專利名稱：異養(yǎng)小球藻的半連續(xù)發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異養(yǎng)小球藻的半連續(xù)發(fā)酵方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
異養(yǎng)小球藻生產(chǎn)技術(shù)是通過控制小球藻的新陳代謝、破除生產(chǎn)環(huán)境限制，從而達(dá)到提高生產(chǎn)效率、獲得更多的油脂的方法。目前異養(yǎng)小球藻主要是單罐生產(chǎn)，擴(kuò)培的方法是一級發(fā)酵結(jié)束全部壓送到下一級發(fā)酵罐做種子，直到最后一級發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行處理。目前尚沒有連續(xù)或者半連續(xù)的發(fā)酵方法。異養(yǎng)小球藻生長緩慢，如果接種量過小，甚至需要生長一個月。這么長的生長時間導(dǎo)致發(fā)酵過程中進(jìn)入任何一個雜菌都有可能導(dǎo)致發(fā)酵失敗，從而影響正常生產(chǎn)、導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生長周期短的異養(yǎng)小球藻的半連續(xù)發(fā)酵方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的異養(yǎng)小球藻的半連續(xù)發(fā)酵方法按以下步驟進(jìn)行
a. 一級發(fā)酵罐(I)空消、降溫后，培養(yǎng)基罐(8)向一級發(fā)酵罐(I)壓入滅過菌的培養(yǎng)基，然后接種異養(yǎng)小球藻；接種后一級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積為一級發(fā)酵罐(I)容積的30 50% ；經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，培養(yǎng)基罐(8)繼續(xù)向一級發(fā)酵罐(I)補(bǔ)充滅過菌的培養(yǎng)基，補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例占發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30% ;經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重再次達(dá)到50g/L后，繼續(xù)向一級發(fā)酵罐(I)按其內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%補(bǔ)充滅過菌的培養(yǎng)基，直到補(bǔ)加到一級發(fā)酵罐(I)容積的80% ；b.經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重再次達(dá)到50g/L后，一級發(fā)酵罐(I)向空消并降溫后的二級發(fā)酵罐(2)壓入發(fā)酵液，壓入發(fā)酵液的比例占一級發(fā)酵罐
(I)發(fā)酵液體積的50 70% ;c.壓料后，培養(yǎng)基罐(8)向一級發(fā)酵罐(I)和二級發(fā)酵罐(2)分批壓入滅過菌的培養(yǎng)基,每次補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例占各發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30% ；經(jīng)過培養(yǎng),任一發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再通過培養(yǎng)基罐(8 )向該發(fā)酵罐按其內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%補(bǔ)充滅過菌的培養(yǎng)基，直至發(fā)酵液體積達(dá)到該發(fā)酵罐容積的80% ；
d.經(jīng)過培養(yǎng)，二級發(fā)酵罐(2)內(nèi)的發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，將二級發(fā)酵罐(2)內(nèi)的發(fā)酵液壓入三級發(fā)酵罐(3 )，壓入發(fā)酵液占二級發(fā)酵罐(2 )發(fā)酵液體積的50 70%，之后，一級發(fā)酵罐(I)向二級發(fā)酵罐(2)壓入占一級發(fā)酵罐體積50 70%的發(fā)酵液；然后培養(yǎng)基罐向一級發(fā)酵罐(I)、二級發(fā)酵罐(2)、三級發(fā)酵罐(3)分批壓入滅過菌的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基罐每次向任一發(fā)酵罐補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例分別占該發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%,經(jīng)過培養(yǎng),任一發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再向該發(fā)酵罐按其內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%補(bǔ)充滅過菌的培養(yǎng)基，直至發(fā)酵液體積達(dá)到該發(fā)酵罐容積的80% ;三級發(fā)酵罐(3)中的發(fā)酵液體積達(dá)到該發(fā)酵罐容積的80%，且三級發(fā)酵罐(3)內(nèi)發(fā)酵液干重再次達(dá)到50g/L后，直接壓到后續(xù)處理；除任一發(fā)酵罐剛接種時、任一級發(fā)酵罐剛接收上一級發(fā)酵罐壓過來的發(fā)酵液時兩種情形外，上述發(fā)酵過程中向任一發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)充培養(yǎng)基時要保證每次補(bǔ)充培養(yǎng)基后發(fā)酵液中的干物質(zhì)含量高于30g/L ;上述發(fā)酵過程中，任一級發(fā)酵罐向下一級發(fā)酵罐壓入發(fā)酵液后，如果下一級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積不足該發(fā)酵罐容積的30%，應(yīng)當(dāng)立即補(bǔ)加培養(yǎng)基，使該級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積一次性補(bǔ)加到發(fā)酵罐容積的30% ;上述一次性補(bǔ)充培養(yǎng)基時，補(bǔ)充培養(yǎng)基的體積不受發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%的限制；在各級發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，必要時分別通過碳源罐(5)、氮源罐(6)、堿液罐(4)、泡敵罐(7)通過連接管路向各級發(fā)酵罐注入碳源、氮源、堿液、泡敵，補(bǔ)加的方法是通過取樣分析，當(dāng)碳源低于20g/L時就補(bǔ)加碳源達(dá)到40g/L，同時按照碳源氮源=10 I的比例補(bǔ)加氮源；當(dāng)任一發(fā)酵罐內(nèi)有泡沫時則對該發(fā)酵罐補(bǔ)加泡敵，一次補(bǔ)加泡敵的量為該發(fā)酵罐發(fā)酵液體積的5%0 ;當(dāng)PH低于7時則向發(fā)酵液里補(bǔ)加堿液；各級發(fā)酵罐的發(fā)酵溫度為36度。本發(fā)明的有益之處在于少量的培養(yǎng)基補(bǔ)加到發(fā)酵液(發(fā)酵液中已含有較多的異養(yǎng)小球藻)中去，相比以往將發(fā)酵液全部壓出后再重新加入培養(yǎng)基培養(yǎng)的方式，滿足了比較大的培養(yǎng)基/種子比例要求。由于每次僅有少量培養(yǎng)基補(bǔ)加到發(fā)酵液中去，因此減少了細(xì)胞生長的不適應(yīng)性，使細(xì)胞生長更快，減少了停滯期，解決了因為接種量小、生物質(zhì)生長緩慢造成的發(fā)酵異常問題，適于進(jìn)行半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)。由于本發(fā)明的異養(yǎng)小球藻的半連續(xù)發(fā)酵方法能夠加快細(xì)胞生長速度，縮短生長周期，因此相應(yīng)也降低了生產(chǎn)周期中進(jìn)入雜菌導(dǎo)致發(fā)酵失敗的風(fēng)險。


圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式為了加深對本發(fā)明的理解，特結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述，下述實施例僅限于對本發(fā)明的解釋。如圖1所示，本 發(fā)明的異養(yǎng)小球藻的半連續(xù)發(fā)酵方法所用到的發(fā)酵系統(tǒng)包括通過管路連接在一起的培養(yǎng)基罐8、氮源罐6、碳源罐5、泡敵罐7、堿液罐4、一級發(fā)酵罐1、二級發(fā)酵罐2和三級發(fā)酵罐3。生產(chǎn)開始前，培養(yǎng)基罐8、氮源罐6、碳源罐5、泡敵罐7配料實消后降溫保壓備用。堿液罐4配好后降溫備用。實施例一
本實施例的異養(yǎng)小球藻的半連續(xù)發(fā)酵方法按以下步驟進(jìn)行
a. 一級發(fā)酵罐(500L)經(jīng)過空消、降溫后，通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加150L培養(yǎng)基，接入100L種子(接種后一級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積為一級發(fā)酵罐容積的50%即250L);經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L (克/升)后，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加30L (補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例占一級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的12%，補(bǔ)加以后干重為44. 64g/L)培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加60L (補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例占發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的21. 4%，補(bǔ)力口以后干重為41. 18g/L)培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加60L (補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例占發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的17. 6%，補(bǔ)加以后干重為42. 5g/L)培養(yǎng)基，此時發(fā)酵液體積達(dá)到400L (即一級發(fā)酵罐容積的80%)。
