人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體和含有該抗體作為有效成分的癌癥治療藥的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明人將通過對表達抗人上皮調(diào)節(jié)蛋白的癌細胞發(fā)揮細胞毒活性和中和活性而抑制癌細胞增殖的人源化EP27抗體的可變區(qū)序列中的氨基酸殘基適當(dāng)取代，從而成功制作了：顯示出作為非人動物的食蟹猴和人動物間的種屬交叉反應(yīng)性的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體、化學(xué)分解得到抑制的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體、等電點降低的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體、熱變性中間溫度升高的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體、以及締合體量減少的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。
【專利說明】人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體和含有該抗體作為有效成分的癌癥治療藥

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及癌癥的治療方法、以及癌細胞增殖抑制劑和抗癌藥。

【背景技術(shù)】
[0002]在發(fā)達國家癌癥是死亡率的主要原因。為了治療癌癥，在過去的50年間開發(fā)了許多化療藥。大部分化療藥可以分為烷基化劑、代謝拮抗劑、蒽環(huán)霉素(anthracycline)、植物生物堿、拓撲異構(gòu)酶抑制劑和抗腫瘤藥。這些藥物均影響細胞分裂或DNA的合成，通過以某種形式發(fā)揮作用的機制產(chǎn)生療效。
[0003]特定的化療藥的有效性在癌癥之間、患者之間、或者根據(jù)各個患者中的經(jīng)過時間而不同。暴露于化療藥下的癌細胞往往會對這種化療藥產(chǎn)生耐性,對其他幾種抗癌藥也同樣產(chǎn)生交叉耐性。而且，根據(jù)上述化療藥的機理，為了控制這些化療藥對正常細胞產(chǎn)生的細胞毒的結(jié)果帶來的副作用，化療藥的用量或用法在很多情況下都受到制約。
[0004]近年來，人們在推進以在癌細胞中特異性表達的分子為靶的分子靶向藥物的開發(fā)，以代替現(xiàn)有的化療藥。隨著這種分子靶向藥物的問世，可以避免現(xiàn)有的化療藥所固有的副作用，實現(xiàn)有助于癌癥患者的QOL的癌癥治療。這種分子靶向藥物除了包含低分子(small molecul e)藥物以外,還包含抗體等高分子藥物。治療抗體是生物體內(nèi)與生俱來的分子，除了具有對生物體的毒性低的優(yōu)點以外，還具有通過由效應(yīng)子功能介導(dǎo)的細胞毒活性等低分子藥物以外的作用機制特異性地殺傷靶細胞、發(fā)揮療效的優(yōu)點，因此近年來有多種治療抗體上市。
[0005]作為這種通過由效應(yīng)子功能介導(dǎo)的細胞毒活性等低分子藥物以外的作用機制特異性地殺傷靶細胞的抗體，公開了以在大腸癌、肺腺癌、胰癌、胃癌、腎癌中高度表達的上皮調(diào)節(jié)蛋白(Epiregulin)為靶的治療抗體(專利文獻I)。具體而言，在測定抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的補體依賴性細胞毒(complement-dependent cytotoxicity; Q)C)活性、以及抗體依賴性細胞毒(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC)活性時，發(fā)現(xiàn)抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體對表達上皮調(diào)節(jié)蛋白的細胞具有CDC活性和ADCC活性。另外，明確了抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體對癌細胞株具有通過中和作用產(chǎn)生的增殖抑制效果。而且，根據(jù)以上的認知，發(fā)現(xiàn)抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體對原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性的各種癌癥的診斷、預(yù)防和治療有效。
[0006]包括上述抗癌藥在內(nèi)的任何新型候選藥物為了銷售也必須通過嚴密的試驗。例如,這種試驗分為臨床前試驗和臨床試驗。其中，后者通常進一步細分為I期試驗、II期試驗和III期試驗,使用人患者來進行,而前者使用動物來進行。通常，臨床前試驗的目的在于:證明候選藥物起作用、同時該藥物是有效且安全的。具體而言，這些動物試驗的目的在于:證明藥物沒有致癌性、致突變性或致畸性，同時理解藥物的藥物動力學(xué)。只有在臨床前試驗中確立了被測藥物對動物的安全性和被測藥物有效的可能性的情況下，才認可對人給予該被測藥物的臨床試驗。
[0007]在許多情況下，低分子(small molecule)的被測藥物(例如由蒽環(huán)霉素衍生的新型抗癌藥)在動物體內(nèi)的作用都能夠作為對人給藥時該藥物的預(yù)測作用的指標。因此，由這種臨床前試驗得到的數(shù)據(jù)通常能提供對人給藥時的作用的高度預(yù)測性。但是，并不是在所有種類的被測藥物中都會得到這種預(yù)測性，來自臨床前試驗結(jié)果的預(yù)測性和關(guān)于臨床試驗認可候選藥物的可能性都非常小。
[0008]一般說來，抗體通?？梢酝ㄟ^極其特異性地識別蛋白性的靶分子來發(fā)揮作用。在大多數(shù)情況下，作為單克隆抗體的被測抗體藥物只識別靶分子上的單一位點或單一表位。由于單克隆抗體向來就具有的高靶向識別功能，所以抗體成為用于藥物開發(fā)的意義非常深遠的候選，但另一方面，由于該識別功能，有時難以進行臨床前試驗。這是由于在這種抗體所結(jié)合的靶分子的序列中存在種依賴性的突變。在人中，例如，經(jīng)由表位X特異性地識別分子Y、并且與該分子結(jié)合的單克隆抗體，在用于臨床前試驗的生物種中的對應(yīng)靶分子(直向同源物)Y’中對應(yīng)存在的表位V還有可能與人中對應(yīng)的靶分子中存在的X不同，在非人種中常常無法特異性地識別直向同源物分子Y’并與該分子結(jié)合。即使是對人和靈長類抗原具有反應(yīng)性的單克隆抗體組間，只與人和黑猩猩抗原相同體反應(yīng)的抗體的例子也增多。例如，關(guān)于抗CD3單克隆抗體，觀察到了這樣的例子。應(yīng)用最廣泛且性質(zhì)了解最全面的、CD3復(fù)合體的特異性單克隆抗體之一是0ΚΤ-3，其與黑猩猩CD3反應(yīng)，但不與其他靈長類、例如恒河猴的CD3同源體或狗CD3反應(yīng)(非專利文獻2)。另一方面，還存在識別恒河猴抗原、而不識別其人直向同源物的單克隆抗體的例子。該組的一個例子是針對來自恒河猴的CD3的單克隆抗體FN-18 (非專利文獻2)。
[0009]為了應(yīng)對由上述的單克隆抗體的高特異性產(chǎn)生的臨床前動物試驗中的問題，采取了幾種策略。
[0010]第一種公知的方法是:使用黑猩猩模型來實施被測抗體藥物的臨床前試驗。黑猩猩的遺傳親緣與人最接近，其基因組的99%與人的基因組相同，所以被測抗體藥物特異性結(jié)合的靶分子在黑猩猩中的突變與該分子在人中的突變相同的可能性非常大，實際上Schlereth等人發(fā)現(xiàn)了⑶3的突變在人和黑猩猩中共通(非專利文獻3)。因此，認為在黑猩猩中該分子不被被測抗體藥物識別的危險性小。但是，使用黑猩猩的試驗非常昂貴，而且還伴有倫理上的問題。而且，由于黑猩猩是瀕臨滅絕的動物，所以可用于實驗的動物數(shù)量非常受限。因此，在大部分被測抗體藥物的開發(fā)中，黑猩猩中的這種臨床前試驗被排除。
[0011]第二種方法是:使臨床前試驗中使用的分子適應(yīng)該試驗中使用的動物。在該方法中，由于是對試驗動物給藥，所以通過構(gòu)建所謂的“代理(surrogate,替代)”抗體,在臨床前試驗中獲得必須的安全性信息。通常，這種代理抗體是非代理抗體，即被修飾成特異性識別人中的實際的被測抗體藥物所結(jié)合的靶分子的試驗動物的直向同源物、而且與該直向同源物結(jié)合的抗體。因此，在使用這種“代理”抗體的方法中，分別開發(fā)兩個不同的分子、即被測臨床藥物和該被測臨床藥物的靶向特異性所對應(yīng)的、用于動物種的臨床前試驗的被測臨床前藥物，必須研究其安全性等。這種代理方法的最大缺點在于:用于臨床前試驗的代理抗體是被測臨床抗體藥物的修飾物。因此，通過使用了代理抗體的臨床前試驗得到的數(shù)據(jù)常常無法直接應(yīng)用于人。因此，基于采用這些方法的臨床前研究的試驗結(jié)果的臨床試驗結(jié)果的結(jié)果預(yù)見性有可能降低。
[0012]上述方法是使被測藥物適應(yīng)于臨床前試驗中使用的動物的方法。另一方面，其他公知的方法是使臨床前試驗中使用的動物適應(yīng)給予人的候選藥物的方法。
[0013]使試驗動物適應(yīng)打算給予人的被測抗體藥物的一個例子，是生成表達被測抗體藥物特異性結(jié)合的人分子以代替表達該試驗動物種的內(nèi)源性非人分子的轉(zhuǎn)基因動物。在該方式中，臨床前試驗中給予的被測抗體藥物在該轉(zhuǎn)基因試驗動物中與人抗原結(jié)合。作為這種例子，在由Bugelski等人進行的研究中，為了預(yù)測人患者的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的長期治療，使用人CD4轉(zhuǎn)基因小鼠，進行單克隆抗體凱利昔單抗的臨床前安全性評價。凱利昔單抗是對人和黑猩猩的CD4具有特異性的單克隆抗體。Bugelski等人得出以下結(jié)論:表達人蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠的使用將提供在受限定的使用具有交叉種特異性的生物藥物的黑猩猩中的研究的有效替代方法。但是，為了試驗?zāi)康亩谱鬓D(zhuǎn)基因動物時，需要大量的勞力，因此耗費時間和成本。
[0014]現(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻
專利文獻 1:W02008/047723 ；
非專利文獻
非專利文獻 I J.Med.Primatol.(1986) 15，441-451 ；
非專利文獻 2:J.Med.Primatol.(2001) 40，141-147 ；
非專利文獻 3:Cancer Immunol.1mmunother.(2005) 20, 1-12 ；
非專利文獻 4:Hum .Exp.Toxicol.(2000) 19，230-243。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]發(fā)明所要解決的課題
本發(fā)明涉及顯示出非人動物和人動物間的種屬交叉反應(yīng)性(cross-speciesreactivity)的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。本發(fā)明還涉及化學(xué)分解得到了抑制的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。本發(fā)明還涉及等電點降低的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。本發(fā)明還涉及締合體量減少的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。本發(fā)明還涉及包含上述的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的藥物組合物、或癌癥治療藥。本發(fā)明還涉及上述抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的制備方法。
[0016]用于解決課題的方法
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn):通過將對表達人上皮調(diào)節(jié)蛋白的癌細胞發(fā)揮細胞毒活性和中和活性而抑制癌細胞增殖的人源化EP27抗體的可變區(qū)序列中的氨基酸殘基取代成精氨酸殘基，對從食蟹猴中分離的上皮調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合活性與對人上皮調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合活性之比上升。即，本發(fā)明人制作了顯示出作為非人動物的食蟹猴和人動物間的種屬交叉反應(yīng)性(cross-species reactivity)的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。另外，通過適當(dāng)取代人源化EP27抗體的可變區(qū)序列中的氨基酸殘基，制作了化學(xué)分解得到抑制的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。而且，通過適當(dāng)取代人源化EP27抗體的可變區(qū)序列中的氨基酸殘基，制作了等電點降低的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。另外，通過適當(dāng)取代人源化EP27抗體的可變區(qū)序列中的氨基酸殘基，制作了締合體量減少的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。另外，本發(fā)明人明確了:具有這些性質(zhì)的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體對癌細胞株顯示出源自細胞毒活性和中和活性的增殖抑制效果。而且，根據(jù)以上認知，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體對原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性的各種癌癥的治療有效，完成了本發(fā)明。
[0017]更具體而言，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容。
[0018][I]抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，其特征在于:是與包含SEQ ID NO: 9、10和11所表示的重鏈可變區(qū)⑶R以及SEQ ID NO: 12、13和14所表示的輕鏈可變區(qū)⑶R的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體所結(jié)合的表位結(jié)合的抗體，其中，對SEQ ID NO: 170所表示的猴上皮調(diào)節(jié)蛋白的KD值(cEREG KD)與對SEQ ID NO: 34所表示的人上皮調(diào)節(jié)蛋白的KD值(hEREG KD)之比(cEREG KD/hEREG KD)小于包含SEQ ID NO: 9、10和11所表示的重鏈可變區(qū)CDR以及SEQID NO: 12、13和14所表示的輕鏈可變區(qū)⑶R的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的cEREG KD/hEREGKD0
[0019][2] [I]所述的抗體，其中，cEREG KD/hEREG KD 小于 40。
[0020][3] [I]所述的抗體，其中，cEREG KD/hEREG KD 小于 10。
[0021][4] [I]所述的抗體，其中，cEREG KD/hEREG KD 小于 6。
[0022][5] [I]所述的抗體，其中，cEREG KD/hEREG KD 小于 4。
[0023][6] [I]~[5]中任一項所述的抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)以及輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 9所表示的重鏈CDRl、選自SEQ ID NO: 161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101 和 100 的重鏈 CDR2、以及選自 SEQ IDNO: 158、154、152、151、112、111、110和11的重鏈CDR3，所述輕鏈可變區(qū)包含選自SEQ IDNO: 163、68、67和12的輕鏈CDR1、選自SEQ ID NO: 71、69和13的輕鏈CDR2、以及選自SEQID NO: 164、48、47 和 14 的輕鏈 CDR3。
[0024][7] [I]~[5 ]中任一項所述的抗體，該抗體包含:選自SEQ ID NO: 150,149,
148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、
124、123、122、121、120、119、118、117、116 和 115 的重鏈可變區(qū)、以及選自 SEQ ID NO: 141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57 和 29 的輕鏈可變區(qū)。
[0025][8]選自以下任一項的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體:
(1)抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，其包含選自SEQID NO: 150、149、148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、115、98、97、96、95、94、93、92、79、78、77、76、75、74、73、72、56、55、54、53、52、51、50、49和38的重鏈可變區(qū)；
(2)抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，其包含選自SEQID NO: 141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57和29的輕鏈可變區(qū)；或
