專利名稱：油菜素內(nèi)酯失活基因bas1的根系重組表達載體及其構(gòu)建方法和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領域，具體地說，是涉及油菜素內(nèi)酯基因根系重組表達載體的構(gòu)建和應用。
背景技術(shù)：
油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroid，BR)是甾醇類激素，在植物體內(nèi)的含量較少，但活性較高，對植物生長發(fā)育的多個方面具有顯著的生理效應，而且其可增強植物的抗逆性。研究表明，鹽堿、干旱等逆境脅迫條件下外施油菜素內(nèi)酯可提高植物的耐逆性。但植物體內(nèi)油菜素內(nèi)酯水平的高低主要是通過原位油菜素內(nèi)酯代謝相關基因的表達與調(diào)控來決定。BASl基因編碼一個細胞色素P450 (CYP72B1)，過量表達導致油菜素內(nèi)酯C-26羥基羥化，但C-26 羥化后的油菜素內(nèi)酯生物活性遠低于正常油菜素內(nèi)酯，因此BASl作為C-26-羥化酶，是一個重要的油菜素內(nèi)酯失活基因。并且在basl突變體中油菜素內(nèi)酯合成前體油菜素甾酮和6-脫氧油菜素甾酮的水平也受到抑制，因此認為BASl基因在油菜素內(nèi)酯合成前體的代謝過程中也起作用。作物根系是植株的支柱，是作物吸收養(yǎng)分和水分的主要器官，還是鹽堿、干旱等逆境脅迫首先作用的器官，逆境通過影響根系活動從而影響到植株地上部的生長發(fā)育乃至產(chǎn)量形成。因此，維持根系的生理功能，增強根系對水分和養(yǎng)分的吸收能力，是提高作物耐逆性的關鍵。但由于根系生長在地下，根區(qū)環(huán)境的復雜性及根系研究方法和手段的局限性使根系性狀的研究與改良相對滯后。因此，本發(fā)明利用根系特異啟動子構(gòu)建根系重組表達載體，為利用油菜素內(nèi)酯基因進行根系改良提供途徑。煙草TobRB7基因為根組織特異性表達基因，已知的啟動子區(qū)段長為1878bp，并且該啟動子具有雙向啟動子功能，在-823 +70bp區(qū)域該啟動子正反方向插入均表現(xiàn)出較強的根組織特異性表達調(diào)控功能。因此，本發(fā)明以TobRB7基因啟動子-823 +70bp區(qū)域為主要研究區(qū)域。本發(fā)明就是針對以上背景技術(shù)，通過從煙草基因組中克隆煙草根特異性表達啟動子，構(gòu)建根系特異表達載體，從擬南芥中獲得油菜素內(nèi)酯失活基因BAS1，并將其整合到根系表達載體上，獲得油菜素內(nèi)酯失活基因的根系重組表達載體，使油菜素內(nèi)酯基因在植物根系特異表達。該載體的構(gòu)建可為作物耐逆改良提供新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用煙草根特異啟動子使油菜素內(nèi)酯基因在根系特異表達的方法。所解決的技術(shù)問題是使目的基因在根系特異表達。本發(fā)明利用煙草根特異啟動子使油菜素內(nèi)酯失活基因在根系定向表達的方法，包括根系特異啟動子的克隆、根系表達載體的構(gòu)建，油菜素內(nèi)酯失活基因的克隆、油菜素內(nèi)酯基因根系重組表達載體的構(gòu)建，最終獲得油菜素內(nèi)酯基因根系特異表達的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種植物根系表達載體 pCAMBIA2301-TobRB7-rbc，以 pCAMBIA2301-35S_rbc 載體為骨架，在EcoR I和Sac I酶切位點 克隆入煙草TobRB7的啟動子片段。上述的植物根系表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-rbc的構(gòu)建方法，)以煙草DNA為模板，以 TobRB7-Fl :5’ -GGAATTCGGCATACTTTTAGAATGCGT-3’ (SEQ ID NO.1)和 TobRB7_Rl 5’ -CGAGCTCTTCTCACTAGAAAAATGCCC-3’ (SEQ ID NO. 2)為引物，通過 PCR 擴增 TobRB7 的啟動子區(qū)域，用EcoR I和Sac I對PCR產(chǎn)物和pCAMBIA2301-35S_rbc載體同時進行雙酶切，用 T41igase 連接成 pCAMBIA2301-TobRB7_rbc。一種植物根系重組表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl，是以所述pCAMBIA2301-TobRB7-rbc載體為骨架，在Xba I和Kpn I酶切位點克隆入擬南芥BASl基因編碼區(qū)的全長片段。上述植物根系重組表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl的構(gòu)建方法，是將油菜素內(nèi)酯基因BASl整合到權(quán)利要求1的根系表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-rbc上，獲得油菜素內(nèi)酯基因BASl的根系重組表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl。具體是以擬南芥RNA為模板，以 BASl-Fl :5’-TGCTCTAGAAAGAAACCAAACTCGC AAAG-3’ (SEQ ID NO. 3)；BAS1-R1 5’ -CGGGGTACCTTCCAAGTCCGGAACAAA-3’ (SEQ IDN0. 4)為引物，擴增包括 BASl 編碼區(qū)的全長片段，用Xba I和Kpn I對PCR產(chǎn)物和pCAMBIA2301-TobRB7_rbc載體同時進行雙酶切，用T41igase 連接成 pCAMBIA2301-TobRB7_BASl。