b.經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，開始由一級發(fā)酵罐向空消并降溫后的二級發(fā)酵罐(500L)壓入280L (壓入發(fā)酵液的比例占一級發(fā)酵罐發(fā)酵液體積的70%)發(fā)酵液。按照本方法完成一級發(fā)酵(即500L發(fā)酵)完成需要6天，正常情況下500L發(fā)酵需要15天。c.此時一級發(fā)酵罐還剩余120L發(fā)酵液，通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加30L(使初始發(fā)酵液體積達(dá)到發(fā)酵罐容積的30%)培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再通過培養(yǎng)基罐向一級發(fā)酵罐補(bǔ)加30L (補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例占一級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的20%，補(bǔ)加以后干重為41. 67g/L)培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加40L培養(yǎng)基(原有165L，補(bǔ)加22. 22%補(bǔ)加以后干重為40. 9g/L);每次補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例占各發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%，以此方法重復(fù)補(bǔ)加培養(yǎng)基和進(jìn)行培養(yǎng)的操作，直到發(fā)酵液體積達(dá)到400L且發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再次向二級發(fā)酵罐壓入280L發(fā)酵液。所述b步驟結(jié)束后，二級發(fā)酵罐有280L發(fā)酵液，通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加30L培養(yǎng)基(原有280L，補(bǔ)加10. 7%，補(bǔ)加以后干重為45. 17g/L);經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加60L培養(yǎng)基(原有310L，補(bǔ)加19. 4%補(bǔ)加以后干重為41. 89g/L);每次補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例占各發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%，以此方法重復(fù)補(bǔ)加培養(yǎng)基和進(jìn)行培養(yǎng)的操作，直到二級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積達(dá)到400L。d.經(jīng)過培養(yǎng)，二級發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，向三級發(fā)酵罐(500L)壓入280L發(fā)酵液，壓入發(fā)酵液的比例占二級發(fā)酵罐發(fā)酵液體積的70%;再由一級發(fā)酵罐向二級發(fā)酵罐壓入占一級發(fā)酵罐體積50 70%的發(fā)酵液。然后培養(yǎng)基罐向一級發(fā)酵罐、二級發(fā)酵罐、三級發(fā)酵罐分批壓入滅過菌的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基罐每次向任一發(fā)酵罐補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例分別占該發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%，經(jīng)過培養(yǎng)，任一發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再向該發(fā)酵罐按其內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%補(bǔ)充滅過菌的培養(yǎng) 基，直至發(fā)酵液體積達(dá)到該發(fā)酵罐容積的80% ；
按照本方法完成二級發(fā)酵(即500L發(fā)酵)完成需要6天，正常情況下500L發(fā)酵需要15天。三級發(fā)酵罐中的發(fā)酵液體積達(dá)到該發(fā)酵罐容積的80%，且三級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，直接將發(fā)酵液壓到后續(xù)處理。其中，發(fā)酵過程中向任一發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)充培養(yǎng)基時要保證每次補(bǔ)充培養(yǎng)基后發(fā)酵液中的干物質(zhì)含量高于30g/L ;這里對補(bǔ)料的限制具有兩種例外情形，一種是任一發(fā)酵罐剛接種時，第二種是任一級發(fā)酵罐剛接收上一級發(fā)酵罐壓過來的發(fā)酵液時。除此兩種例外情形外，發(fā)酵過程中補(bǔ)料時均應(yīng)遵守上述補(bǔ)料限制。上述發(fā)酵過程中，任一級發(fā)酵罐向下一級發(fā)酵罐壓入發(fā)酵液后，如果下一級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積不足該發(fā)酵罐容積的30%，應(yīng)當(dāng)立即補(bǔ)加培養(yǎng)基，使該級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積一次性補(bǔ)加到發(fā)酵罐容積的30%。