(3)抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，其包含選自SEQID NO: 150、149、148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、115、98、97、96、95、94、93、92、79、78、77、76、75、74、73、72、56、55、54、53、52、51、50、49 和 38 的重鏈可變區(qū)、以及選自 SEQ ID NO: 141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57和29的輕鏈可變區(qū)。
[0026][9] [6]~[8]中任一項所述的抗體，該抗體包含SEQ ID NO: 26的重鏈恒定區(qū)。
[0027][10] [6]~[9]中任一項所述的抗體，該抗體包含SEQ ID NO: 27的輕鏈恒定區(qū)。
[0028][11] [I]~[10]中任一項所述的抗體，該抗體具有中和活性。
[0029][12] [I]~[11]中任一項所述的抗體，該抗體具有細胞毒活性。
[0030][13] [12]所述的抗體，其中，細胞毒活性為⑶C和/或ADCC。
[0031][14] [I]~[12]中任一項所述的抗體，該抗體連接有增殖抑制劑或細胞毒性物質(zhì)。
[0032][15] [14]所述的抗體，該抗體為低分子抗體。
[0033][16] [12]~[15]中任一項所述的抗體，其中，在SEQ ID NO: 26的重鏈恒定區(qū)中包含選自以EU編號表示的230位、240位、244位、245位、247位、262位、263位、266位、273位、275位、299位、302位、313位、323位、325位、328位和332位的氨基酸的至少一個取代。
[0034][17]載體，該載體包含編碼重鏈可變區(qū)的多核苷酸，所述重鏈可變區(qū)包含:SEQID NO: 9 的重鏈 CDR1、選自 SEQ ID NO: 161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101 和 100 的重鏈 CDR2、以及選自 SEQ ID NO: 158、154、152、151、112、
111、110 和 11 的重鏈 CDR3。
[0035][18] [17]所述的載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 26的重鏈恒定區(qū)的多核苷酸。
[0036][19]載體，該載體包含編碼輕鏈可變區(qū)的多核苷酸，所述輕鏈可變區(qū)包含:選自SEQ ID NO: 163、68、67 和 12 的輕鏈 CDR1、選自 SEQ ID NO: 71、69 和 13 的輕鏈 CDR2、以及選自 SEQ ID NO: 164、48、47 和 14 的輕鏈 CDR3。
[0037][20] [19]所述的載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 27的輕鏈恒定區(qū)的多核苷酸。
[0038][21]載體，該載體包含下述的多核苷酸:
(1)編碼重鏈可變區(qū)的多核苷酸，所述重鏈可變區(qū)包含:SEQID NO: 9所表示的重鏈CDR1、選自 SEQ ID NO: 161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101 和 100 的重鏈 CDR2、以及選自 SEQ ID NO: 158、154、152、151、112、111、110 和 11 的重鏈⑶R3 ；以及
(2)編碼輕鏈可變區(qū)的多核苷酸，所述輕鏈可變區(qū)包含:選自SEQID NO: 163、68、67和12的輕鏈CDR1、選自SEQ ID NO: 71、69和13的輕鏈CDR2、以及選自SEQ ID NO: 164、48、47和14的輕鏈CDR3。
[0039][22]載體，該載體包含下述的多核苷酸:
(1)編碼重鏈可變區(qū)的多核苷酸，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO: 9所表示的重鏈CDR1、選自 SEQ ID NO: 161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101 和 100 的重鏈 CDR2、以及選自 SEQ ID NO: 158、154、152、151、112、111、110 和 11 的重鏈⑶R3 ;以及編碼SEQ ID NO: 26所表示的重鏈恒定區(qū)的多核苷酸；以及
(2)編碼輕鏈可變區(qū)的多核苷酸，所述輕鏈可變區(qū)包含選自SEQID NO: 163、68、67和12 的輕鏈 CDRl、選自 SEQ ID NO: 71、69 和 13 的輕鏈 CDR2、以及選自 SEQ ID NO: 164、48、47和14的輕鏈⑶R3 ;以及編碼SEQ ID NO: 27所表示的輕鏈恒定區(qū)的多核苷酸。
[0040][23] [18]或[22]所述的包含多核苷酸的載體，其中，在編碼SEQ ID NO: 26所表示的重鏈恒定區(qū)的多核苷酸中，包含編碼選自以EU編號表示的221位、222位、223位、224位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、236 位、237 位、238位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249 位、250 位、251 位、254位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266 位、267 位、268 位、269位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279 位、280 位、281 位、282位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293 位、294 位、295 位、296位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305 位、311 位、313 位、315位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327 位、328 位、329 位、330位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376 位、377 位、378 位、379位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429 位、434 位、436 位和 440位的氨基酸的至少一個取代的突變核苷酸。
[0041][24]宿主細胞，該宿主細胞包含[17]和[19]所述的載體、[18]和[20]所述的載體、[21]或[22]所述的載體。
[0042][25]宿主細胞，該宿主細胞包含[23]所述的載體。
[0043][26] [25]所述的宿主細胞，其中，上述宿主細胞為在糖鏈中添加巖藻糖的能力低的宿主細胞。
[0044][27] [26]所述的宿主細胞，其中，上述在糖鏈中添加巖藻糖的能力低的宿主細胞為選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖轉(zhuǎn)運蛋白、GMD(GDP-甘露糖4，6-脫水酶)、Fx (⑶P-酮-6-脫氧甘露糖3，5-差向異構(gòu)酶，4-還原酶)和GFPP (⑶P- β -L-巖藻糖焦磷酸化酶)的功能性蛋白的一種或一種以上缺損的宿主細胞。
[0045][28] [25]所述的宿主細胞，其中，上述宿主細胞為具有在糖鏈中形成二等分的N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)的能力的宿主細胞。
[0046][29] [28]所述的宿主細胞，其中，上述具有在糖鏈中形成二等分的N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)的能力的宿主細胞為具有β (1，4)_半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性、且包含載體的宿主細胞，所述載體包含編碼高爾基體定居多肽的功能性的高爾基體局部化結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。
[0047][30] [29]所述的宿主細胞，該宿主細胞為包含載體、并且包含編碼含有β (I, 4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的催化結(jié)構(gòu)域的融合多肽的多核苷酸的宿主細胞，所述載體包含編碼選自甘露糖苷酶II的局部化結(jié)構(gòu)域、β (I, 2)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶I的局部化結(jié)構(gòu)域、β (I, 2)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶II的局部化結(jié)構(gòu)域、甘露糖苷酶I的局部化結(jié)構(gòu)域和α 1-6核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的局部化結(jié)構(gòu)域的功能性的高爾基體局部化結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。
[0048][31] [24]~[30]中任一項所述的宿主細胞，其中，宿主細胞為選自CHO細胞、BHK細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、Ρ3Χ63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞、HEK293細胞或雜交瘤細胞的宿主細胞。
[0049][32] [I]~[16]中任一項所述的抗體的制備方法，該方法包括:從[24]~[31]中任一項所述的宿主細胞的培養(yǎng)液中進行回收。
[0050][33]抗體，該抗體是通過[32]所述的方法制備的。
[0051][34] [33]所述的抗體，該抗體連接有增殖抑制劑或細胞毒性物質(zhì)。
[0052][35]藥物組合物，該藥物組合物含有[I]~[16]或[33]~[34]中任一項所述的抗體作為有效成分。
[0053][36]癌癥治療藥或癌癥的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移抑制劑，其中含有[I]~[16]或[33]~
[34]中任一項所述的抗體作為有效成分。
[0054][37] [36]所述的癌癥治療藥或癌癥的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移抑制劑，其中，癌癥為選自大腸癌、肺腺癌、胰癌、胃癌和腎癌的任一種癌。
[0055][38] [37]所述的癌癥治療藥或癌癥的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移抑制劑，其中，上述大腸癌為低分化大腸癌、中分化大腸癌、高分化大腸癌。
[0056][39] [36]~[38]中任一項所述的癌癥治療藥或癌癥的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移抑制劑，其中，給予上述癌癥治療藥的對象為包含在分離的組織樣本中檢測到的上皮調(diào)節(jié)蛋白表達的癌細胞的對象。
[0057]另外，本發(fā)明還涉及抑制細胞增殖的方法、預(yù)防或治療癌癥的方法、或抑制癌癥的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的方法，上述方法包括向?qū)ο蠼o予本發(fā)明的抗體或利用本發(fā)明的制備方法制備的抗體的步驟。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗體或利用本發(fā)明的制備方法制備的抗體在細胞增殖抑制劑、癌癥預(yù)防藥或癌癥治療藥、或癌癥的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移抑制劑的制備中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用于在細胞增殖抑制、癌癥的預(yù)防或治療、或癌癥的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移抑制中使用的本發(fā)明的抗體或利用本發(fā)明的制備方法制備的抗體。本發(fā)明還涉及制備細胞增殖抑制劑、癌癥預(yù)防藥或癌癥治療藥、或癌癥的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移抑制劑的方法，所述方法包括:使用本發(fā)明的抗體或通過本發(fā)明的制備方法制備的抗體的步驟。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0058]圖1是顯示各抗體中的對人上皮調(diào)節(jié)蛋白的親和比(各抗體的KD值/嵌合抗體EP27的KD值)的圖?？贵w名稱的表征雖然只記載了可變區(qū)，但其是包含重鏈Gld和輕鏈kappa的恒定區(qū)的抗體的試驗結(jié)果。
[0059]圖2是顯示各抗體中的親和比(對猴上皮調(diào)節(jié)蛋白的KD值/對人上皮調(diào)節(jié)蛋白的KD值)的圖?？贵w名稱的表征雖然只記載了可變區(qū)，但其是包含重鏈Gld和輕鏈kappa的恒定區(qū)的抗體的試驗結(jié)果。
[0060]圖3是顯示各抗體中的對人上皮調(diào)節(jié)蛋白的親和比(各抗體的KD值/嵌合抗體EP27的KD值)的圖。
[0061]圖4是顯示各抗體中的親和比(對猴上皮調(diào)節(jié)蛋白的KD值/對人上皮調(diào)節(jié)蛋白的KD值)的圖。
[0062]圖5是顯示各抗體的ADCC活性(特異性鈣黃綠素AM游離率)的圖。
[0063]圖6是通過人上皮調(diào)節(jié)蛋白依賴性BAF_EGFR細胞增殖抑制率來顯示各抗體的中和活性的圖。
[0064]圖7是通過猴上皮調(diào)節(jié)蛋白依賴性BAF_EGFR細胞增殖抑制率來顯示各抗體的中和活性的圖。
[0065]圖8是通過人癌細胞移植小鼠模型中的抗腫瘤活性來顯示各抗體的體內(nèi)人腫瘤增殖抑制活性的圖。
[0066]圖9是顯示人上皮調(diào)節(jié)蛋白(hsEREG-His)和猴上皮調(diào)節(jié)蛋白(cysEREG_His)的電泳圖形的泳動圖像。
[0067]圖10是顯示表達彼此不同量的上皮調(diào)節(jié)蛋白的細胞的熒光染色和移植了該細胞的小鼠的組織免疫學(xué)染色的圖。
[0068]圖11是顯示對于表達彼此不同量的上皮調(diào)節(jié)蛋白的細胞的ADCC活性的圖。
[0069]圖12是通過在移植了表達彼此不同量的上皮調(diào)節(jié)蛋白的細胞的小鼠模型中的抗腫瘤活性顯示體內(nèi)人腫瘤增殖抑制活性的圖。
[0070]圖13是顯示低分化大腸癌的臨床病例中的上皮調(diào)節(jié)蛋白的表達的圖。
[0071]圖14是顯示表示對大腸癌的轉(zhuǎn)移的藥效的、EP27人源化Glycomab抗體對大腸癌干細胞PLR123的腫瘤發(fā)生的藥效的圖。
[0072]圖15是顯示表示對大腸癌干細胞的轉(zhuǎn)移的藥效的、EP27人源化Glycomab抗體對大腸癌干細胞PLR123的肺轉(zhuǎn)移的藥效的圖。
[0073]圖16是顯示使用低分化大腸癌模型C0L-53-JCK的EP27人源化Glycomab抗體對低分化大腸癌的藥效的圖。
[0074]圖17是顯示使用中分化大腸癌模型PLR379的EP27人源化Glycomab抗體對中分化大腸癌的藥效的圖。
[0075]圖18是顯示肺腺癌臨床病例中的上皮調(diào)節(jié)蛋白的表達的圖。
[0076]圖19是顯示EP27人源化Glycomab抗體對人肺腺癌株Calu_3的ADCC活性(特異性鈣黃綠素AM游離率)的圖。
[0077]圖20是顯示使用肺腺癌模型Calu-3的EP27人源化Glycomab抗體對肺腺癌的藥效的圖。
[0078]圖21是顯示包含EP27人源化Glycomab抗體的抗體藥物復(fù)合體在表達上皮調(diào)節(jié)蛋白的DLD-1細胞株的細胞內(nèi)內(nèi)化，并對DLD-1細胞株產(chǎn)生細胞毒的圖。

【具體實施方式】
[0079]本發(fā)明涉及顯示出非人動物和人動物間的種屬交叉反應(yīng)性(cross-speciesreactivity)的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。本發(fā)明還涉及化學(xué)分解得到了抑制的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。本發(fā)明還涉及等電點降低的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。本發(fā)明還涉及締合體量減少的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。本發(fā)明還涉及包含上述抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的藥物組合物或癌癥治療藥。本發(fā)明還涉及上述抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的制備方法。
[0080]以下的定義和詳細說明是為了容易理解本說明書中說明的本發(fā)明而提供。
[0081]定義氨基酸
本說明書中，以單字母密碼或三字母密碼或者該兩種方式表征氨基酸，例如表示為Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/1、Val/V。需要說明的是，本發(fā)明記載的氨基酸序列中所含的氨基酸還存在翻譯后進行修飾的情況(例如，N末端的谷氨酰胺的焦谷氨?；碌南蚪构劝彼岬男揎検潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的修飾)，勿庸贅言，這樣氨基酸進行了翻譯后修飾的情況也包括在本發(fā)明記載的氨基酸序列中。
[0082]杭原
