專利名稱：一種高特異高敏感檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，是一種高特異高敏感檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus )是人類的一種重要病原菌,隸屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，有“嗜肉菌〃的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重感染和食物中毒。急需特異性和敏感度高的快速診斷試劑。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是由日本榮研(EIKEN)株式會(huì)社開發(fā)的高特異性敏感度的核酸檢測(cè)系統(tǒng)，無須昂貴的設(shè)備，已經(jīng)成為核酸快速檢測(cè)法的良好手段，本發(fā)明結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)金黃色葡萄球菌特異性基因序列的一對(duì)外引物(SA-F3和SA-B3)和一對(duì)內(nèi)引物(SA-FIP和SA-BIP)進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種高特異高敏感檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，提高了它的檢測(cè)和診斷效率。樣處理廠的告知系統(tǒng)為實(shí) 現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種高特異高敏感檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，包括以下步驟:
步驟I)制備反應(yīng)液 反應(yīng)液組成及含量為
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液lX，MgS04 2mM
4M甜菜堿IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
內(nèi)引物
SA-FIP40umol
SA-BIP40umol
外引物
SA-F35umol
SA-B35umol
標(biāo)本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達(dá)到25ul;
步驟2)將上述反應(yīng)液放入63°C烘箱進(jìn)行反應(yīng)30-60min，渾濁為陽性；
步驟3)提取臨床分離金黃色葡萄球菌及金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923，以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進(jìn)行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。進(jìn)一步的，所述外引物SA-F3的序列為CCAGACTCGGGTCAGGAA。進(jìn)一步的，所述外引物SA-B3的序列為ACTTCCCAAAATGCGCTCC。
進(jìn)一步的，所述內(nèi)引物SA-FIP的序列為 AACGGCTTAGTGGCTGTGTCAT-CTCCATAGTCGCGACGTTTC。進(jìn)一步的，所述內(nèi)引物SA-BIP 的序列為 TTACGAAGGCGATGTGTGCCG-GGTCGTGCAGCAATTCAGG。
進(jìn)一步的，所述反應(yīng)液中加入突光顯示物質(zhì)溴化乙錠、I丐黃綠素進(jìn)行實(shí)時(shí)檢查。本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明通過配制反應(yīng)液，設(shè)計(jì)引物序列，能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)金黃色葡萄球菌，并及時(shí)采取相應(yīng)的措施，減少了疾病的發(fā)生率。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例，來詳細(xì)說明本發(fā)明。一種高特異高敏感檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，包括以下步驟:
步驟I)制備反應(yīng)液
反應(yīng)液組成及含量為
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液lX，MgS04 2mM
4M甜菜堿IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
內(nèi)引物
SA-FIP40umol
SA-BIP40umol
外引物
SA-F35umol
SA-B35umol
標(biāo)本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達(dá)到25ul。選取金黃色葡萄球菌特異性基因基因(基因序列來源美國國立生物技術(shù)信息中心-NCBI )，設(shè)計(jì)引物序列。所述外引物SA-F3的序列為CCAGACTCGGGTCAGGAA，所述外引物SA-B3的序列為ACTTCCCAAAATGCGCTCC，所述內(nèi)引物SA-FIP的序列為
AACGGCTTAGTGGCTGTGTCAT-CTCCATAGTCGCGACGTTTC，所述內(nèi)引物 SA-BIP 的序列為 TTACGAAGGCGATGTGTGCCG-GGTCGTGCAGCAATTCAGGo進(jìn)一步的，所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進(jìn)行實(shí)時(shí)檢查。步驟2)將上述反應(yīng)液放入63°C烘箱進(jìn)行反應(yīng)30-60min，渾濁為陽性；
步驟3)提取臨床分離金黃色葡萄球菌11株及金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923，以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進(jìn)行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。結(jié)果顯示:11株金黃色葡萄球菌均為陽性，其余菌種為陰性。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包 含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種高特異高敏感檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I)制備反應(yīng)液 反應(yīng)液組成及含量為 8u/ul Bst核酸聚合酶8u IOX耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液lX，MgS04 2mM4M甜菜堿IM IOmM d-NTP 混合液400 μ M 內(nèi)引物 SA-FIP40umol SA-BIP40umol 外引物 SA-F35umol SA-B35umol標(biāo)本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達(dá)到25ul; 步驟2)將上述反應(yīng)液放入63°C烘箱進(jìn)行反應(yīng)30-60min，渾濁為陽性； 步驟3)提取臨床分離金黃色葡萄球菌及金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923，以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進(jìn)行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高特異高敏感檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于:所述外引物SA-F3的序列為CCAGACTCGGGTCAGGAA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高特異高敏感檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于:所述外引物 SA-B3 的序列為 ACTTCCCAAAATGCGCTCC。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高特異高敏感檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于:所述內(nèi)引物SA-FIP的序列為AACGGCTTAGTGGCTGTGTCAT-CTCCATAGTCGCGACGTTTC。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高特異高敏感檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于:所述內(nèi)引物 SA-BIP 的序列為 TTACGAAGGCGATGTGTGCCG-GGTCGTGCAGCAATTCAGG。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高特異高敏感檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于:所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進(jìn)行實(shí)時(shí)檢查。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高特異高敏感檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，包括以下步驟步驟1)制備反應(yīng)液；步驟2)將上述反應(yīng)液放入63℃烘箱進(jìn)行反應(yīng)30-60min，渾濁為陽性;步驟3)提取臨床分離金黃色葡萄球菌及金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923，以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸,多次進(jìn)行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。本發(fā)明通過配制反應(yīng)液，設(shè)計(jì)引物序列，能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)金黃色葡萄球菌，并及時(shí)采取相應(yīng)的措施，減少了疾病的發(fā)生率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103205491SQ20131008056
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者酈芳華, 吳妹英, 金京勛, 沈永林, 賈宇玲, 趙靜, 吳興福 申請(qǐng)人:蘇州市第五人民醫(yī)院