在各級發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，必要時，分別通過碳源罐(5)、氮源罐(6)、堿液罐(4)、泡敵罐(7)通過連接管路向各級發(fā)酵罐注入碳源、氮源、堿液、泡敵，以維持發(fā)酵液的營養(yǎng)成份及異養(yǎng)小球藻的正常生長；補(bǔ)加的方法是通過取樣分析，當(dāng)碳源低于20g/L時就補(bǔ)加碳源達(dá)到40g/L，同時按照碳源氮源=10 1的比例補(bǔ)加氮源；當(dāng)任一發(fā)酵罐內(nèi)有泡沫時則對該發(fā)酵罐補(bǔ)加的泡敵，一次補(bǔ)加泡敵的量為該發(fā)酵罐發(fā)酵液體積的5%0 ；當(dāng)PH低于7時則向發(fā)酵液里補(bǔ)加堿液；各級發(fā)酵罐的發(fā)酵溫度為36度，當(dāng)溫度偏離36度時則需要調(diào)T1溫度。當(dāng)然，本實施例中發(fā)酵罐的級數(shù)也可以超出附圖所示的三級的限制，可以根據(jù)需要增加發(fā)酵罐的級數(shù)，并按上述發(fā)酵方法進(jìn)行發(fā)酵。按照現(xiàn)有技術(shù)中的發(fā)酵方法，單個500L罐裝培養(yǎng)基300L，使用卡氏罐接種10L，需要生長15天才能達(dá)到要求并將發(fā)酵液壓到后續(xù)處理。使用本實施例的方法，生長周期最多只需要10天。另外，因為發(fā)酵過程中間，要不停的通風(fēng)、攪拌，需要消耗大量的風(fēng)、電，如果使用本實施例的技術(shù)方案可以節(jié)約34%的能源消耗。按照現(xiàn)在技術(shù)中的發(fā)酵方法，同時開展兩個500L罐裝培養(yǎng)基300L，使用卡氏罐接種10L，需要同時生長15天才能達(dá)到要求并將發(fā)酵液壓到后續(xù)處理。使用本實施例的方法，生長周期最多只需要15天。另外，因為發(fā)酵過程中間，要不停的通風(fēng)、攪拌，需要消耗大量的風(fēng)、電，如果使用本實施例的技術(shù)方案可以至少節(jié)約50%的能源消耗。實例二
本實施例的異養(yǎng)小球藻 的半連續(xù)發(fā)酵方法按以下步驟進(jìn)行
a. 一級發(fā)酵罐(500L)經(jīng)過空消、降溫后，通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加100L培養(yǎng)基，接入100L種子(接種后一級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積為一級發(fā)酵罐容積的40%即200L);經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L (克/升)后，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加60L (原有200L，補(bǔ)加30%，補(bǔ)加以后干重為38. 46g/L)培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加60L (原有260L，補(bǔ)加23%，補(bǔ)加以后干重為40. 62g/L)培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加80L (原有320L，補(bǔ)加25%，補(bǔ)加以后干重為40g/L)培養(yǎng)基，此時發(fā)酵液體積達(dá)到400L (即一級發(fā)酵罐容積的80%)。按照本方法完成一級發(fā)酵(即500L發(fā)酵)完成需要5天，正常情況下500L發(fā)酵需要15天。b.經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，開始由一級發(fā)酵罐向空消并降溫后的二級發(fā)酵罐(500L)壓入200L (壓入發(fā)酵液的比例占一級發(fā)酵罐發(fā)酵液體積的50%)發(fā)酵液；
c.此時一級發(fā)酵罐還剩余200L發(fā)酵液，通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加60L (原有200L，補(bǔ)加30%，補(bǔ)加以后干重為38. 46g/L)培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再通過培養(yǎng)基罐向一級發(fā)酵罐補(bǔ)加60L(原有260L，補(bǔ)加23%補(bǔ)加以后干重為40. 63g/L)培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加80L培養(yǎng)基(原有320L，補(bǔ)加25%補(bǔ)加以后干重為40g/L);此時發(fā)酵液體積達(dá)到400L。經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再次向二級發(fā)酵罐壓送200L發(fā)酵液。所述b步驟結(jié)束后，二級發(fā)酵罐有200L發(fā)酵液，通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加60L(原有200L，補(bǔ)加30%，補(bǔ)加以后干重為38. 46g/L)培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再通過培養(yǎng)基罐向一級發(fā)酵罐補(bǔ)加60L (原有260L，補(bǔ)加23%補(bǔ)加以后干重為40. 63g/L)培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加80L培養(yǎng)基(原有320L，補(bǔ)加25%補(bǔ)加以后干重為40g/L);此時發(fā)酵液體積達(dá)到400L。d.經(jīng)過培養(yǎng)，二級發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，向三級發(fā)酵罐(500L)壓入200L發(fā)酵液，壓入發(fā)酵液的比例占二級發(fā)酵罐發(fā)酵液體積的50%;再由一級發(fā)酵罐向二級發(fā)酵罐壓入占一級發(fā)酵罐體積50 70%的發(fā)酵液。