上述植物表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl用于煙草的農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化，獲得油菜素內(nèi)酯失活基因根系特異表達的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明還公開了種油菜素內(nèi)酯失活基因根系特異表達的轉(zhuǎn)基因煙草，是用植物表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化煙草而獲得。本發(fā)明克隆了煙草根系啟動子TobRB7，構(gòu)建了根系特異表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-rbc，再將油菜素內(nèi)酯失活基因BASl整合到上述根系特異表達載體上，獲得重組載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl，再將該重組載體轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因煙草。該根系重組表達載體可以使油菜素內(nèi)酯基因在根系定向表達，同時為植物根系改良提供可能途徑。


圖1 是植物表達載體 pCAMBIA2301-TobRB7-rbc 的酶切結(jié)果 M DL2000DNAmarker, 1、2、3 均為構(gòu)建的 pCAMBIA2301-TobRB7_rbc 載體。圖2是油菜素內(nèi)酯失活基因BASl PCR擴增結(jié)果M DL2000DNA marker。圖3是油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的根系重組表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl的構(gòu)建步驟。圖4是油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的根系重組表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl的物理圖譜。圖5 是載體 pCAMBIA2301-TobRB7-BASl 的酶切結(jié)果 M 為 DL2000，1、2、3 均為構(gòu)建的 pCAMBIA2301-TobRB7-BASl 載體。圖6是轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測M DL2000DNA marker ;1_10為轉(zhuǎn)基因植株?！?+ ”為pCAMBIA2301-TobRB7-BASl 質(zhì)粒，為陰性對照。圖7是轉(zhuǎn)基因植株的生長狀況I為過量表達BASl基因的轉(zhuǎn)基因煙草，2為根系表達BASl基因的轉(zhuǎn)基因煙草。圖8是轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR分析CK為非轉(zhuǎn)基因植株，I為過量表達BASl基因的轉(zhuǎn)基因煙草，2為根系表達BASl基因的轉(zhuǎn)基因煙草。
具體實施例方式下述實施例中，PTG19-T載體購于上海捷瑞生物工程有限公司；質(zhì)粒pCAMBIA2301-35s-rbc (鄭卿，抗I型糖尿病基因轉(zhuǎn)化煙草、番茄的研究[D]，揚州大學碩士 研究生畢業(yè)論文，2010)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)實驗室保存。1、煙草TobRB7啟動子序列的獲得以煙草為實驗材料，提取其基因組DNA并以其為模板，從公布的煙草基因組數(shù)據(jù)庫中TobRB7基因(GenBank登錄號S45406)啟動子區(qū)域設計引物，PCR擴增TobRB7啟動子序列。在引物兩端分別引入EcoR I和Sac I酶切位點，引物序列如下TobRB7-Fl :5’ -GGAATTCGGCATACTTTTAGAATGCGT-3'，引入 EcoR I 酶切位點；TobRB7_Rl 5’ -CGAGCTCTTCTCACTAGAAAA ATGCCC-3’，引入 Sac I 酶切位點。PCR 反應程序為94°C預變性 5min;94°C變性 40s，56°C復性 40s，72°C延伸 lmin，共 35 個循環(huán)；再 72°C延伸 IOmin0對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶純化回收，將擴增產(chǎn)物連接到PTG19-T載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，挑取在Amp抗性平板上長出的單克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定并進行測序，將TobRB7啟動子序列的質(zhì)粒命名為p-TobRB7。通過核苷酸測序后發(fā)現(xiàn)擴增的啟動子片段全長為892bp，用BLAST程序進行核苷酸同源性檢索，結(jié)果顯示實驗獲得的啟動子片段與已知的TobRB7 (S45406)啟動子部分區(qū)域序列基本一致，可用于以后研究。2、攜帶TobRB7啟動子的植物根系特異表達載體的構(gòu)建將質(zhì)粒p-TobRB7 和質(zhì)粒 pCAMBIA2301-35s_rbc 在 37 °C 條件下分別用 EcoR1、Sac I雙酶切3h，酶切產(chǎn)物分別進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收892bp的TobRB7的啟動子序列和12kb的質(zhì)粒pCAMBIA2301-35s-rbc酶切后的大片段，用T4DNA連接酶4°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，挑取在卡那霉素(Kan)抗性平板上長出的單克隆，提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定和酶切鑒定。