本發(fā)明提供的抗體與作為抗原的上皮調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合。上皮調(diào)節(jié)蛋白是膜結(jié)合型上皮細胞生長因子蛋白。其氨基酸序列公開在GenBank登錄號ΝΡ_001423 (SEQ ID NO: 167)中。本發(fā)明中，上皮調(diào)節(jié)蛋白的定義包括全長蛋白及其片段的雙方。片段是指包含上皮調(diào)節(jié)蛋白的任意區(qū)的多肽，可以不具有天然的上皮調(diào)節(jié)蛋白的功能。作為片段的例子，可以列舉包含上皮調(diào)節(jié)蛋白的胞外區(qū)的片段。上皮調(diào)節(jié)蛋白的胞外區(qū)在SEQ ID NO: 167的氨基酸序列中相當(dāng)于第30-118位。另外，跨膜區(qū)在SEQ ID NO: 167的氨基酸序列中相當(dāng)于第119-140位。另外，本說明書中有時還將上皮調(diào)節(jié)蛋白稱作EREG，它們作為相同意義的用語使用。
[0083]表示存在于抗原中的抗原決定簇的表位，意指本說明書中公開的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域所結(jié)合的抗原上的位點。所以，例如表位可通過其結(jié)構(gòu)來定義。另外，也可以通過識別該表位的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體對抗原的結(jié)合活性來定義該表位?？乖瓰殡幕蚨嚯臅r，還可以通過構(gòu)成表位的氨基酸殘基來特定表位。另外，表位為糖鏈時，也可以通過特定的糖鏈結(jié)構(gòu)來特定表位。
[0084]線性表位例如象由在氨基酸的一級序列中連續(xù)的多個氨基酸組成的表位那樣，是由氨基酸的一級序列識別的表位。就線性表位而言，在固有序列中代表性的是含有至少3個氨基酸、以及最普通的是含有至少5個、例如約8至約10個、6至20個氨基酸。
[0085]與線性表位對比，立體結(jié)構(gòu)表位是下述的表位，即，含有表位的氨基酸的一級序列并非是被識別的表位的單一規(guī)定成分的表位(例如，氨基酸的一級序列未必是被規(guī)定表位的抗體所識別的表位)。立體結(jié)構(gòu)表位相對于線性表位也許包含較大數(shù)目的氨基酸。關(guān)于立體結(jié)構(gòu)表位的識別，抗體識別肽或蛋白的三維結(jié)構(gòu)。例如，蛋白分子折疊形成三維結(jié)構(gòu)時，形成立體結(jié)構(gòu)表位的某氨基酸和/或多肽主鏈形成并排，使得抗體可以識別表位。確定表位的立體結(jié)構(gòu)的方法例如包括:χ射線結(jié)晶學(xué)、二維核磁共振分光學(xué)以及位點特異性旋轉(zhuǎn)標記和電子順磁共振分光學(xué)，但并不限于這些。例如，參照Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular B1logy (1996),第 66 卷，Morris(編)。
[0086]結(jié)合活性
下述例示了通過抗體來確認對上皮調(diào)節(jié)蛋白、即上皮調(diào)節(jié)蛋白分子中存在的表位的結(jié)合的方法，但并不限于下述方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)采用測定抗體對抗原的結(jié)合活性的公知方法。
[0087]例如，抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體是否識別存在于上皮調(diào)節(jié)蛋白分子中的線性表位，可以通過如下所示的操作來確認。為了上述目的，合成了由構(gòu)成上皮調(diào)節(jié)蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列組成的線性肽。該肽可進行化學(xué)合成?；蛘?，可以利用編碼上皮調(diào)節(jié)蛋白的DNA(例如，cDNA序列的例子可以列舉CR541887 (SEQ ID NO: 169)等，而mRNA序列的例子可以列舉NM_001432等)中編碼相當(dāng)于細胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的區(qū)域，通過基因工程技術(shù)得到。接下來，對由構(gòu)成細胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列組成的線性肽與抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的結(jié)合活性進行評價。例如，通過以固定化的線性肽作為抗原的ELISA，可以評價該抗體對該肽的結(jié)合活性?；蛘?，基于該抗體對上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的結(jié)合中的、線性肽所產(chǎn)生的抑制水平，也可以明確對線性肽的結(jié)合活性。通過這些試驗，可以明確該抗體對線性肽的結(jié)合活性。
[0088]另外，抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體是否識別立體結(jié)構(gòu)表位，這可以通過如下操作來確認。為了上述目的，制備了表達上皮調(diào)節(jié)蛋白的細胞?？梢粤信e:抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體與上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞接觸時，強烈地與該細胞結(jié)合，但該抗體與固定化的由構(gòu)成上皮調(diào)節(jié)蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列組成的線性肽實質(zhì)上不結(jié)合的情形等。這里，實質(zhì)上不結(jié)合是指，對人上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的結(jié)合活性的80%以下、通常50%以下、優(yōu)選30%以下、特別優(yōu)選15%以下的結(jié)合活性。
[0089]作為測定抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體對上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的結(jié)合活性的方法，例如可以列舉 Antibodies A Laboratory Manual 記載的方法(Ed Harlow, David Lane, ColdSpring Harbor Laboratory(1988) 359-420)。即，可以根據(jù)以上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞為抗原的 ELISA 或 FACS (突光活化細胞分選技術(shù),fluorescence activated cell sorting)的原理進行評價。
[0090]在ELISA形式中，抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體對上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的結(jié)合活性，通過比較由酶反應(yīng)生成的信號水平而定量地進行評價。即，將被測抗體添加至固定有上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的ELISA板，利用識別被測抗體的酶標記抗體，檢測與細胞結(jié)合的被測抗體?；蛘咴贔ACS中，制作被測抗體的稀釋系列，確定對上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的抗體結(jié)合效價(titer)，由此可以比較被測抗體對上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的結(jié)合活性。
[0091]被測抗體與懸浮于緩沖液等中的細胞表面上表達的抗原的結(jié)合可以通過流式細胞儀來檢測。作為流式細胞儀，例如已知如下的裝置:
FACSCanto? II ；
FACSAria? ；
FACSArray? ；
FACSVantage? SE ；
FACSCalibur? (均為 BD B1sciences 公司的商品名)；
EPICS ALTRA HyPerSort ；
Cytomics FC 500 ；
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC ；
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC(均為 Beckman Coulter 公司的商品名)。
[0092]例如，作為抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體對上皮調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合活性的優(yōu)選測定方法之一例，可以列舉以下方法。首先，使被測抗體與表達上皮調(diào)節(jié)蛋白的細胞反應(yīng)，再用識別該被測抗體的經(jīng)FITC標記的二次抗體染色。將被測抗體用適合的緩沖液適當(dāng)稀釋，由此將該抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體制備成所期望的濃度來使用。例如，能夠以10 P g/ml至10ng/ml之間的任意濃度使用。接下來，通過FACSCalibur (BD公司)測定熒光強度和細胞數(shù)?？贵w與該細胞的結(jié)合量被反映為使用CELL QUEST軟件(BD公司)進行分析而得到的熒光強度、即幾何平均值。即，通過得到該幾何平均值，能夠測定由被測抗體的結(jié)合量表示的被測抗體的結(jié)合活性。
[0093]抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體是否與某抗體共有表位，可以通過兩者對相同表位的競爭來確認。抗體間的競爭通過交叉阻斷試驗等來檢測。例如競爭ELISA試驗是優(yōu)選的交叉阻斷試驗。
[0094]具體而言，在交叉阻斷試驗中，包被于微量滴定板的孔上的上皮調(diào)節(jié)蛋白在候選競爭抗體的存在下或不存在下經(jīng)孵育后，添加被測抗體。與孔中的上皮調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的被測抗體的量與競爭結(jié)合相同表位的候選競爭抗體的結(jié)合能力間接相關(guān)。即，競爭抗體對相同表位的親和性越大，則被測抗體對包被了上皮調(diào)節(jié)蛋白的孔的結(jié)合活性越降低。
[0095]經(jīng)由上皮調(diào)節(jié)蛋白而與孔結(jié)合的被測抗體的量可以通過預(yù)先標記抗體來容易地測定。例如，經(jīng)生物素標記的抗體通過使用親和素過氧化酶綴合物和合適的底物來測定。利用過氧化酶等酶標記的交叉阻斷試驗特別被稱為競爭ELISA試驗?？贵w能夠用可檢測或可測定的其它標志物質(zhì)進行標記。具體而言，公知的是放射標記或熒光標記等。
[0096]與在候選競爭抗體的不存在下實施的對照試驗中得到的結(jié)合活性進行比較，競爭抗體只要可以阻斷至少20%、優(yōu)選至少20-50%、進一步優(yōu)選至少50%的抗體對上皮調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合，則該被測抗體是與競爭抗體實質(zhì)上結(jié)合于相同表位、或者競爭結(jié)合于相同表位的抗體。
[0097]在鑒定抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體所結(jié)合的表位的結(jié)構(gòu)時，被測抗體與對照抗體是否共有表位，可以通過比較兩抗體對在構(gòu)成該表位的肽中導(dǎo)入氨基酸突變而得的肽的結(jié)合活性來進行評價。
[0098]作為這種測定結(jié)合活性的方法，例如，在上述ELISA形式中，可通過比較被測抗體和對照抗體對導(dǎo)入了突變的線性肽的結(jié)合活性來測定。作為ELISA以外的方法，通過使被測抗體和對照抗體流過該柱后，對洗脫液中洗脫的抗體進行定量，也可以測定對結(jié)合于柱的該突變肽的結(jié)合活性。使突變肽作為例如與GST的融合肽的形式吸附于柱的方法是公知的。
[0099]另外，所鑒定的表位為立體表位時，被測抗體與對照抗體是否共有表位，例如可通過以下方法來評價。首先，制備表達上皮調(diào)節(jié)蛋白的細胞和表達在表位中導(dǎo)入了突變的上皮調(diào)節(jié)蛋白的細胞。將這些細胞懸浮于PBS等適當(dāng)?shù)木彌_液中，向所得細胞懸浮液中添加被測抗體和對照抗體。接著，用合適的緩沖液清洗，向所得細胞懸浮液中添加能夠識別被測抗體和對照抗體的經(jīng)FITC標記的抗體。被標記抗體染色的細胞的熒光強度和細胞數(shù)通過FACSCalibuHBD公司)來測定。被測抗體和對照抗體的濃度通過適合的緩沖液適當(dāng)稀釋，由此可以制備成所期望的濃度來使用。例如，能夠以10// g/ml~10ng/ml之間的任意濃度使用。標記抗體對該細胞的結(jié)合量被反映為通過使用CELL QUEST軟件(BD公司)進行分析而得到的熒光強度、即幾何平均值。即，通過得到該幾何平均值，可以測定由標記抗體的結(jié)合量表示的被測抗體和對照抗體的結(jié)合活性。
[0100]在本方法中，例如“實質(zhì)上不與突變上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞結(jié)合”可通過以下方法判斷。首先，用標記抗體染色與表達突變上皮調(diào)節(jié)蛋白的細胞結(jié)合的被測抗體和對照抗體。接著，檢測細胞的熒光強度。熒光檢測中使用FACSCalibur作為流式細胞儀時，所得的熒光強度可以使用CELL QUEST軟件進行分析。由抗體存在下和不存在下的幾何平均值，根據(jù)以下算式(式I)算出該比較值(AGeo-Mean),由此可以求出由于抗體的結(jié)合而導(dǎo)致的熒光強度的增加比例。
[0101](式I)
Δ Geo-Mean = Geo-Mean (抗體存在下)/Geo-Mean (抗體不存在下)
將通過分析得到的、反映被測抗體對突變上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的結(jié)合量的幾何平均比較值(突變上皮調(diào)節(jié)蛋白分子AGeo-Mean值)與反映被測抗體對上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的結(jié)合量的AGeo-Mean比較值進行比較。此時，計算對突變上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞和上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的AGeo-Mean比較值時使用的被測抗體的濃度特別優(yōu)選制備成彼此相同或者實質(zhì)上相同的濃度。預(yù)先確定了識別上皮調(diào)節(jié)蛋白中的表位的抗體被用作對照抗體。
[0102]被測抗體對突變上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的AGeo-Mean比較值只要小于被測抗體對上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的AGeo-Mean比較值的至少80%、優(yōu)選50%、進一步優(yōu)選30%、特別優(yōu)選15%，則認為“實質(zhì)上不與突變上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞結(jié)合”。計算Geo-Mean值(幾何平均)的算式記載于CELL QUEST軟件用戶指南(BD b1sciences公司)。通過將比較值進行比較，只要是能夠?qū)⑵鋵嵸|(zhì)上視為相同的程度，則能夠評價為被測抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體與對照抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的表位相同。
[0103]杭體
本說明書中，抗體是指天然的免疫球蛋白或者通過部分或完全合成制備的免疫球蛋白。抗體可從其天然存在的血漿或血清等天然資源或產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清中分離，或者通過使用基因重組等方法部分或完全地合成。作為抗體的實例，優(yōu)選列舉免疫球蛋白的同種型和這些同種型的亞型。作為人的免疫球蛋白，已知有IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgM這9種類型(同種型)。本發(fā)明的抗體中可包含這些同種型中的IgGU IgG2、IgG3、IgG4。
[0104]制作具有所期望的結(jié)合活性的抗體的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。以下例示制作與上皮調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的抗體(抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體)的非限定性的一種方法。
[0105]抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體可以使用公知的方法以多克隆或單克隆抗體的形式獲得。作為抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，可優(yōu)選制作來源于哺乳動物的單克隆抗體。來源于哺乳動物的單克隆抗體包含:由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體、和利用基因工程技術(shù)通過用含有抗體基因的表達載體進行了轉(zhuǎn)化的宿主細胞產(chǎn)生的單克隆抗體等。需要說明的是，本申請發(fā)明的單克隆抗體包含“人源化抗體”或“嵌合抗體”。