然后培養(yǎng)基罐向一級發(fā)酵罐、二級發(fā)酵罐、三級發(fā)酵罐分批壓入滅過菌的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基罐每次向任一發(fā)酵罐補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例分別占該發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%，經(jīng)過培養(yǎng)，任一發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再向該發(fā)酵罐按其內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%補(bǔ)充滅過菌的培養(yǎng)基，直至發(fā)酵液體積達(dá)到該發(fā)酵罐容積的80%。按照本方法完成一級發(fā)酵(即500L發(fā)酵)完成需要5天，正常情況下500L發(fā)酵需要15天。三級發(fā)酵罐中的發(fā)酵液體積達(dá)到該發(fā)酵罐容積的80%，且三級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，直接將發(fā)酵液壓到后續(xù)處理。其中，發(fā)酵過程中向任一發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)充培養(yǎng)基時要保證每次補(bǔ)充培養(yǎng)基后發(fā)酵液中的干物質(zhì)含量高于30g/L ;這里對補(bǔ)料的限制僅限任一發(fā)酵罐的發(fā)酵過程，至于剛接種時、N級罐向N+1級罐首次轉(zhuǎn)移發(fā)酵液時則不在此限制范圍內(nèi)。上述發(fā)酵過程中，任一級發(fā)酵罐向下一級發(fā)酵罐壓入發(fā)酵液后，如果下一級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積不足該發(fā)酵罐容積的30%，應(yīng)當(dāng)立即補(bǔ)加培養(yǎng)基，使該級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積一次性補(bǔ)加到發(fā)酵罐容積的30% ；
當(dāng)然，本實施例中發(fā)酵罐的級數(shù)也可以超出附圖所示的三級的限制，可以根據(jù)需要增加發(fā)酵罐的級數(shù)，并按上述發(fā)酵方法進(jìn)行發(fā)酵。

在各級發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，必要時，分別通過碳源罐(5)、氮源罐(6)、堿液罐(4)、泡敵罐(7)通過連接管路向各級發(fā)酵罐注入碳源、氮源、堿液、泡敵，以維持發(fā)酵液的營養(yǎng)成份及異養(yǎng)小球藻的正常生長；補(bǔ)加的方法是通過取樣分析，當(dāng)碳源低于20g/L時就補(bǔ)加碳源達(dá)到40g/L，同時按照碳源氮源=10 1的比例補(bǔ)加氮源；當(dāng)任一發(fā)酵罐內(nèi)有泡沫時則對該發(fā)酵罐補(bǔ)加的泡敵，一次補(bǔ)加泡敵的量為該發(fā)酵罐發(fā)酵液體積的5%0 ；
當(dāng)PH低于7時則向發(fā)酵液里補(bǔ)加堿液；各級發(fā)酵罐的發(fā)酵溫度為36度，當(dāng)溫度偏離36度時則需要調(diào)T1溫度。按照現(xiàn)有技術(shù)中的發(fā)酵方法，500L罐裝培養(yǎng)基300L，使用卡氏罐接種10L，需要生長15天才能達(dá)到要求并將發(fā)酵液壓到后續(xù)處理。使用本實施例的方法，生長周期最多只需要7天。另外，因為發(fā)酵過程中間，要不停的通風(fēng)、攪拌，需要消耗大量的風(fēng)、電，如果使用本實施例的技術(shù)方案可以節(jié)約50%的能源消耗。按照現(xiàn)有技術(shù)中的發(fā)酵方法，500L罐裝培養(yǎng)基300L，使用卡氏罐接種10L，需要生長15天才能達(dá)到要求并將發(fā)酵液壓到后續(xù)處理。使用本實施例的方法，生長周期最多只需要12天。另外，因為發(fā)酵過程中間，要不停的通風(fēng)、攪拌，需要消耗大量的風(fēng)、電，如果使用本實施例的技術(shù)方案可以節(jié)約60%的能源消耗。實例三、
本實施例的異養(yǎng)小球藻的半連續(xù)發(fā)酵方法按以下步驟進(jìn)行
a. 一級發(fā)酵罐(50L)經(jīng)過空消、降溫后，通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加5L培養(yǎng)基，接入IOL種子(接種后一級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積為一級發(fā)酵罐容積的30%);經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L (克/升)后，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加4L (原有15L，補(bǔ)加27%，補(bǔ)加以后干重為39.47g/L)培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加5L (原有19L，補(bǔ)加26%，補(bǔ)加以后干重為39. 58g/L)培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加7L (原有24L，補(bǔ)加29%，補(bǔ)加以后干重為38. 71g/L)培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加9L (原有31L，補(bǔ)加29%，補(bǔ)加以后干重為38. 75g/L)，此時發(fā)酵液體積達(dá)到40L (即一級發(fā)酵罐容積的80%)。b.經(jīng)過培養(yǎng)，待發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，開始由一級發(fā)酵罐向空消并降溫后的二級發(fā)酵罐(500L)壓入28L (壓入發(fā)酵液的比例占一級發(fā)酵罐發(fā)酵液體積的70%)發(fā)酵液；