將獲得的重組表達載體命名為pCAMBIA2301-TobRB7-rbc。圖1 為 pCAMBIA2301-TobRB7_rbc 酶切結(jié)果，說明 TobRB7 已成功構(gòu)建到pCAMBIA2301-35s-rbc質(zhì)粒上。3、油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的克隆以野生型擬南芥植株為實驗材料，提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板。根據(jù)已報道擬南芥BASl基因(GenBank No. NM_128228. 3)mRNA序列設計引物，PCR擴增BASl編碼區(qū)的全長片段。在引物兩端分別引入Xba I和Kpn I酶切位點，引物序列如下BASl-Fl :5’ -TGCTCTAGAAAGAAACCAAACTCGCAAAG-3，，引入 Xba I 酶切位點；BAS1_R1 :5’ -CGGGGTACCTTCCAAGTCCGGAACAAA-3’，引入Kpn I酶切位點。PCR反應程序為94°C預變性5min ;94°C變性40s，52°C復性 40s，72°C延伸 2min，共 35 個循環(huán)；再 72°C延伸 IOmin0對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)，切下目的條帶純化回收，將擴增產(chǎn)物連接到PTG19-T載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，挑取在Amp抗性平板上長出的單克隆，提取質(zhì)粒、酶切鑒定并進行測序，將BASl基因的質(zhì)粒命名為p-BASl。通過核苷酸測序后發(fā)現(xiàn)擴增的序列全長為1770bp，用BLAST程序進行核苷酸同源性檢索，結(jié)果顯示實驗獲得的基因片段與已知的BASl (NM_128228. 3)基因的開放閱讀框(ORF)核苷酸序列一致性為99. 94%，氨基酸序列一致性為99. 81%?？捎糜谝院笱芯?。4、油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的根系重組表達載體的構(gòu)建將質(zhì)粒p-BASl 和質(zhì)粒 pCAMBIA2301-TobRB7-rbc 在 37 °C 條件下分別用 Kpn1、Xba I雙酶切3h，酶切產(chǎn)物分別進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收1770bp的BASl基因序列和12kb的質(zhì)粒pCAMBIA2301-TobRB7-rbc酶切后的大片段，用T4DNA連接酶4°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，挑取在Kan抗性平板上長出的單克隆，提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定和酶切鑒定。將獲得的油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的根系重組表達載體命名為 pCAMBIA2301-TobRB7-BASl。 圖3為油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的根系重組表達載體pCAMBIA2301-TobRB7_BASl的構(gòu)建步驟。圖4為油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的重組表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl的物理圖譜。圖5為載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl的酶切結(jié)果，說明油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的根系重組表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl構(gòu)建成功。5、TobRB7啟動子驅(qū)動的BASl基因在煙草根中特異表達(I)重組表達載體 pCAMBIA2301-TobRB7-BASl 轉(zhuǎn)化煙草將4中構(gòu)建的重組表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，挑取在Rif和Kan抗性平板上生長的單菌落進行PCR鑒定。將含有重組表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl的農(nóng)桿菌采用葉盤轉(zhuǎn)化法(王關林和方宏筠.植物基因工程[M]. 1998)轉(zhuǎn)化煙草，對當代轉(zhuǎn)基因植株(T0代)進行PCR檢測。收獲后對Tl代種子在含有Kan的MS培養(yǎng)基上篩選陽性苗，并進行RT-PCR分析。(2)轉(zhuǎn)基因煙草的檢測以TO代轉(zhuǎn)基因植株總DNA為模板，以質(zhì)粒為陽性對照，以未轉(zhuǎn)化植株的總DNA為陰性對照，用 BASl 基因引物(BAS1-F2 :5’ -AAGAAACCAAACTCGCAAAG-3’ (SEQ ID NO. 5)和BAS1-R2 :5’ -TTCCAAGTCCGGAACAAA-3’ (SEQIDN0. 6))進行 PCR 擴增。陽性對照和轉(zhuǎn)基因植株擴增出約1770bp的目的片段，而陰性對照無擴增帶(圖6)。證明油菜素內(nèi)酯基因BASl已整合到煙草基因組中。