[0106]產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以通過使用公知技術(shù)，例如如下制作。即，使用上皮調(diào)節(jié)蛋白作為致敏抗原，按照通常的免疫方法來免疫哺乳動物。通過通常的細胞融合法，使所得免疫細胞與公知的親本細胞融合。接著，通過通常的篩選方法篩選與上皮調(diào)節(jié)蛋白分子中的表位結(jié)合的單克隆抗體產(chǎn)生細胞，由此可以選擇出產(chǎn)生抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的雜交瘤。
[0107]具體而言，單克隆抗體的制作例如如下進行。首先，通過表達在SEQ ID NO: 169中其核苷酸序列被公開的人上皮調(diào)節(jié)蛋白基因，可得到SEQ ID NO: 167所表示的人上皮調(diào)節(jié)蛋白，其被用作抗體獲取的致敏抗原。即，將編碼人上皮調(diào)節(jié)蛋白的基因序列插入公知的表達載體中，由此轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?。以公知的方法從該宿主細胞中純化所期望的人上皮調(diào)節(jié)蛋白。另外，為了從培養(yǎng)上清中獲得可溶型人上皮調(diào)節(jié)蛋白，例如使SEQ ID NO: 167所表示的人上皮調(diào)節(jié)蛋白多肽序列中包含第30~118位氨基酸的多肽或第30~108位氨基酸中所含的SEQ ID NO: 34所表示的蛋白表達。另外，純化的天然人上皮調(diào)節(jié)蛋白也同樣可用作致敏抗原。
[0108]作為用于免疫哺乳動物的致敏抗原，可使用該純化上皮調(diào)節(jié)蛋白。上皮調(diào)節(jié)蛋白的部分肽也可以用作致敏抗原。此時，該部分肽也可以根據(jù)人上皮調(diào)節(jié)蛋白的氨基酸序列通過化學(xué)合成獲得。另外，也可以通過將一部分人上皮調(diào)節(jié)蛋白基因插入表達載體中使其表達來獲得。進而，還可以使用蛋白分解酶分解上皮調(diào)節(jié)蛋白來獲得，但用作部分肽的上皮調(diào)節(jié)蛋白肽的區(qū)域和大小并不特別限于特定的方案。關(guān)于優(yōu)選的區(qū)域，可以從SEQ ID NO:167所表示的氨基酸序列中相當(dāng)于第30~118位或第30~108位的氨基酸的氨基酸序列中選擇任意的序列。構(gòu)成作為致敏抗原的肽的氨基酸的數(shù)目優(yōu)選為至少5個以上、例如6個以上、或7個以上。更具體而言，可以將8~50、優(yōu)選10~30個殘基的肽用作致敏抗原。
[0109]另外，也可以將上皮調(diào)節(jié)蛋白的所期望的部分多肽或肽與不同的多肽進行融合而得的融合蛋白用作致敏抗原。為了制備用作致敏抗原的融合蛋白，例如，可以優(yōu)選利用抗體的Fe片段或肽標簽等。表達融合蛋白的載體可如下制作:將編碼所期望的兩種或更多的多肽片段的基因框內(nèi)融合，將該融合基因如上所述地插入表達載體中。融合蛋白的制作方法記載于 Molecular Cloning 第 2 版.(Sambrook, J 等人，Molecular Cloning 第 2 版，9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab.press)。用作致敏抗原的上皮調(diào)節(jié)蛋白的獲得方法和使用它的免疫方法也具體記載于W02008/047723等中。
[0110]作為用該致敏抗原免疫的哺乳動物，并不限定于特定的動物，優(yōu)選考慮與細胞融合中使用的親本細胞的適應(yīng)性來選擇。通常優(yōu)選使用嚙齒類動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠、或兔、猴等。
[0111]按照公知的方法將上述動物用致敏抗原免疫。例如，作為通常的方法，通過注射將致敏抗原給予至哺乳動物的腹腔內(nèi)或皮下來實施免疫。具體而言，將用PBS (磷酸緩沖鹽水(Phosphate-Buffered Saline))或生理鹽水等以適當(dāng)稀釋倍率稀釋的致敏抗原根據(jù)需要與通常的佐劑、例如弗氏完全佐劑混合，在乳化后將該致敏抗原對哺乳動物每4至21日給予數(shù)次。另外，致敏抗原免疫時可以使用適當(dāng)?shù)妮d體。特別是將分子量小的部分肽用作致敏抗原時，有時希望將與白蛋白、匙孔血藍蛋白等載體蛋白結(jié)合的該致敏抗原肽進行免疫。
[0112]另外，產(chǎn)生所期望抗體的雜交瘤可通過使用DNA免疫，如下所示來制作。DNA免疫是指下述免疫方法:被給予了以能在免疫動物中表達編碼抗原蛋白的基因的方式構(gòu)建的載體DNA的該免疫動物中，致敏抗原在該免疫動物的生物體內(nèi)表達，由此賦予免疫刺激。與將蛋白抗原給予免疫動物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下的優(yōu)越性:
-能夠維持象上皮調(diào)節(jié)蛋白這樣的膜蛋白的結(jié)構(gòu)以賦予免疫刺激；
-無需純化免疫抗原。
[0113]為了通過DNA免疫獲得本發(fā)明的單克隆抗體，首先，對免疫動物給予表達上皮調(diào)節(jié)蛋白的DNA。編碼上皮調(diào)節(jié)蛋白的DNA可通過PCR等公知方法合成。將所得DNA插入適當(dāng)?shù)谋磉_載體中，給予免疫動物。作為表達載體，可優(yōu)選利用例如pcDNA3.1等市售的表達載體。作為將載體給予生物體的方法，可采用通常使用的方法。例如，將吸附了表達載體的金顆粒用基因槍導(dǎo)入免疫動物個體的細胞內(nèi)，由此進行DNA免疫。進而，識別上皮調(diào)節(jié)蛋白的抗體的制作也可以采用國際公開W02003/104453中記載的方法來制作。
[0114]如此地將哺乳動物免疫，確認血清中與上皮調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的抗體效價上升后，從哺乳動物體內(nèi)采集免疫細胞用于細胞融合。作為優(yōu)選的免疫細胞，特別可使用脾細胞。
[0115]作為與上述免疫細胞融合的細胞，可使用哺乳動物的骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞優(yōu)選具備用于篩選的適當(dāng)?shù)倪x擇標志物。選擇標志物是指能夠(或者不能)在特定培養(yǎng)條件下存活的形態(tài)。選擇標志物中，公知的是次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶缺陷(以下簡稱為HGPRT缺陷)、或胸苷激酶缺陷(以下簡稱為TK缺陷)等。具有HGPRT或TK缺陷的細胞具有次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下簡稱為HAT敏感性)。HAT敏感性的細胞不能在HAT選擇培養(yǎng)基中進行DNA合成而會死亡，但若與正常細胞發(fā)生融合，則可利用正常細胞的補救途徑繼續(xù)DNA的合成，因此在HAT選擇培養(yǎng)基中也會增殖。
[0116]HGPRT缺陷或TK缺陷的細胞各自可通過含有6-硫代鳥嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)、或5’ -溴脫氧尿苷的培養(yǎng)基來選擇。DNA中插入有這些嘧啶類似物的正常細胞會死亡。而無法插入這些嘧啶類似物的缺乏上述酶的細胞則可以在選擇培養(yǎng)基中存活。此外，被稱作G418抗性的選擇標志物可通過新霉素抗性基因賦予針對2-脫氧鏈霉胺系抗生素(慶大霉素類似物)的抗性。細胞融合中優(yōu)選的各種骨髓瘤細胞是公知的。
[0117]作為這類骨髓瘤細胞，例如可優(yōu)選使用:P3(P3X63Ag8.653) (J.1mmunol.(1979) 123 (4)，1548-1550) > P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microb1logy andImmunology (1978)81，1-7)、NS-1 (C.Eur.J.1mmunol.(1976) 6 (J)，511-519)、MPC-1l (Cell (1976) 8 (3)， 405-415)、SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685)， 269-270)、FO (J.1mmunol.Methods (1980) 35 (1-2), 1-21)、S194/5.ΧΧ0.BU.1 (J.Exp.Med.(1978) 148 (I), 313-323)、R210 (Nature (1979) 277 (5692)，131-133)等。
[0118]基本上，根據(jù)公知的方法，例如Kohler和Milstein等人的方法(MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)等，進行上述免疫細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合。
[0119]更具體而言，例如，可以在細胞融合促進劑的存在下、在通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中實施上述細胞融合。作為融合促進劑，使用例如聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等，為了進一步提高融合效率，根據(jù)期望添加二甲基亞砜等助劑后使用。
[0120]免疫細胞與骨髓瘤細胞的使用比例可以任意設(shè)定。例如，相對于骨髓瘤細胞，優(yōu)選使免疫細胞達到I至10倍。作為用于上述細胞融合的培養(yǎng)液，使用例如適于上述骨髓瘤細胞株增殖的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液以及用于此種細胞培養(yǎng)的通常的培養(yǎng)液，進而可優(yōu)選添加胎牛血清(FCS)等血清補液。
[0121]關(guān)于細胞融合，將上述免疫細胞和骨髓瘤細胞在上述培養(yǎng)液中以規(guī)定量充分混合，將預(yù)先加熱至37°C左右的PEG溶液(例如平均分子量為1000至6000左右)通常以30至60%(w/v)的濃度添加。通過緩緩地混合混合液，形成所期望的融合細胞(雜交瘤)。接著，依次添加上述列舉的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液，通過重復(fù)進行離心除去上清的操作，可以除去對雜交瘤的生長不利的細胞融合劑等。
[0122]如此操作得到的雜交瘤可通過用通常的選擇培養(yǎng)液、例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液)進行培養(yǎng)來選擇。使用上述HAT培養(yǎng)液的培養(yǎng)可持續(xù)足夠除所期望的雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡的時間(通常，所述足夠的時間為數(shù)天至數(shù)周)。接著，通過通常的有限稀釋方法，實施產(chǎn)生所期望的抗體的雜交瘤的篩選和單克隆。
[0123]如此操作得到的雜交瘤可通過使用對應(yīng)于用于細胞融合的骨髓瘤所具有的選擇標志物的選擇培養(yǎng)液來進行選擇。例如，具有HGPRT或TK缺陷的細胞可以通過用HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液)培養(yǎng)來進行選擇。即，在細胞融合中使用HAT敏感性的骨髓瘤細胞時，在HAT培養(yǎng)液中，與正常細胞的細胞融合成功了的細胞可選擇性地增殖。使用上述HAT培養(yǎng)液的培養(yǎng)可以持續(xù)足夠除所期望的雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡的時間。具體而言，通常通過數(shù)天至數(shù)周的培養(yǎng)，可以選擇所期望的雜交瘤。接著，可通過通常的有限稀釋法實施產(chǎn)生所期望抗體的雜交瘤的篩選和單克隆。
[0124]所期望抗體的篩選和單克隆優(yōu)選可通過公知的基于抗原抗體反應(yīng)的篩選方法來實施。例如，與上皮調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的單克隆抗體可與在細胞表面表達的上皮調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合。這種單克隆抗體例如可以通過FACS (突光活化細胞分選技術(shù)，fluorescence activatedcell sorting)來篩選。FACS是指，利用激光分析與熒光抗體接觸的細胞，測定各細胞所發(fā)出的熒光，從而可以測定抗體與細胞表面的結(jié)合的系統(tǒng)。
[0125] 為了通過FACS來篩選產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤，首先，制備表達上皮調(diào)節(jié)蛋白的細胞。用于篩選的優(yōu)選的細胞為強制表達上皮調(diào)節(jié)蛋白的哺乳動物細胞。通過使用用作宿主細胞的未轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞作為對照，能夠選擇性地檢測抗體對細胞表面的上皮調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合活性。即，通過選擇產(chǎn)生不與宿主細胞結(jié)合、而與上皮調(diào)節(jié)蛋白強制表達細胞結(jié)合的抗體的雜交瘤，能夠獲得產(chǎn)生上皮調(diào)節(jié)蛋白單克隆抗體的雜交瘤。
[0126]或者，可以根據(jù)ELISA的原理評價抗體對固定化的上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的結(jié)合活性。例如，將上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞固定于ELISA板的孔中。使雜交瘤的培養(yǎng)上清與孔內(nèi)的固定化細胞接觸，檢測與固定化細胞結(jié)合的抗體。單克隆抗體來源于小鼠時，與細胞結(jié)合的抗體可通過抗小鼠免疫球蛋白抗體來檢測。通過這些篩選選擇出的、產(chǎn)生對抗原具有結(jié)合能力的所期望的抗體的雜交瘤可以通過有限稀釋法等進行克隆。
[0127]如此操作而制作的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以在通常的培養(yǎng)液中繼代培養(yǎng)。另外，該雜交瘤可以在液氮中長期保存。
[0128]按照通常的方法培養(yǎng)該雜交瘤，可從其培養(yǎng)上清中獲得所期望的單克隆抗體?；蛘?，可以將雜交瘤給予和其具有相容性的哺乳動物并使其增殖，從其腹水中獲得單克隆抗體。前一種方法適于獲得高純度的抗體。
[0129]也可以優(yōu)選使用由從該雜交瘤等抗體產(chǎn)生細胞克隆的抗體基因編碼的抗體。將克隆的抗體基因插入適當(dāng)?shù)妮d體中，再導(dǎo)入宿主中，由此表達由該基因編碼的抗體。用于抗體基因的分離、向載體中的導(dǎo)入、以及宿主細胞的轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)由例如Vandamme等人確立(Eur.J.B1chem.(1990) 192 (3)，767-775)。另外，如下所述重組抗體的制備方法也是公知的。
[0130]例如，由產(chǎn)生抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的雜交瘤細胞獲得編碼抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體可變區(qū)(V區(qū))的cDNA。為此，通常首先從雜交瘤中提取總RNA。作為用于從細胞中提取mRNA的方法，例如可使用如下所述的方法。
[0131]-胍超離心法(B1chemistry(1979) 18 (24)，5294-5299);
-AGPC 法(Anal.B1chem.(1987) 162 (I), 156-159)。
[0132]所提取的mRNA可使用mRNA純化試劑盒(GE Healthcare B1science制)等進行純化?；蛘?，還有象QuickPrep mRNA純化試劑盒(GE Healthcare B1science制)等用于從細胞中直接提取總mRNA的試劑盒在出售。使用這種試劑盒，可由雜交瘤獲得mRNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶，可由所得mRNA合成編碼抗體V區(qū)的cDNA。cDNA可通過AMV逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(生化學(xué)工業(yè))等合成。另外，為了 cDNA的合成和擴增，可以適當(dāng)采用使用了 SMART RACE cDNA 擴增試劑盒(Clontech 制)和 PCR 的 5’ -RACE 法(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1988) 85 (23)，8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989) 17 (8)，2919-2932)。進而，可以在這種cDNA的合成過程中向cDNA的兩末端導(dǎo)入后述適合的限制酶位點。
[0133]由所得PCR產(chǎn)物純化出目標cDNA片段，接著與載體DNA連接。如此制作重組載體，并導(dǎo)入大腸桿菌等中，選擇集落后，可以由形成該集落的大腸桿菌制備所期望的重組載體。而且，關(guān)于該重組載體是否具有目標cDNA的核苷酸序列，可以通過公知的方法、例如雙脫氧核苷酸鏈終止法等來確認。
[0134]為了獲得編碼可變區(qū)的基因，簡便的是利用5’ -RACE法，其中使用了可變區(qū)基因擴增用的引物。首先，以從雜交瘤細胞中提取的RNA為模板合成cDNA，獲得5’ -RACE cDNA文庫。在5’ -RACE cDNA文庫的合成中可適當(dāng)使用SMART RACE cDNA擴增試劑盒等市售的試劑盒。