按照本方法完成一級發(fā)酵(即50L發(fā)酵)完成需要5天，正常情況下50L發(fā)酵需要7天。c.此時一級發(fā)酵罐還剩余12L發(fā)酵液，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加3L培養(yǎng)基(原有12L，補(bǔ)加25%，補(bǔ)加以后干重為40g/L)，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加4L培養(yǎng)基(原有15L，補(bǔ)加26. 67%，補(bǔ)加以后干重為39. 47g/L)，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加5L培養(yǎng)基(原有19L，補(bǔ)加26%，補(bǔ)加以后干重為39. 58g/L)，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加7L培養(yǎng)基(原有24L，補(bǔ)加29%，補(bǔ)加以后干重為38. 71g/L)，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加9L培養(yǎng)基(原有31L，補(bǔ)加29%，補(bǔ)加以后干重為38. 75g/L)，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液體積達(dá)到40L且發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后再次向二級發(fā)酵罐壓28L發(fā)酵液；
所述b步驟結(jié)束后，二級發(fā)酵罐有28L發(fā)酵液，通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加122L培養(yǎng)基使得初始發(fā)酵液體積為發(fā)酵罐容積的30%，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加45L培養(yǎng)基(原有150L，補(bǔ)加30%，補(bǔ)加以后干重為38. 46g/L)，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加50L培養(yǎng)基，(原有195L，補(bǔ)加26%，補(bǔ)加以后干重為39. 8g/L)，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加50L培養(yǎng)基，(原有245L，補(bǔ)加20%補(bǔ)加以后干重為41. 52g/L)，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加50L培養(yǎng)基，(原有295L，補(bǔ)加16. 95%，補(bǔ)加以后干重為42. 75g/L)，經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，再通過培養(yǎng)基罐補(bǔ)加55L培養(yǎng)基，(原有345L，補(bǔ)加15. 94%補(bǔ)加以后干重為43. 13g/L)，發(fā)酵液體積達(dá)到400L，繼續(xù)培養(yǎng)到發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L，開始向三級發(fā)酵罐(5000L)壓280L發(fā)酵液；壓入發(fā)酵液的比例占二級`發(fā)酵罐發(fā)酵液體積的70% ;再由一級發(fā)酵罐向二級發(fā)酵罐壓入占一級發(fā)酵罐體積50 70%的發(fā)酵液。然后按照上述方法，通過培養(yǎng)基罐向一級發(fā)酵罐、二級發(fā)酵罐、三級發(fā)酵罐分批壓入滅過菌的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基罐每次向任一發(fā)酵罐補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例分別占該發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%，經(jīng)過培養(yǎng)，任一發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再向該發(fā)酵罐按其內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%補(bǔ)充滅過菌的培養(yǎng)基，直至發(fā)酵液體積達(dá)到該發(fā)酵罐容積的80% ；
按照本方法完成二級發(fā)酵(即500L發(fā)酵)完成需要12天，正常情況下500L發(fā)酵需要15天。三級發(fā)酵罐中的發(fā)酵液體積達(dá)到該發(fā)酵罐容積的80%，且三級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，直接將發(fā)酵液壓到后續(xù)處理。其中，發(fā)酵過程中向任一發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)充培養(yǎng)基時要保證每次補(bǔ)充培養(yǎng)基后發(fā)酵液中的干物質(zhì)含量高于30g/L ;這里對補(bǔ)料的限制僅限任一發(fā)酵罐的發(fā)酵過程，至于剛接種時、N級罐向N+1級罐首次轉(zhuǎn)移發(fā)酵液時則不在此限制范圍內(nèi)。上述發(fā)酵過程中，任一級發(fā)酵罐向下一級發(fā)酵罐壓入發(fā)酵液后，如果下一級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積不足該發(fā)酵罐容積的30%，應(yīng)當(dāng)立即補(bǔ)加培養(yǎng)基，使該級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積一次性補(bǔ)加到發(fā)酵罐容積的30%。