圖7為轉(zhuǎn)基因植株生長狀況，可以看出組成型表達的轉(zhuǎn)基因煙草植株出現(xiàn)矮化，但是根系特異表達的轉(zhuǎn)基因煙草生長正常。提取Tl代煙草葉片、根的總RNA，以轉(zhuǎn)基因煙草植株cDNA為模板，以未轉(zhuǎn)化煙草植株的cDNA為陰性對照，進行BASl基因的半定量表達分析。根據(jù)BASl基因的cDNA序列設計RT-PCR引物，引物為BAS1-F3 :5’ -ACGGTGAAGTTGAGGTAGA-3’ (SEQ ID NO. 7)和 BAS1-R3 :5’-AACATAAGGACGGTAGGTG-3’ (SEQ IDNO. 8)，以 actin 基因(GenBank No EU938079)為內(nèi)部參照基因(469bp)，引物為 actin-F:5' -CCTCTTAACCCGAAGGCTAA-3' (SEQ IDNO. 9), actin-R:5/ -GAAGGTTGGAAAAGGACTTC-3'(SEQ ID NO. 10)。BASl基因的半定量表達結(jié)果(圖8)進一步證實，根系特異表達載體使BASl基因僅在根系特異表達，在葉中基本不表達。
SEQUENCE LISTING
<11D>江蘇省農(nóng)業(yè)科學院
<120>油菜素內(nèi)_失活基因BASl的根系重組表達載體及其構(gòu)建方法和應用<130>
<160>10 <l/0>Patentln version 3.3
<210>I
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>I
ggaattcggc atacttttag aatgcgt27
<210>2
<211>27
<212>DNA<213>人工序列
<400>2
cgagctcttc tcactagaaa aatgccc27
<210>3
<211>29
<212>DNA<213>人1:序列
<400>3
tgctctagaa agaaaccaaa ctcgcaaag29
<210>4
<211>27
<212>DNA<213>人工序列

權(quán)利要求
1.一種植物根系表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-rbc，其特征在于， pCAMBIA2301-35S-rbc載體為骨架，在EcoR I和Sac I酶切位點克隆入煙草TobRB7的啟動子片段。
2.權(quán)利要求1所述的植物根系表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-rbc的構(gòu)建方法，其特征在于以煙草 DNA 為模板，以 TobRB7-Fl :5’ -GGAATTCGGCATACTTTTAGAATGCGT-3’ 和 TobRB7-Rl :5’-CGAGCTCTTCTCACTAGAAAAATGCCC-3’ 為引物，通過 PCR 擴增 TobRB7 的啟動子區(qū)域，用EcoR I和Sac I對PCR產(chǎn)物和pCAMBIA2301-35S_rbc載體同時進行雙酶切，用T4 Iigase 連接成 pCAMBIA2301-TobRB7_rbc。
3.一種植物根系重組表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl，其特征在于，以權(quán)利要求1 所述pCAMBIA2301-TobRB7-rbc載體為骨架，在Xba I和Kpn I酶切位點克隆入擬南芥BASl 基因編碼區(qū)的全長片段。
4.一種植物根系重組表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl的構(gòu)建方法，其特征在于， 將油菜素內(nèi)酯基因BASl整合到權(quán)利要求1的根系表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-rbc上， 獲得油菜素內(nèi)酯基因BASl的根系重組表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于以擬南芥RNA為模板，以BASl-Fl 5，-TGCTCTAGAAAGAAACCAAACTCGCAA AG-3，；BAS1-R1 :5，-CGGGGTACCTTCCAAGTCC GGAACAAA-3’為引物，擴增包括BASl編碼區(qū)的全長片段，用Xba I和Kpn I對 PCR產(chǎn)物和pCAMBIA2301-TobRB7-rbc載體同時進行雙酶切，用T4 Iigase連接成 pCAMBIA2301-TobRB7-BASl。
6.一種油菜素內(nèi)酯失活基因根系特異表達的轉(zhuǎn)基因煙草，其特征在于，是用植物表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化煙草而獲得。
全文摘要
本發(fā)明提供了油菜素內(nèi)酯失活基因BAS1的根系重組表達載體的構(gòu)建。本發(fā)明克隆了煙草根系啟動子TobRB7，構(gòu)建了根系特異表達載體pCAMBIA2301-TobRB7-rbc，再將油菜素內(nèi)酯失活基因BAS1整合到上述根系特異表達載體上，獲得重組載體pCAMBIA2301-TobRB7-BAS1，再將該重組載體轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因煙草。該根系重組表達載體可以使油菜素內(nèi)酯基因在根系定向表達，同時為植物根系改良提供可能途徑。
文檔編號C12N15/82GK103014061SQ201310015909
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月16日
發(fā)明者束紅梅, 倪萬潮, 郭書巧, 鞏元勇, 沈新蓮, 張香桂, 徐鵬 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院