟲中，對產(chǎn)量破壞性最強的就是褐飛虱。輕度的褐飛虱感染會導(dǎo)致作物株高降 低，生長活力受抑，分蘗數(shù)亦受到抑制。而嚴(yán)重的褐飛虱感染會使作物完全枯萎，產(chǎn)生"葉蟬 燒"現(xiàn)象。褐飛虱也可以成為水稻草矮病毒和水稻鋸齒葉矮縮病毒的傳播載體，在一些區(qū)域 造成嚴(yán)重的疾病傳播。
[0003] 近年來，褐飛虱感染問題在亞洲地區(qū)日漸嚴(yán)峻，農(nóng)民多依賴化學(xué)殺蟲劑來控制蟲 害，費工費時，極大的加重了環(huán)境的負(fù)擔(dān)。最經(jīng)濟(jì)有效且環(huán)保可持續(xù)的蟲害控制方法，是培 育對褐飛虱具有廣泛抗性的水稻品種并加以推廣。多數(shù)研究表明，具有抗性的水稻品種能 夠抑制蟲害的重量增長，并且大范圍的幾個世代后，可以顯著降低褐飛虱的種群水平。
[0004] 迄今為止，有27個褐飛虱抗性基因在水稻栽培種及野生種中進(jìn)行了定位，僅有一 例被精確克隆到，水稻抗蟲性的分子機(jī)理也不甚明了。而且，對于褐飛虱的抗性資源大多來 自陸生秈稻，而來自粳稻的種質(zhì)資源十分有限。同時，已有的提供抗性的野生稻品系均非栽 培稻的AA基因組背景，因此在基因滲入之后，由于缺少與其原有的非AA基因組遺傳背景的 互作，轉(zhuǎn)基因的抗性特征大大減弱。因此，發(fā)掘來自普通野生稻的新的抗性資源中的抗性基 因十分重要。在未來，通過多基因互作來抵制褐飛虱的抗性也是十分重要的方向。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提出水稻功基因在改良水稻抗褐飛虱性狀方面的應(yīng)用及方 法。
[0006] 本發(fā)明利用來自普通野生稻的基因改良水稻抗褐飛虱性狀。實施例中，將 栽培稻中的等位顯性基因轉(zhuǎn)化抗蟲品種，覆蓋隱性基因3#1的表達(dá)，使抗蟲品種的 抗蟲性狀發(fā)生顯著弱化，提供了該基因在水稻抗蟲性狀方面的重要功能。
[0007] 本發(fā)明提供了 基因在改良水稻抗褐飛虱性狀方面的應(yīng)用。
[0008] 例如，將你力忽基因轉(zhuǎn)化水稻品種，以改良水稻抗褐飛虱性狀。
[0009] 其中，所述的你公^基因的序列如SEQ ID NO 1所示。
[0010] 本發(fā)明可以用于培育具有褐飛虱抗性的水稻，依次包括如下步驟： (1) 構(gòu)建功等位基因表達(dá)載體； (2) 功等位基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻受體； (3 )播種功等位基因轉(zhuǎn)化植株。
[0011] 其中，步驟（2)中采用抗蟲野生稻BPHR54為轉(zhuǎn)基因水稻受體，構(gòu)建功7力忽等位基 因的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。
[0012] 本發(fā)明提供了改良水稻的褐飛虱抗性的一種方法，該方法依次包括如下步驟： (a) 構(gòu)建功等位基因表達(dá)載體； (b) 功等位基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻受體； (c) 播種功等位基因轉(zhuǎn)化植株。
[0013] 其中，步驟（b)中采用抗蟲野生稻作為轉(zhuǎn)基因水稻受體。
[0014] 本發(fā)明還提供了 一種功等位基因的表達(dá)載體，是在pCAMBIA1304載體35S組 成型啟動子下游插入等位基因。
[0015] 上述的表達(dá)載體的制備方法，是根據(jù)基因工程的常規(guī)操作，將感蟲秈稻118S的 功等位基因插入到pCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游。
[0016] 本發(fā)明還提供了上述的表達(dá)載體的應(yīng)用，即將該表達(dá)載體應(yīng)用于改良水稻抗褐飛 風(fēng)性狀。
[0017] 本發(fā)明所述的你力忽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明所述的 功基因還包括指編碼具有水稻Bph28活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1的簡 并序列。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面，提供了一種表達(dá)水稻谷#1基因的方法，該方法包括： (a) 將基因的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成基因表達(dá)載 體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO. 1的核苷酸序列有至少70%的同源性； (b) 將步驟（a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成含有功基因的重組細(xì)胞； (c) 在適合表達(dá)基因的條件下，培養(yǎng)步驟（b)中的重組細(xì)胞； (d) 分離出目的蛋白。
[0019] 在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。如，選用市售的載 體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá) 載體。
[0020] 如本文所用，"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影 響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的 分泌，那么信號肽（分泌前導(dǎo)序列）DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動子控制序列 的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置 時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰近，而對于分泌前 導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
[0021 ] 在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動 物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CH0細(xì)胞、C0S細(xì)胞等。