在各級發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，必要時，分別通過碳源罐(5)、氮源罐(6)、堿液罐(4)、泡敵罐(7)通過連接管路向各級發(fā)酵罐注入碳源、氮源、堿液、泡敵，以維持發(fā)酵液的營養(yǎng)成份及異養(yǎng)小球藻的正常生長；補(bǔ)加的方法是通過取樣分析，當(dāng)碳源低于20g/L時就補(bǔ)加碳源達(dá)到40g/L，同時按照碳源氮源=10 1的比例補(bǔ)加氮源；當(dāng)任一發(fā)酵罐內(nèi)有泡沫時則對該發(fā)酵罐補(bǔ)加的泡敵，一次補(bǔ)加泡敵的量為該發(fā)酵罐發(fā)酵液體積的5%。。當(dāng)PH低于7時則向發(fā)酵液里補(bǔ)加堿液；各級發(fā)酵罐的發(fā)酵溫度為36度，當(dāng)溫度偏尚36度時則需要調(diào)T1溫度。當(dāng)然，本實施例中發(fā)酵罐的級數(shù)也可以超出附圖所示的三級的限制，可以根據(jù)需要增加發(fā)酵罐的級數(shù)，并按上述發(fā)酵方法進(jìn)行發(fā)酵。按照現(xiàn)有技術(shù)中的發(fā)酵方法，單個500L罐裝培養(yǎng)基300L，使用卡氏罐接種10L，需要生長15天才能達(dá)到要求并將發(fā)酵液壓到后續(xù)處理。使用本實施例的方法，生長周期最多只需要12天。另外，因為發(fā)酵過程中間，要不停的通風(fēng)、攪拌，需要消耗大量的風(fēng)、電，使用本實施例的技術(shù)方案雖然需要一個50L種子培養(yǎng)過程，但是仍然可以節(jié)約17%的能源消耗。按照現(xiàn)有技術(shù)中的發(fā)酵方法，單個50L罐裝培養(yǎng)基20L，使用卡氏罐接種10L，需要生長7天才能達(dá)到要求、單個500L罐裝培養(yǎng)基300L，使用卡氏罐接種10L，需要生長15天才能達(dá)到要求并將發(fā)酵液壓到后續(xù)處理，總共需要22天。使用本實施例的方法，50L和500L總生長周期最多只需要12天。另外，因為發(fā)酵過程中間，要不停的通風(fēng)、攪拌，需要消耗大量的風(fēng)、電，使用本實施例的技術(shù)方案雖然需要一個50L種子培養(yǎng)過程，但是仍然可以節(jié)約17%的能源消耗。本發(fā)明的半連續(xù)發(fā)酵方法的特點之一在于各培養(yǎng)裝置培養(yǎng)達(dá)到培養(yǎng)目標(biāo)后不是將其內(nèi)的全部發(fā)酵液壓出，而是壓出50 70% (體積比);壓出后補(bǔ)料時，每次補(bǔ)充的培養(yǎng)基占該培養(yǎng)裝置內(nèi)現(xiàn)有發(fā)酵液的10 30% (體積比)，培養(yǎng)至細(xì)胞干重>50克/升后繼續(xù)補(bǔ)充10 30% (體積比)的培養(yǎng)基，直到培養(yǎng)液占該培養(yǎng)裝置容積的80%。這樣每次僅有少量培養(yǎng)基補(bǔ)加到發(fā)酵液中去， 減少了細(xì)胞生長的不適應(yīng)性，減少了停滯期；同時比較大的培養(yǎng)基/種子比例使細(xì)胞生長更快，進(jìn)一步提高了培養(yǎng)(生產(chǎn))效率。
權(quán)利要求
1.異養(yǎng)小球藻的半連續(xù)發(fā)酵方法，方法的特征是按以下步驟進(jìn)行 a.一級發(fā)酵罐(I)空消、降溫后，培養(yǎng)基罐(8)向一級發(fā)酵罐(I)壓入滅過菌的培養(yǎng)基，然后接種異養(yǎng)小球藻；接種后一級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積為一級發(fā)酵罐(I)容積的30 50% ；經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，培養(yǎng)基罐(8)繼續(xù)向一級發(fā)酵罐(I)補(bǔ)充滅過菌的培養(yǎng)基，補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例占發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30% ;經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重再次達(dá)到50g/L后，繼續(xù)向一級發(fā)酵罐(I)按其內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%補(bǔ)充滅過菌的培養(yǎng)基，直到補(bǔ)加到一級發(fā)酵罐(I)容積的80% ； b.經(jīng)過培養(yǎng)，發(fā)酵液干重再次達(dá)到50g/L后，一級發(fā)酵罐(I)向空消并降溫后的二級發(fā)酵罐(2)壓入發(fā)酵液，壓入發(fā)酵液的比例占一級發(fā)酵罐(I)發(fā)酵液體積的50 70% ； c.