[0135]以所得的5’_RACE cDNA文庫為模板，通過PCR法擴增抗體基因。根據(jù)公知的抗體基因序列，可設(shè)計小鼠抗體基因擴增用的引物。這些引物根據(jù)免疫球蛋白的亞類而具有不同的核苷酸序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠單克隆抗體同種型分型試劑盒(RocheDiagnostics)等市售試劑盒來預(yù)先確定亞類。
[0136]具體而言，例如為了獲得編碼小鼠IgG的基因時，可以使用下述引物，其能夠擴增編碼作為重鏈的Y 1、Y 2a> Y 2b> Y 3、作為輕鏈的κ鏈和λ鏈的基因。為了擴增IgG的可變區(qū)基因，通常3’側(cè)的引物使用會退火到相當(dāng)于接近可變區(qū)的恒定區(qū)的部分上的引物。而5’側(cè)的引物則使用5’ RACE cDNA文庫制作試劑盒所附帶的引物。
[0137]使用如此擴增了的PCR產(chǎn)物，可以重構(gòu)由重鏈和輕鏈的組合構(gòu)成的免疫球蛋白。將重構(gòu)了的免疫球蛋白對上皮調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合活性作為指標，可篩選所期望的抗體。為了獲得抗上皮調(diào)節(jié)蛋白的抗體時，進一步優(yōu)選抗體對上皮調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合是特異性的。與上皮調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的抗體例如可如下進行篩選:
步驟(1)，使包含由雜交瘤獲得的cDNA所編碼的V區(qū)的抗體與上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞接觸；
步驟(2)，檢測上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞與抗體的結(jié)合；以及步驟(3)，選擇與上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞結(jié)合的抗體。
[0138]檢測抗體與上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的結(jié)合的方法是公知的。具體而言，通過之前所述的FACS等方法，可檢測出抗體與上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的結(jié)合。為了評價抗體的結(jié)合活性，可適當(dāng)利用上皮調(diào)節(jié)蛋白表達細胞的固定標本。
[0139]作為以結(jié)合活性為指標的抗體的篩選方法，還優(yōu)選采用淘選法，其利用了噬菌體載體。由多克隆抗體表達細胞群以重鏈和輕鏈的亞類的文庫形式獲得抗體基因時，有利的是利用噬菌體載體的篩選方法。編碼重鏈和輕鏈的可變區(qū)的基因通過用適當(dāng)?shù)慕宇^序列連接，可形成單鏈Fv(ScFv)。通過將編碼scFv的基因插入噬菌體載體中，可以獲得在表面表達scFv的噬菌體。該噬菌體與所期望的抗原接觸后，回收與抗原結(jié)合的噬菌體，從而可以回收編碼具有目標結(jié)合活性的scFv的DNA。根據(jù)需要重復(fù)該操作，可以濃縮具有所期望的結(jié)合活性的scFv。
[0140]得到目標的編碼抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體V區(qū)的cDNA后，該cDNA被識別插入該cDNA的兩末端的限制酶位點的限制酶消化。優(yōu)選的限制酶會識別并消化在構(gòu)成抗體基因的核苷酸序列中出現(xiàn)的頻率低的核苷酸序列。進而，為了將I拷貝的消化片段以正確方向插入載體中，優(yōu)選插入能提供粘性末端的限制酶。將如上消化的編碼抗IL-6R抗體V區(qū)的cDNA插入適當(dāng)?shù)谋磉_載體中，由此可獲得抗體表達載體。此時，只要將編碼抗體恒定區(qū)(C區(qū))的基因和編碼上述V區(qū)的基因框內(nèi)融合，則可獲得嵌合抗體。這里，嵌合抗體是指恒定區(qū)和可變區(qū)的來源不同。因此，除了小鼠-人等異種嵌合抗體之外，人-人同種嵌合抗體也包含在本發(fā)明的嵌合抗體中。通過在預(yù)先具有恒定區(qū)的表達載體中插入上述V區(qū)基因，可以構(gòu)建嵌合抗體表達載體。具體而言，例如，可在保持有編碼所期望的抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA的表達載體的5’側(cè)適當(dāng)配置消化上述V區(qū)基因的限制酶的限制酶識別序列。對經(jīng)相同組合的限制酶消化的兩者進行框內(nèi)融合，而構(gòu)建嵌合抗體表達載體。
[0141]為了制備與上皮調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的單克隆抗體，以在表達調(diào)控區(qū)的調(diào)控下進行表達的方式，將抗體基因插入表達載體中。用于表達抗體的表達調(diào)控區(qū)包含例如增強子或啟動子。另外，可以在氨基末端添加合適的信號序列，以使表達的抗體分泌到細胞外。在后述實施例中，作為信號序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 168)的肽，除此之外也可以添加合適的信號序列。所表達的多肽在上述序列的羧基末端部分被切斷，被切斷的多肽能夠以成熟多肽的形式分泌到細胞外。接著，用該表達載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，由此可以獲得表達編碼抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的DNA的重組細胞。
[0142]為了表達抗體基因，編碼抗體重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)的DNA被分別插入其他的表達載體中。通過用插入有H鏈和L鏈的載體共轉(zhuǎn)化(co-transfect)相同的宿主細胞，可以表達具備H鏈和L鏈的抗體分子。或者，將編碼H鏈和L鏈的DNA插入單一表達載體中，從而可以轉(zhuǎn)化宿主細胞(參照國際公開第W01994/011523)。
[0143]用于將分離的抗體基因?qū)脒m當(dāng)?shù)乃拗髦衼碇谱骺贵w的宿主細胞和表達載體的多個組合是公知的。這些表達系統(tǒng)均可用于分離本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。將真核細胞用作宿主細胞時，可適當(dāng)使用動物細胞、植物細胞或真菌細胞。具體而言，動物細胞可例示下述細胞。
[0144](I)哺乳動物細胞:CH0、C0S、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎)、Hela、Vero、HEK(人胚腎)293 等；
(2)兩棲動物細胞:非洲爪蟾卵母細胞等；
(3)昆蟲細胞:sf9、sf21、Tn5等。
[0145]或者，作為植物細胞，公知有基于來源于煙草(Nicotiana tabacum)等煙草(Nicotiana)屬的細胞的抗體基因表達系統(tǒng)。在植物細胞的轉(zhuǎn)化中，可以適當(dāng)使用進行了愈傷組織培養(yǎng)的細胞。
[0146]進而，作為真菌細胞，可以使用如下細胞:
-酵母:釀酒酵母 iSacclmromyces serevisiae)等酵母 i^scchaxomycGs)屬、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastor is)等畢赤酵母屬；
-絲狀真菌:黑曲霉菌(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)屬。
[0147]另外，利用原核細胞的抗體基因表達系統(tǒng)也是公知的。例如，使用細菌細胞時，可適當(dāng)利用大腸桿菌(/?.coli )、枯草桿菌等細菌細胞。通過轉(zhuǎn)化向這些細胞中導(dǎo)入含有目標抗體基因的表達載體。通過在體外培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞，能夠由該轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)物獲得所期望抗體。
[0148]除了上述宿主細胞之外，重組抗體的產(chǎn)生也可以利用轉(zhuǎn)基因動物。即，可以由導(dǎo)入有編碼所期望抗體的基因的動物獲得該抗體。例如，抗體基因可以通過框內(nèi)插入編碼乳汁中固有產(chǎn)生的蛋白的基因的內(nèi)部，而構(gòu)建為融合基因。作為分泌至乳汁中的蛋白，可利用例如山羊β酪蛋白等。將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎中，再將該注入了的胚胎導(dǎo)入母山羊體內(nèi)。由接受了胚胎的山羊生出的轉(zhuǎn)基因山羊(或其后代)產(chǎn)生的乳汁中，能夠以與乳汁蛋白形成的融合蛋白的形式獲得所期望的抗體。另外，為了使由轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有所期望抗體的乳汁量增加，可以對轉(zhuǎn)基因山羊給予激素(B1/Technology (1994)，12 (J)，699-702)。
[0149]對人給予本說明書中記載的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體時，作為該抗體中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以適當(dāng)采用來源于基因重組型抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述基因重組型抗體為了降低針對人的異源抗原性等目的已進行了人工修飾?；蛑亟M型抗體包含例如人源化(humanized)抗體等。這些修飾抗體可使用公知方法適當(dāng)制備。
[0150]為了制作本說明書中記載的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域而使用的抗體的可變區(qū)通常由被4個構(gòu)架區(qū)(FR)夾持的3個互補性決定區(qū)(complementarity-determining reg1n; Q)R)構(gòu)成。Q)R實質(zhì)上是決定抗體結(jié)合特異性的區(qū)域。CDR的氨基酸序列富有多樣性。另一方面，構(gòu)成FR的氨基酸序列即便在具有不同結(jié)合特異性的抗體之間也往往顯示出高度的同源性。因此，認為通?？梢酝ㄟ^CDR的移植將某抗體的結(jié)合特異性移植到其它抗體中。
[0151]人源化抗體也稱作重構(gòu)(reshaped)人抗體。具體而言，將人以外的動物例如小鼠抗體的CDR移植到人抗體中的人源化抗體等是公知的。用于獲得人源化抗體的通常的基因重組方法也是已知的。具體而言，作為用于將小鼠抗體的CDR移植到人的FR中的方法，公知的是例如重疊延伸PCR。重疊延伸PCR中，用于合成人抗體FR的引物中添加有編碼待移植小鼠抗體CDR的核苷酸序列。針對4個FR分別準備引物。通常，關(guān)于將小鼠CDR移植至人FR，認為選擇與小鼠FR的同源性高的人FR在維持CDR功能方面有利。即，通常優(yōu)選使用下述人FR，其由與待移植小鼠CDR相鄰的FR的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列組成。
[0152]另外，連接的核苷酸序列被設(shè)計成彼此框內(nèi)連接。通過各引物單獨地合成人FR。其結(jié)果，得到在各FR上添加有編碼小鼠CDR的DNA的產(chǎn)物。各產(chǎn)物的編碼小鼠CDR的核苷酸序列被設(shè)計成相互重疊。接著，使以人抗體基因為模板合成的產(chǎn)物的重疊CDR部分相互退火，進行互補鏈合成反應(yīng)。通過該反應(yīng)，人FR經(jīng)由小鼠⑶R序列來連接。
[0153]最終3個⑶R和4個 FR連接得到的V區(qū)基因，通過會與其5’末端和3’末端發(fā)生退火并添加有適當(dāng)?shù)南拗泼缸R別序列的引物而擴增出其全長。將如上得到的DNA和編碼人抗體C區(qū)的DNA以進行框內(nèi)融合的方式插入表達載體中，由此可以制作人型抗體表達用載體。將該整合載體導(dǎo)入宿主中建立重組細胞后，培養(yǎng)該重組細胞，通過表達編碼該人源化抗體的DNA，在該培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中產(chǎn)生該人源化抗體(參照歐州專利公開EP239400、國際公開第 TO1996/002576)。
[0154]通過定性或者定量地測定并評價如上制作的人源化抗體對抗原的結(jié)合活性，可以優(yōu)選選擇人抗體FR，以便經(jīng)由CDR連接時該CDR形成良好的抗原結(jié)合位點。根據(jù)需要，也可以按照重構(gòu)人抗體CDR形成合適的抗原結(jié)合位點的方式取代FR的氨基酸殘基。例如，可以應(yīng)用將小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR中導(dǎo)入氨基酸序列的突變。具體而言，可以向會與FR發(fā)生退火的引物中導(dǎo)入部分核苷酸序列的突變。通過這類引物合成的FR中導(dǎo)入了核苷酸序列的突變。通過用上述方法測定并評價進行了氨基酸取代的突變型抗體對抗原的結(jié)合活性，可以選擇具有所期望的性質(zhì)的突變FR序列(Cancer Res., (1993) 53，851-856)。
[0155]此外，將具有人抗體基因的全部的所有組成成分(repertoire)的轉(zhuǎn)基因動物(參照國際公開 W01993/012227、TO1992/003918、TO1994/002602、TO1994/025585、W01996/034096、W01996/033735)作為免疫動物，通過DNA免疫可以獲得所期望的人抗體。
[0156]進而，使用人抗體文庫通過淘選法獲得人抗體的技術(shù)也是已知的。例如,人抗體的V區(qū)以單鏈抗體(scFv)的形式通過噬菌體展示法表達在噬菌體的表面?？梢赃x擇表達與抗原結(jié)合的scFv的噬菌體。通過對選擇的噬菌體的基因進行分析，可以確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體V區(qū)的DNA序列。確定與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列后，將該V區(qū)序列與所期望的人抗體C區(qū)序列框內(nèi)融合后，插入適當(dāng)?shù)谋磉_載體中，由此可以制作表達載體。將該表達載體導(dǎo)入上述列舉的適當(dāng)?shù)谋磉_細胞中，使編碼該人抗體的基因表達，從而可以獲得該人抗體。這些方法已經(jīng)公知(參照國際公開W01992/001047、W01992/020791、W01993/006213、W01993/011236、W01993/019172、W01995/001438、W01995/015388)。
[0157]另外，作為獲得抗體基因的方法，除上述方法外，還可適當(dāng)使用如Bernasconi等人(Science (2002) 298，2199-2202)或 W02008/081008 中記載的 B 細胞克隆(各抗體的編碼序列的鑒定和克隆、其分離、以及用于制備各抗體(特別是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的表達載體構(gòu)建用的用途等)的方法。
[0158]EU編號和Kabat編號
根據(jù)本發(fā)明中使用的方法，分配給抗體的CDR和FR的氨基酸位置依照Kabat規(guī)定(Sequences of Proteins of Immunological Interest (Nat1nal Institute of Health,Bethesda, Md., 1987年和1991年)。本說明書中，抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的可變區(qū)的氨基酸按照Kabat編號來表不,恒定區(qū)的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的EU編號來表不。
[0159]氨基酸的修飾
為了修飾抗體的氨基酸序列中的氨基酸，可以適當(dāng)采用位點特異性誘變法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1985) 82，488-492))或重疊延伸 PCR等公知的方法。另外，作為取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸修飾方法，還可以采用多種公知的方法(Annu.Rev.B1phys.B1mol.Struct.(2006) 35, 225-249; Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(2003) 100 (11)，6353-6357)。例如，還優(yōu)選采用無細胞翻譯系統(tǒng)(CloverDirect (Protein Express))等,該系統(tǒng)在作為終止密碼子之一的UAG密碼子(琥拍密碼子)的互補性琥珀抑制基因tRNA中包含結(jié)合有非天然氨基酸的tRNA。
[0160]本說明書中，表示氨基酸的修飾位點時使用的“和/或”一詞的意義包括“和”與“或”適當(dāng)組合的所有組合。具體而言，例如“33位、55位和/或96位的氨基酸被取代”包括以下的氨基酸修飾的變異:
(a)33 位，(b) 55 位、(c) 96 位、(d) 33 位和 55 位、(e) 33 位和 96 位、(f) 55 位和96位、(g) 33位和55位和96位。
[0161]免疫原性的降低
本發(fā)明的抗體優(yōu)選在人宿主中預(yù)測的免疫原性降低。
[0162]“低免疫原性”是指，在為達到治療效果的充足時間內(nèi)，由于抗體給藥的持續(xù)效果降低而給予充足量抗體的個體的至少超過半數(shù)中，抗體沒有引起抗體反應(yīng)。
[0163]人的免疫原性水平可以利用MHC類II結(jié)合預(yù)測程序Propred (http://www.1mtech.res.1n/raghava/propred),使用所有的對立基因的1%閾值分析進行預(yù)測?？梢允褂玫钠渌绦虬?