[0022] 本發(fā)明還包括：水稻基因的分離、克隆與轉(zhuǎn)基因功能研究等。
[0023] 1)φΑ忽基因與蛋白結(jié)構(gòu)組成 水稻你 Α忽基因，基因序列全長612bp，無內(nèi)含子。序列如SEQ. ID Ν01.所示。cDNA genbank登錄號為KC019173,該登陸編碼區(qū)序列全長612bp。編碼203個氨基酸，序列如 SEQ. ID N02.所示。該基因的結(jié)構(gòu)與其編碼的蛋白質(zhì)組成如下： 水稻你基因結(jié)構(gòu)見圖1所示。
[0024] 蛋白結(jié)構(gòu)見圖2所示，含有一個B3 DNA-binding結(jié)構(gòu)域。 2 )功等位基因表達(dá)載體的構(gòu)建 米用 pCAMBIA1304 (Center for the Application of Molecular Biology of International Agriculture, Canberra, ACT, Australia)為表達(dá)載體，將秈稻 118S 的 功等位基因插入到pCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游，得到含功等位基因的 表達(dá)載體。其結(jié)構(gòu)圖如圖3所示。
[0025] 3)功也等位基因轉(zhuǎn)化實驗 采用具有高級別抗褐飛虱性狀的野生稻品種BPHR54為轉(zhuǎn)基因受體，構(gòu)建/?等位基 因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。將BPHR54成熟種子去殼消毒后接種在脫分化植物組織培育基上誘 導(dǎo)愈傷組織。在愈傷組織誘導(dǎo)2-3周后，采用基因槍微彈轟擊法，將含等位基因的經(jīng) 純化的PCAMBIA1304質(zhì)粒DNA導(dǎo)入BPHR54愈傷組織細(xì)胞。在添加30ppm潮霉素的MS培養(yǎng) 基上連續(xù)培養(yǎng)3-4周篩選抗性細(xì)胞系，然后將篩選的細(xì)胞系轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)長芽和 生根。
[0026] 4)轉(zhuǎn)化處理試管苗移載及轉(zhuǎn)化植株后代的分子檢測 將功等位基因轉(zhuǎn)化處理的BPHR54試管苗移載田間，并在分蘗期取葉片提取DNA采 用PCR擴(kuò)放技術(shù)進(jìn)行分子檢測，于2011年夏獲得陽性T0代植株。2011年冬，在海南島加代 繁殖，獲得轉(zhuǎn)基因 T1代，共計7個株系。
[0027] 5)功7力忽等位基因轉(zhuǎn)化野生稻BPHR54轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測 目的基因在野生稻BPHR54對照植株中不表達(dá)，而在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)。見圖4所示。
[0028] 6)功也貨轉(zhuǎn)基因T1代群體抗蟲性狀的調(diào)查與統(tǒng)計 將轉(zhuǎn)基因 T1代于2012年夏播種，種植在廣西農(nóng)科院植保所網(wǎng)室。三葉期時對其進(jìn)行 抗蟲鑒定。取5個轉(zhuǎn)基因株系，每個株系約種植20株，10株X 2列。同時設(shè)立野生型敏感 親本與BPHR54抗蟲親本作為對照，統(tǒng)計各株系的抗蟲級數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果如下：

【權(quán)利要求】
1. Bph28基因在改良水稻抗褐飛虱性狀方面的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，將基因轉(zhuǎn)化水稻品種，以改良水稻抗 褐飛虱性狀。
3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的功也貨基因的序列如SEQ ID NO 1所 /_J、1 ο
4. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，培育具有褐飛虱抗性的水稻，依次包括如下 步驟： (1)構(gòu)建功等位基因表達(dá)載體； 等位基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻受體； (3)播種功等位基因轉(zhuǎn)化植株。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（2)中采用抗蟲野生稻BPHR54為轉(zhuǎn)基 因水稻受體，構(gòu)建功等位基因的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。
6. 改良水稻的褐飛虱抗性的一種方法，其特征在于，該方法依次包括如下步驟： (a)構(gòu)建功等位基因表達(dá)載體； 必;功等位基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻受體； (c)播種功等位基因轉(zhuǎn)化植株。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（b)中采用抗蟲野生稻作為轉(zhuǎn)基因水稻 受體。
8. -種功也貨等位基因的表達(dá)載體，其特征在于，感蟲秈稻118S的功也貨等位基因插 入到PCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游。
9. 如權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，將感蟲秈稻118S的功7力忽 等位基因插入到PCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游而獲得。
10. 權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于，將該表達(dá)載體應(yīng)用于改良水稻抗 褐飛虱性狀。
【文檔編號】C12N15/82GK104099342SQ201310112700
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月2日
【發(fā)明者】羅小金, 王瑩, 楊金水 申請人:復(fù)旦大學(xué)