壓料后，培養(yǎng)基罐(8)向一級發(fā)酵罐(I)和二級發(fā)酵罐(2)分批壓入滅過菌的培養(yǎng)基，每次補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例占各發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30% ;經(jīng)過培養(yǎng)，任一發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再通過培養(yǎng)基罐(8)向該發(fā)酵罐按其內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%補(bǔ)充滅過菌的培養(yǎng)基，直至發(fā)酵液體積達(dá)到該發(fā)酵罐容積的80% ； d.經(jīng)過培養(yǎng)，二級發(fā)酵罐(2)內(nèi)的發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，將二級發(fā)酵罐(2 )內(nèi)的發(fā)酵液壓入三級發(fā)酵罐(3 )，壓入發(fā)酵液占二級發(fā)酵罐(2 )發(fā)酵液體積的50 70%，之后，一級發(fā)酵罐(I)向二級發(fā)酵罐(2)壓入占一級發(fā)酵罐體積50 70%的發(fā)酵液； 然后培養(yǎng)基罐向一級發(fā)酵罐(I)、二級發(fā)酵罐(2)、三級發(fā)酵罐(3)分批壓入滅過菌的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基罐每次向任一發(fā)酵罐補(bǔ)充培養(yǎng)基的比例分別占該發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%，經(jīng)過培養(yǎng)，任一發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液干重達(dá)到50g/L后，再向該發(fā)酵罐按其內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%補(bǔ)充滅過菌的培養(yǎng)基，直至發(fā)酵液體積達(dá)到該發(fā)酵罐容積的80% ； 三級發(fā)酵罐(3)中的發(fā)酵液體積達(dá)到該發(fā)酵罐容積的80%，且三級發(fā)酵罐(3)內(nèi)發(fā)酵液干重再次達(dá)到50g/L后，直接壓到后續(xù)處理； 除任一發(fā)酵罐剛接種時、任一級發(fā)酵罐剛接收上一級發(fā)酵罐壓過來的發(fā)酵液時兩種情形外，上述發(fā)酵過程中向任一發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)充培養(yǎng)基時要保證每次補(bǔ)充培養(yǎng)基后發(fā)酵液中的干物質(zhì)含量高于30g/L ； 上述發(fā)酵過程中，任一級發(fā)酵罐向下一級發(fā)酵罐壓入發(fā)酵液后，如果下一級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積不足該發(fā)酵罐容積的30%，應(yīng)當(dāng)立即補(bǔ)加培養(yǎng)基，使該級發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積一次性補(bǔ)加到發(fā)酵罐容積的30% ;上述一次性補(bǔ)充培養(yǎng)基時，補(bǔ)充培養(yǎng)基的體積不受發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的10 30%的限制； 在各級發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，必要時分別通過碳源罐(5)、氮源罐(6)、堿液罐(4)、泡敵罐(7)通過連接管路向各級發(fā)酵罐注入碳源、氮源、堿液、泡敵，補(bǔ)加的方法是通過取樣分析，當(dāng)碳源低于20g/L時就補(bǔ)加碳源達(dá)到40g/L，同時按照碳源氮源=10 I的比例補(bǔ)加氮源；當(dāng)任一發(fā)酵罐內(nèi)有泡沫時則對該發(fā)酵罐補(bǔ)加泡敵,一次補(bǔ)加泡敵的量為該發(fā)酵罐發(fā)酵液體積的5%0 ;當(dāng)PH低于7時則向發(fā)酵液里補(bǔ)加堿液；各級發(fā)酵罐的發(fā)酵溫度為36度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種異養(yǎng)小球藻的半連續(xù)發(fā)酵方法，按以下步驟進(jìn)行a.向一級發(fā)酵罐壓入培養(yǎng)基并接種異養(yǎng)小球藻；重復(fù)培養(yǎng)－補(bǔ)充培養(yǎng)基的操作直到補(bǔ)加到一級發(fā)酵罐容積的80%；b.發(fā)酵液干重再次達(dá)到50g/L后，向二級發(fā)酵罐壓入50～70%的發(fā)酵液；c.向一級發(fā)酵罐和二級發(fā)酵罐壓入滅過菌的培養(yǎng)基，任一發(fā)酵罐發(fā)酵液干重達(dá)50g/L后，再向該發(fā)酵罐補(bǔ)充培養(yǎng)基，直至發(fā)酵液體積達(dá)該發(fā)酵罐容積的80%；d.將二級發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液壓入三級發(fā)酵罐，重復(fù)培養(yǎng)－補(bǔ)充培養(yǎng)基的操作，發(fā)酵完成后壓到后續(xù)處理；本方法滿足了比較大的培養(yǎng)基/種子比例要求。減少了細(xì)胞生長的不適應(yīng)性，使細(xì)胞生長更快，減少了停滯期，適于進(jìn)行半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/12GK103060199SQ20131003184
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者畢生雷, 杜風(fēng)光, 孫沛勇, 丁凌飛, 李勇, 周鵬, 銀會娟, 吳慶余, 盧悅 申請人:河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司, 清華大學(xué)