-Rankpep (http://b1.dfc1.harvard.edu/Tools/rankpep.html)；
-Epibase (Algonomics proprietary software: algonomics.com)。
[0164]與初期的供體分子相比，免疫原性降低的分子雖然不包括預(yù)測為與在靶集團中高度表達的MHC綱II對立基因結(jié)合的肽，但該肽的數(shù)量減少(Flower等人(Drug Discov.Today (2004) 9(2)，82-90))。
[0165]MHC綱II結(jié)合的功能分析可以通過生成該蛋白所對應(yīng)的重復(fù)的肽、且對引起T細胞活化的這些能力進行試驗(T細胞增殖分析)、或者取代作為報道肽的已知的MHC綱II結(jié)合肽來實施(Hammer 等人(J.Exp.Med.(1994) 180, 2353-2358))。
[0166]為了降低本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的免疫原性，可以采用幾種方法。第一種方法是進行上述抗體的人源化的方法。更具體而言，將從人以外的動物例如小鼠中分離的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的CDR移植到人抗體中。為了維持或增強與上皮調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合，可以追加取代FR的氨基酸殘基，使人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的CDR形成適合的抗原結(jié)合位點。
[0167]作為本發(fā)明的從小鼠中分離的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的CDR的一個非限定性方案，可以列舉SEQ ID NO: 9所表示的重鏈CDRl (HCDRl)、SEQ ID NO: 10所表示的重鏈CDR2 (HCDR2)和SEQ ID NO: 11所表示的重鏈CDR3 (HCDR3)。另外，作為本發(fā)明的從小鼠中分離的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的CDR的一個非限定性方案，可以列舉SEQ ID NO: 12所表示的輕鏈 CDRl (LCDRl)、SEQ ID NO: 13 所表示的輕鏈 CDR2 (LCDR2)和 SEQ ID NO: 14 所表示的輕鏈 CDR3 (LCDR3)。
[0168]作為本發(fā)明的人抗體FR的一個非限定性方案，可以列舉SEQ ID NO:1所表示的重鏈FRl (HFRl)、SEQ ID NO: 2所表示的重鏈FR2 (HFR2)、SEQ ID NO: 3所表示的重鏈FR3 (HFR3)和SEQ ID NO: 4所表示的重鏈FR4 (HFR4)。另外，作為本發(fā)明的人抗體FR的一個非限定性方案，可以列舉SEQ ID NO: 5所表示的輕鏈FRl (LFRl)、SEQ ID NO: 6所表示的輕鏈FR2(LFR2)、SEQ ID NO: 7所表示的輕鏈FR3 (LFR3)和SEQ ID NO: 8所表示的輕鏈FR4(LFR4)。
[0169]作為本發(fā)明的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體可變區(qū)的一個非限定性方案，可以列舉SEQ ID NO: 15所表示的重鏈可變區(qū)。另外，作為本發(fā)明的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體可變區(qū)的一個非限定性方案，可以列舉SEQ ID NO: 16所表示的輕鏈可變區(qū)。
[0170]另外，作為本發(fā)明的人抗體FR的一個非限定性方案，可以列舉SEQ ID NO: 17所表示的重鏈FRl (HFRl)、或SEQ ID NO: 18所表示的重鏈FR3 (HFR3)。另外，作為本發(fā)明的人抗體FR的一個非限定性方案，可以列舉SEQ ID NO: 20所表示的輕鏈FR2 (LFR2)、SEQ IDNO: 21所表示的輕鏈FR3(LFR3)或SEQ ID NO: 23所表示的輕鏈FR3 (LFR3)。
[0171]作為本發(fā)明的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體可變區(qū)的一個非限定性方案，可以列舉SEQ ID NO: 19所表示的重鏈可變區(qū)。另外，作為本發(fā)明的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體可變區(qū)的一個非限定性方案，可以列舉SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 24所表示的輕鏈可變區(qū)。
[0172] 另外，作為本發(fā)明的人源化抗體FR的一個非限定性方案，可以列舉SEQ ID NO: 35所表示的重鏈FR3 (HFR3)、或SEQ ID NO: 36所表示的重鏈FR3 (HFR3)。作為本發(fā)明的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的可變區(qū)的一個非限定性方案，可以列舉SEQ ID NO: 37或SEQ IDNO: 38所表示的重鏈可變區(qū)。
[0173]第二種方法是:利用上述的MHC綱II結(jié)合預(yù)測程序分析抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的氨基酸序列中的氨基酸已修飾了的修飾序列，設(shè)計免疫原性減弱的修飾序列的方法。作為為了減弱本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的免疫原性而修飾氨基酸的位點的非限定性例子，優(yōu)選列舉SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈序列中以Kabat編號表示的87位和/或101位的氨基酸。另外，作為為了減弱抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的免疫原性而修飾氨基酸的位點的非限定性例子，優(yōu)選列舉SEQ ID NO: 29所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的輕鏈序列中以Kabat編號表示的24位的氨基酸。
[0174]作為上述的氨基酸取代的一個非限定性方案，優(yōu)選列舉SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈序列中以Kabat編號表示的87位的氨基酸取代成Ser (S)、和/或101位的氨基酸取代成Tyr (Y)或Phe (F)。另外，作為上述的氨基酸取代的一個非限定性方案，優(yōu)選列舉SEQ ID NO: 29所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的輕鏈序列中以Kabat編號表示的24位的氨基酸取代成Arg(R)。
[0175]第三種方法是:例如，在設(shè)計包含IgGl抗體恒定區(qū)的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體時，適當(dāng)選擇選自作為IgGl的同種異型的Glm3型(在SEQ ID NO: 31所表示的序列的C末端添加了 GK 的序列)、Glml7, I 型(SEQ ID NO: 26)或 Glml7 型(在 SEQ ID NO: 30 所表示的序列的C末端添加了 GK的序列)的同種異型的恒定區(qū)的方法。已知被給予抗體藥物的人生物種的同種異型與該抗體藥物的同種異型的適應(yīng)性會影響到該生物種的免疫應(yīng)答(Genesand Immunity (2011) 12, 213-221)。
[0176]作為免疫原性降低的本發(fā)明的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈的一個非限定性方案，可以列舉選自 SEQ ID NO: 37、38、49-56、72-79、92-98、115-127、131-135、137-140和142-150的重鏈。另外，作為本發(fā)明的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的輕鏈的一個非限定性方案，可以列舉選自 SEQ ID NO: 29、57、58、80-85、99、128-130、136 和 141 的輕鏈。
[0177]作為免疫原性降低的本發(fā)明的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的一個非限定性方案，可以列舉包含選自 SEQ ID NO: 37、38、49-56、72-79、92-98、115-127、131-135、137-140 和142-150 的重鏈以及選自 SEQ ID NO: 29、57、58、80_85、99、128-130、136和 141 的輕鏈的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。
[0178]脫酰胺化、異構(gòu)化、水解的抑制
本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，優(yōu)選其脫酰胺化、異構(gòu)化、水解得到抑制。
[0179]控制蛋白藥物的締合體量在質(zhì)量管理上、以及在考慮對藥效和免疫原性的影響時是非常重要的(Curr.0pin.B1technol.(2009) 20 (6)，708-714)。通常締合化對起因于蛋白溶液環(huán)境的膠體穩(wěn)定性(colloidal stability)和起因于蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象穩(wěn)定性(conformat1nal stability,立體配置穩(wěn)定性)兩者均有影響(J.Phar.m Sc1.(2010)100 (4)，1306-1315)。通過研究抗體制劑的配方，篩選抗體濃度或pH、緩沖液種類、離子強度、添加劑等，從而可以得到對膠體穩(wěn)定性有效的條件。另一方面，構(gòu)象穩(wěn)定性還有依賴于氨基酸序列的部分，當(dāng)為抗體時，重要的是維持CDR的規(guī)范結(jié)構(gòu)或FR的共有序列、VH/VL界面等的特征性結(jié)構(gòu)(Jung 等人(J.Mol.B1l.(2001) 309 (3)，701-716)、Xiang 等人(J.Mol.B1l.(1995) 253 (3)，385-390)、Ewert 等人(Methods.(2004) 34 (2)，184-199)、Vargas-Madrazo 等人(J.Mol.Recognit.(2003) 16 (3) 113-120)和 Morea等人(J.Mol.B1l.(1998) 275，269-294)。
[0180]脫酰胺化反應(yīng)是指，在天冬酰胺和谷氨酰胺的側(cè)鏈中非酶性地發(fā)生，使得存在于天冬酰胺和谷氨酰胺的側(cè)鏈的酰胺轉(zhuǎn)變成羧酸的反應(yīng)。另外，異構(gòu)化的原因在于:位于天冬酰胺和天冬氨酸的側(cè)鏈的羰基被位于C末端側(cè)的殘基的氮原子電子對攻擊，其結(jié)果，通過天冬酰胺的脫酰胺化或天冬氨酸的脫水形成不穩(wěn)定的環(huán)狀酰亞胺中間體。該中間體通過開裂，大部分變成異天冬氨酸，剩余部分變成天冬氨酸。當(dāng)為谷氨酰胺時，脫酰胺化速度通常是天冬酰胺時的十分之一，但其機理在本質(zhì)上是相同的，進行中只需要水分子。在這些抗體等的蛋白的保存中發(fā)生的脫酰胺化、異構(gòu)化反應(yīng)成為上述異質(zhì)性的原因，所以希望盡可能地得到抑制。另外，據(jù)報道，脫酰胺化反應(yīng)特別容易在天冬酰胺和甘氨酸鄰接的位點(Asn-Gly)發(fā)生(Geiger 等人(J.B1l.Chem.(1987) 262，785-794)。而且，還有報道稱:天冬氨酸通過水解反應(yīng)發(fā)生肽鏈的斷裂，特別是C末端側(cè)存在脯氨酸的序列(Asp-Pro)容易發(fā)生酸性條件下的分解(Segalas等人(FEBS Letters (1995) 371，171-175))。
[0181]為了抑制脫酰胺化、異構(gòu)化和水解，可以適當(dāng)實施除去作為接受脫酰胺化的位點的谷氨酰殘基和天冬氨酰殘基的氨基酸的修飾等。作為除去是特別有效的脫酰胺化位點的一個非限定性方案，優(yōu)選列舉脫酰胺化反應(yīng)得到促進的位點、即以NG和QG序列的形式表示的模體中的甘氨酸殘基、天冬酰胺殘基或谷氨酰胺殘基。其中任意一個氨基酸殘基(N、Q或G)的取代均可顯著抑制脫酰胺化反應(yīng)(W02003/057881或W02005/067620等)。另外，通過調(diào)整產(chǎn)生抗體的細胞的培養(yǎng)方法，還可適當(dāng)采用用于制備脫酰胺化反應(yīng)得到了抑制的抗體的方法。作為由本發(fā)明提供的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，還包括應(yīng)用了抑制上述脫酰胺化反應(yīng)的技術(shù)的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。
[0182]作為接受脫酰胺化的位點的非限定性例子，優(yōu)選列舉SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈序列中以Kabat編號表示的31位、52位、54位、56位和/或101位的氨基酸。另外，作為接受脫酰胺化的位點的非限定性例子，優(yōu)選列舉SEQ ID NO: 29所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的輕鏈序列中以Kabat編號表示的28位、92位和/或93位的氨基酸。
[0183]作為上述的氨基酸取代的一個非限定性方案，優(yōu)選列舉:SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈序列中以Kabat編號表示的31位的氨基酸取代成Ala(A)、和/或55位的氨基酸取代成Thr (T) ,Lys (K) ,Phe (F)、Val (V)、Arg (R)或Leu (L)。另外，作為上述的氨基酸取代的一個非限定性方案，優(yōu)選列舉SEQ ID NO: 29所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的輕鏈序列中以Kabat編號表示的92位的氨基酸取代成Glu(E)、和/或93位的氨基酸取代成Arg (R)或Gln (Q)。
[0184]作為脫酰胺化、異構(gòu)化、水解得到了抑制的本發(fā)明的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈的一個非限定性方案，可以列舉選自SEQ ID NO: 49-56、98、115-127、131-135、137-140和142-150的重鏈。另外，作為脫酰胺化、異構(gòu)化、水解得到了抑制的本發(fā)明的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的輕鏈的一個非限定性方案，可以列舉選自SEQ ID NO: 57、58、128和141的輕鏈。
[0185]作為脫酰胺化、異構(gòu)化、水解得到了抑制的本發(fā)明的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的一個非限定性方案，可以列舉包含選自SEQ ID NO: 49-56、98、115-127、131-135、137-140和142-150的重鏈和選自SEQ ID NO: 57、58、128和141的輕鏈的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。
_6] 等電點的改變
本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，優(yōu)選其等電點被改變。作為控制抗體的血漿中半衰期的方法之一，已知有修飾暴露于抗體分子表面的氨基酸殘基、并控制抗體分子表面電荷的方法(W02007/114319和W02009/041543)。具體而言，已知通過降低抗體所具有的等電點(pD的值，可以延長抗體的血漿中半衰期。與此相反，已知通過升高抗體的等電點，可以縮短血衆(zhòng)中半衰期，抗體的組織轉(zhuǎn)移性提高(Vaisitti等人(J.B1l.Regul.Homeost.Agents.(2005) 19 (3-4), 105-112)、Pardridge 等人(J.Pharmacol.Exp.Ther.(1998) 286 (I), 548-554))。另一方面，還已知其等電點降低的修飾抗體的抗腫瘤效果與修飾前的抗體相比增強(W02009/041062)。
[0187]抗體等的蛋白的pi作為多肽帶有實效電荷的pH來定義。在該領(lǐng)域中，代表性的是，當(dāng)該溶液的PH與蛋白的等電點(pi)相等時，可知蛋白溶解性最低。因此，根據(jù)其pl，可以評價在所處的pH、例如在pH6下的蛋白溶解性。蛋白的pi還是液體制劑中的蛋白粘性優(yōu)異的指標。高Pl顯示出高溶解性和低粘性(當(dāng)為高濃度制劑時特別重要)。在本發(fā)明的一個非限定性方案中，選擇具有高于預(yù)先確定的閾值的Pi的候選結(jié)構(gòu)域。抗體的Pi在抗體的生物體分布或藥效方面也發(fā)揮特定的作用。例如，還可知:若抗體的Pl變高，則其細胞內(nèi)和/或脈管外局部化增大。為了達到所期望的目的，需要確定哪種Pl特性是特定抗體最期望的。在幾個實施方式中，可以獲得Pl值為約5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5或9.0以上的抗體。在另一個非限定性方案中，可以選擇pi值為約9.0,8.5,8.0,7.5,7.0、6.5,6.0,5.5或不足5.0的抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解單一的蛋白能夠具有多種電荷形態(tài)。雖然不受特定理論的束縛，但蛋白的電荷根據(jù)各種各樣的作用機制而改變，對這種機制沒有限定，可以列舉氨基酸取代、陽離子化、脫氨基、羧基-末端氨基酸不均質(zhì)性、磷酸化和糖基化等。本說明書中使用的Pl作為主要電荷形態(tài)的Pl被定義。
[0188]蛋白的pi可以通過各種方法來確定，對這樣的方法沒有限定，作為一個非限定性方案，可以列舉等電點電泳和各種計算機算法(例如參照Bjellqvist等人(Electrophoresis (1993) 14, 1023)。在一個非限定性方案中，使用具備多溫度(multitemp)三冷卻浴再循環(huán)單兀和EPS 3501 XL電源的Pharmacia B1tech Multiphor 2電泳裝置來石角定°Pre-cast Ampholine Gel (Amersham B1sciences、pI 范圍:2.5 ~10)與 5//g蛋白同時供給。使用廣泛的P〗標志物標準(Amersham、pl范圍:3~10、8// L)確定抗體的相對P〗。在1，500V、50mA的條件下進行105分鐘的電泳。接著，使用用純凈水稀釋至IX的Sigma固定溶液(5X)將凝膠固定。使用Simply Blue染料(Invitrogen),在室溫下將該凝膠染色一夜。使用由25%乙醇、8%乙酸和67%純凈水組成的溶液將該凝膠脫染。使用B1-Rad密度計，根據(jù)標準校正曲線來確定等電點。
[0189]為了改變本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的等電點，可適當(dāng)實施下述的氨基酸修飾等:除去抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的氨基酸序列中帶電荷的氨基酸、或者在抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的氨基酸序列中添加或插入帶電荷的氨基酸。已知在氨基酸中存在帶電荷的氨基酸。通常，作為帶正電荷的氨基酸(正電荷氨基酸)，已知有賴氨酸(K)、精氨酸(R)、組氨酸(H)。作為帶負電荷的氨基酸(負電荷氨基酸)，已知有天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)等。除這些以外的氨基酸則作為不帶電荷的氨基酸而已知。
[0190]作為上述“修飾了的氨基酸殘基”，優(yōu)選從以下的(a)或(b)任一組所含的氨基酸殘基的添加、插入或除去中適當(dāng)選擇，但并不特別限于這些氨基酸。
[0191](a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；
(b)賴氨酸(K)、精氨酸(R)、組氨酸(H)。
[0192]需要說明的是，在原始(修飾前的)氨基酸殘基已經(jīng)帶有電荷的情況下，將其修飾成不帶有電荷的氨基酸殘基，這也是本發(fā)明的優(yōu)選方案之一。即，作為本發(fā)明中的修飾，可以列舉:(1)由帶有電荷的氨基酸取代成不帶電荷的氨基酸、(2)由帶有電荷的氨基酸取代成與該氨基酸帶有相反電荷的氨基酸、(3)由不帶有電荷的氨基酸取代成帶有電荷的氨基酸。
[0193]作為為了改變本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的等電點而修飾氨基酸的位點的非限定性例子，優(yōu)選列舉SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈序列中以Kabat編號表示的13位、61位、62位、64位、65位、97位和/或98位的氨基酸。另外，作為為了改變抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的等電點而修飾氨基酸的位點的非限定性例子，優(yōu)選列舉SEQ IDNO: 29所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的輕鏈序列中以Kabat編號表示的24位、55位、56位和/或107位的氨基酸。
[0194]作為上述氨基酸取代的一個非限定性方案，優(yōu)選列舉:SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈序列中以Kabat編號表示的14位的氨基酸取代成Asn(N)或Lys (K)、61位的氨基酸取代成Asp (D)或Glu (E)、62位的氨基酸取代成Ser(S)或Gln (Q)、64位的氨基酸取代成Asp (D)或Glu (E)、65位的氨基酸取代成Asp (D)或Glu (E)、97位的氨基酸取代成Arg (R)、和/或98位的氨基酸取代成Glu (E)。另外，作為上述氨基酸取代的一個非限定性方案，優(yōu)選列舉SEQ ID NO: 29所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的輕鏈序列中以Kabat編號表示的24位的氨基酸取代成Gln(Q)或Ser(S)、55位的氨基酸取代成Glu(E)、56位的氨基酸取代成Glu (E)、和/或106a位的氨基酸取代成Glu (E)。
[0195]作為等電點已改變的本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈的一個非限定性方案，可以列舉選自 SEQ ID NO: 72-79、98、115-127、131-135、137-140和 142-150 的重鏈。另外，作為等電點已改變的本發(fā)明的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的輕鏈的一個非限定性方案，可以列舉選自SEQ ID NO: 80-85和99的輕鏈。
[0196]作為等電點已改變的本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的一個非限定性方案，可以列舉:包含選自 SEQ ID NO: 72-79、98、115-127、131-135、137-140 和 142-150 的重鏈以及選自SEQ ID NO: 80-85和99的輕鏈的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。
_7] 穩(wěn)定性的改善
本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，優(yōu)選其穩(wěn)定性得到改善。作為表示抗體穩(wěn)定性的一個以上的參數(shù)，可以列舉結(jié)構(gòu)域的熱熔解溫度(Tm)值?？贵w的Tm值能作為抗體的熱穩(wěn)定性優(yōu)異的指標，而且還能成為抗體的保管期間的指標。Tm值越低，則顯示越形成締合體/穩(wěn)定性越低；相對于此，Tm值越高，則顯示越不形成締合體/穩(wěn)定性越高。因此，優(yōu)選提供Tm值高的抗體。在本發(fā)明的一個非限定性方案中，選擇具有高于預(yù)先確定的閾值的Tm值的抗體。在幾個實施方式中，選擇具有至少 50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C、90°C、95°C或100°C以上的Tm值的抗體。
[0198]抗體的熱熔解溫度(Tm)可以通過本領(lǐng)域所周知的所有標準方法來測定。例如，Vermeer等人通過差示掃描量熱測定(DSC)和圓二色性(⑶)光譜學(xué)研究了同種型2b的單克隆小鼠抗大鼠IgG的解疊和變性(B1phys.J.(2000) 78，394-404、ColloidsSurfaces A: Physicochem.Eng.Aspects.(2000) 161, 139-150、J.Colloid InterfaceSc1.(2000) 225，394-397,2000, B1phys.J.(2000) 79，2150-2154)。其結(jié)果，認為IgG的折疊和解疊以兩個主要的轉(zhuǎn)變?yōu)樘卣?，可知這些轉(zhuǎn)變本身也是各種步驟重合的結(jié)果。在DSC和CD實驗兩者中均確認到的雙峰分布不被實驗中的掃描速度所左右。兩個轉(zhuǎn)變是獨立的，而解疊是不可逆的。將由該IgG消化的Fab和Fe片段的二級結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)穩(wěn)定性與完整的免疫球蛋白的這些值進行了比較(Vermeer等人(B1phys.J.(2000)79，2150-2154))。認為在完整的IgG中確認到的兩個峰分別分配給了 Fab和Fe片段。Vermeer等人還明確了:除了可以通過熱誘發(fā)IgG的結(jié)構(gòu)的擾動以外,通常還可通過pH的變更(B1phys.J.(2000) 78，394-404)或與疏水性環(huán)境的相互作用、例如在Tef1n表面的吸附或與表面活性劑的相互作用(Vermeer等人，1998，B1chim.B1phys.Acta.(1988) 1425, 1-12; Colloids Surfaces A: Physicochem.Eng.Aspects.(2000) 161,139-150; J.Colloid Interface Sc1.225 (2000) 394-397)誘發(fā) IgG 的結(jié)構(gòu)的擾動。
[0199]在本發(fā)明的一個非限定性方案中，使用包含所分離的抗體的樣品來測定抗體的Tm值。在一個實施方式中，使用VP-DSC(MicroCal、LLC)，在掃描速度:1.(TC /分鐘和溫度范圍:25~120°C的條件下測定抗體的Tm值?？梢圆捎?分鐘的掃描前調(diào)溫和8秒的濾過時間。在具體例子中，使用Pierce透析杯(3.5kD),通過用25mM的組氨酸-HCl透析來制備樣品。平均抗體濃度為50//g/mL，這可以由280nm的吸光度來確定。使用與裝置一起提供的Origin軟件，按照制備商的規(guī)程確定熔解溫度。簡單地，通過使多個的基線和緩沖液一同流入樣品和對照池兩者中，確立熱平衡。從樣品熱解曲線中扣除基線后，對數(shù)據(jù)進行濃度基準化，使用去裙合(deconvolut1n)函數(shù)使其擬合。在另一實施方式中，抗體的穩(wěn)定性利用以下方法來評價。一個以上的測定基準還可以包括:表示在選自各種PH值、各種溫度、各種剪切應(yīng)力、和各種凍結(jié)/解凍循環(huán)的一種以上的各種條件下的抗體穩(wěn)定性的測定基準。
[0200]在本發(fā)明的一個非限定性方案中，DSC可以使用Setaram Micro-DSCIII (Setaram、Caluire、法國)來測定。相對于包含適當(dāng)?shù)目瞻兹芤旱腎mL的對照池,用ImL的樣品池在量熱計中配置樣品。將池在量熱計內(nèi)于25°C下穩(wěn)定4小時后，以所選擇的加熱速度將該池加熱至最終溫度。使用Setaram軟件(Setaram、1.3版)，能夠確定轉(zhuǎn)移溫度和焓。
[0201]在本發(fā)明的一個非限定性方案中，使用圓二色性(CD)光譜學(xué)能夠獲得熱變性/再生曲線?？梢酝ㄟ^⑶光譜學(xué)研究溫度和/或例如作為pH函數(shù)的IgG的二級結(jié)構(gòu)的變化(Fasman 等人(Circular Dichroism and the Conformat1nal Analysis ofB1molecules.(1996) Plenum Press))。根據(jù)de Jongh等人,該方法的優(yōu)點在于:分光信號不受周圍溶液的存在的影響；以及采用明確的規(guī)程，根據(jù)各種結(jié)構(gòu)元素(structureelement)的基準光譜可以闡明二級結(jié)構(gòu)(B1chemistry (1994) 33, 14521-14528)。二級結(jié)構(gòu)元素的組分可由⑶光譜獲得。
[0202]在本發(fā)明的一個非限定性方案中，可以使用JASCO分光偏光計、J-715模式(JASC0Internat1nal C0.)進行測定?？梢允褂霉饴烽L為0.1cm的石英比色皿。溫度調(diào)節(jié)可以使用JASCO PTC-348WI (JASC0 Internat1nal)熱電偶來進行。使用分解能為0.2°C和時間常數(shù)為16秒的Peltier熱電偶，記錄溫度掃描。在遠紫外線區(qū)(0.2nm分解能)的波長掃描可以通過蓄積具有適合的掃描速度的多個掃描來獲得。
[0203] 熱變性/再生曲線還可以通過分光法來測定。若溶液中的蛋白對加熱產(chǎn)生應(yīng)答而變性，則分子凝聚，溶液會散射更強光。由于通過凝聚會使樣品的光學(xué)透明性發(fā)生變化，所以通過監(jiān)測規(guī)定波長的可見或紫外線吸收的變化，可以測定凝聚。
[0204]在本發(fā)明的一個非限定性方案中，利用熒光分光學(xué)能夠獲得熱變性/再生曲線。在一實施方式中，監(jiān)測固有蛋白熒光、例如固有色氨酸熒光。在其他實施方式中，監(jiān)測熒光探針分子。實施熒光分光學(xué)實驗的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。例如，參照Bashford等人(Spectrophotometry and Spectrofluorometry: A Practical Approach (1987)91-114, IRL Press Ltd.)、Bell J.E.(Spectroscopy in B1chemistry (1981) Vol.1,155-194, CRC Press)或 Brand 等人(Ann.Rev.B1chem.(1972) 41, 843)。
[0205]其生物學(xué)活性也一樣，可以利用基于抗體的物理學(xué)和化學(xué)結(jié)構(gòu)的、用于評價抗體組合物的穩(wěn)定性的各種方法。例如，為了研究抗體的變性，除上述分析以外，還可以利用電荷轉(zhuǎn)移吸收、熒光分光法、NMR、rCGE(還原毛細管凝膠電泳)和/或HPSEC (高效尺寸排阻色譜法)等方法(例如 Wang 等人(J.Parenteral Science & Technology 42 (增刊)，S4-S26))。
[0206]還原毛細管凝膠電泳和高速尺寸排阻色譜法是用于評價蛋白締合體或蛋白分解物、以及蛋白片段的形成的最一般的簡便方法。因此，由本發(fā)明提供的包含抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的組合物的穩(wěn)定性也可以通過這些方法來評價。
[0207]為了改變本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的穩(wěn)定性，可以適當(dāng)實施抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的氨基酸序列中的氨基酸的修飾等。
[0208]作為用于改變本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體穩(wěn)定性的一個非限定性方案，當(dāng)抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體為IgGl抗體時，作為來自人IgG抗體的重鏈C末端序列(Gl、SEQ ID NO:25)的異質(zhì)性而報道的、作為降低由C末端氨基酸的賴氨酸殘基的缺陷和C末端的兩個氨基酸即甘氨酸、 賴氨酸兩者的缺陷引起的C末端氨基的酰胺化(Anal.B1chem.(2007) 360(1)，75-83)的方法,優(yōu)選列舉缺損重鏈C末端的兩個氨基酸、即以EU編號表不的446位的甘氨酸和447位的賴氨酸的修飾(W02009/041613)。由于希望不存在來自本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈C末端序列的異質(zhì)性，所以可以利用缺損了人IgGl的以EU編號表示的446位的甘氨酸和447位的賴氨酸的IgGl序列(Gld、SEQ ID NO: 26)作為恒定區(qū)序列。
[0209]作為穩(wěn)定性得到了改善的本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈的一個非限定性方案，可以列舉選自 SEQ ID NO: 37、38、49-56、72-79、92-98、115-127、131-135、137-140和142-150的重鏈。另外，作為穩(wěn)定性得到了改善的本發(fā)明的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的輕鏈的一個非限定性方案，可以列舉選自SEQ ID NO: 99、128-130、136和141的輕鏈。
[0210]作為穩(wěn)定性得到了改善的本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的一個非限定性方案，可以列舉包含選自 SEQ ID NO: 37、38、49-56、72-79、92-98、115-127、131-135、137-140 和142-150的重鏈以及選自SEQ ID NO: 99、128-130、136和141的輕鏈的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。
[0211]締合體暈的減少
本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，優(yōu)選其締合體量減少?？刂频鞍姿幬锏木喓象w量在質(zhì)量管理上、以及在考慮對藥效和免疫原性的影響時非常重要(Curr.0pin.B1technol.(2009) 20 (6), 708-714)。通常締合化對起因于蛋白溶液環(huán)境的膠體穩(wěn)定性和起因于蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象穩(wěn)定性兩者有影響(J.Pharm.Sc1.(2010) 100 (4)，1306-1315)。通過研究抗體制劑的配方，篩選抗體濃度或pH、緩沖液種類、離子強度、添加劑等，從而得到對膠體穩(wěn)定性有效的理想條件。另一方面，構(gòu)象穩(wěn)定性還有依賴于氨基酸序列的部分，當(dāng)為抗體時，認為重要的是維持CDR的規(guī)范結(jié)構(gòu)或FR的共有序列、VH/VL界面等的特征性結(jié)構(gòu)(Jung等人(J.Mol.B1l.(2001) 309 (3)，701-716)、Xiang 等人(J.Mol.B1l.(1995)253 (3)，385-390)、Ewert 等人(Methods.(2004) 34 (2)，184-199)、Vargas-Madrazo等人(J.Mol.Recognit.(2003) 16 (3)，113-120)、Morea等人(工 Mol.B1l.(1998)275，269-294)、Vargas-Madrazo 等人(J.Mol.Recognit.(2003) 16 (3)，113-120))。
[0212]根據(jù)蛋白的物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)、以及它們的生物活性，在評價包含抗體制劑的蛋白制劑的穩(wěn)定性時可以采用各種方法。例如，為了研究蛋白的變性，可以利用電荷轉(zhuǎn)移吸收、熱分析、熒光分光法、圓二色性(CD)、NMR,以及HPSEC、切向流過濾(TFF)、靜態(tài)光散射法(SLS)、傅里葉變換紅外分光法(FTIR)、尿素誘發(fā)蛋白解疊技術(shù)、固有色氨酸熒光、差示掃描量熱測定法、以及1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)蛋白結(jié)合技術(shù)等方法。例如，可以從記載在Wang等人(J.0f Parenteral Science & Technology (1988) 42 (Suppl), S4-S26)中的方法中選擇并適當(dāng)使用。
[0213]rCGE和HPSEC是評價蛋白凝聚體的形成、蛋白分解和蛋白片段化的最一般且最簡單的方法。因此，本發(fā)明的液體制劑的穩(wěn)定性可以通過這些方法來評價。
[0214]例如，本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的穩(wěn)定性可以通過HPSEC或rCGE來評價，此時，峰區(qū)域率表不未分解抗體或未分解抗體片段。在一個非限定性方案中，將約250// g的抗體(約25// L含有10mg/mL的上述抗體的液體制劑)注入裝有TSK Sff X I保護柱(6.0mmX4.0cm)的 TosoH B1sep TSK G3000SWXL 柱(7.8mmX30cm)中?？贵w(包括其抗體片段)則使用含有0.1M硫酸鈉和0.05%疊氮化鈉的0.1M磷酸二鈉，通過0.8-1.0mL/分鐘的流量以均勻濃度洗脫。洗脫蛋白使用280nm的UV吸光度來檢測。在測定中，運行參照標準作為對照，與在約12~14分鐘內(nèi)觀察到的、除所含容量峰以外的其他所有峰進行比較，以生成單體峰的區(qū)域率的形式報告其結(jié)果。記錄比單體峰早洗脫的峰作為凝聚率。
[0215]為了減少本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的締合體量，而減弱包含抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈和輕鏈的分子間的疏水性相互作用。具體而言，適當(dāng)實施將抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈或輕鏈的氨基酸序列中的疏水性殘基取代成親水性殘基的氨基酸修飾等。在優(yōu)選的一個非限定性方案中，適當(dāng)實施將抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的CDR內(nèi)所含的疏水性殘基取代成親水性殘基的氨基酸修飾等。已知在氨基酸中存在親水性氨基酸和疏水性氨基酸。通常，作為親水性氨基酸，已知有 Asp (D)、Glu (E)、Arg (R)、Lys (K)、His (H)、Gly (G)、Ser (S)、Thr (T)、Cys (C)、Asn (N)、Gln (Q)、Tyr (Y)。作為疏水性氨基酸，已知有 Ala(A)、Val (V)、Leu (L)、lie (I)、Met (M)、Trp (W)、Phe (F)、Pro (P)。作為上述氨基酸的修飾，優(yōu)選從選自上述疏水性殘基中的一個以上的氨基酸向從上述親水性殘基中選擇的氨基酸的取代中適當(dāng)選擇，但并不特別限于特定的氨基酸。
[0216]作為為了減少本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的締合體量而修飾氨基酸的位點的非限定性例子，優(yōu)選列舉SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈序列中以Kabat編號表示的60位和/或98位的氨基酸。
[0217]作為上述的氨基酸取代的一個非限定性方案，優(yōu)選列舉:SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈序列中以Kabat編號表示的60位的氨基酸向His(H)、Lys(K)、Thr (T)、Ser (S)或Arg (R)的取代、和/或98位的氨基酸向Ser (S)或Glu (E)的取代。
[0218]作為締合體量已減少的本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈的一個非限定性方案，可以列舉選自 SEQ ID NO: 92-98、115-127、131-135、137-140 和 142-150 的重鏈。
[0219]作為締合體量已減少的本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的一個非限定性方案，可以列舉包含選自 SEQ ID NO: 92-98、115-127、131-135、137-140 和 142-150 的重鏈以及選自SEQ ID NO: 99、128-130、136和141的輕鏈的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。
[0220]與非人動物的上皮調(diào)節(jié)蛋白和人動物的上皮調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的種屬交叉反應(yīng)性的賦予
本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體優(yōu)選顯示出非人動物和人動物間的種屬交叉反應(yīng)性(cross-species reactivity)的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。SP，本發(fā)明提供抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，其特征在于:是與包含SEQ ID NO: 9、10和11所表示的重鏈可變區(qū)⑶R以及SEQ ID NO:
12、13和14所表示的輕鏈可變區(qū)CDR的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體所結(jié)合的表位結(jié)合的抗體，其中，對SEQ ID NO: 170所表示的猴上皮調(diào)節(jié)蛋白的KD值(cEREG KD)與對SEQ ID NO: 34所表示的人上皮調(diào)節(jié)蛋白的KD值(hEREG KD)之比(cEREG KD/hEREG KD)小于包含SEQ IDNO: 9、10和11所表示的重鏈可變區(qū)⑶R以及SEQ ID NO: 12、13和14所表示的輕鏈可變區(qū)⑶R的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的cEREG KD/hEREG KD。
[0221]具體而言，本發(fā)明為了改變包含SEQ ID NO: 9、10和11所表示的重鏈可變區(qū)⑶R以及SEQ ID NO: 12、13和14所表示的輕鏈可變區(qū)⑶R的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體對猴上皮調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合活性，而修飾了上述的CDR的氨基酸序列。由于猴上皮調(diào)節(jié)蛋白與人上皮調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)構(gòu)上的差異尚未明確，所以當(dāng)修飾抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的哪個氨基酸殘基時能增強對猴上皮調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合活性的指導(dǎo)完全沒有顯示。在本發(fā)明中，設(shè)計了 CDR的任意位點的氨基酸殘基被取代的多個抗體序列。具體而言，制作了上述的CDR序列中的氨基酸被取代成Arg(R)殘基的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。
[0222]令人驚奇的是，CDR序列中的氨基酸被取代成Arg(R)殘基的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體對猴上皮調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合活性增強。即，通過將抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的CDR序列中的氨基酸取代成Arg(R)殘基，可以賦予與非人動物的上皮調(diào)節(jié)蛋白和人動物的上皮調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的種屬交叉反應(yīng)性。
[0223]對SEQ ID NO: 170所表示的猴上皮調(diào)節(jié)蛋白的KD值(cEREG KD)可以通過上述結(jié)合活性的項目中記載的方法算出?？股掀ふ{(diào)節(jié)蛋白抗體對上皮調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進行測定，關(guān)于其測定條件，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)確定?？股掀ふ{(diào)節(jié)蛋白抗體對上皮調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合活性可以以KD(Dissociat1nconstant:解離常數(shù))、表觀 KD (Apparent dissociat1n constant:表觀解離常數(shù))、作為解離速度的 kd (Dissociat1n rate:解離速度常數(shù))、或表觀 kd (Apparent dissociat1n:表觀解離速度常數(shù))等形式來評價。這些常數(shù)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來測定，例如可以使用 Biacore (GE healthcare)、斯卡查德圖(Scatchard plot)、FACS 等。通過用該KD值除以對SEQ ID NO: 34所表示的人上皮調(diào)節(jié)蛋白的KD值(hEREG KD)，能夠確定對猴上皮調(diào)節(jié)蛋白的KD值(cEREG KD)與對人上皮調(diào)節(jié)蛋白的KD值(hEREG KD)之比(cEREG KD/hEREG KD)。
[0224]本發(fā)明中，cEREG KD/hEREG KD優(yōu)選小于40。另外，在一個非限定性方案中，cEREGKD/hEREG KD優(yōu)選小于10。在其他的一個非限定性方案中，cEREG KD/hEREG KD優(yōu)選小于6，進而在不同的一個非限定性方案中，cEREG KD/hEREG KD優(yōu)選小于4。
[0225]作為由本發(fā)明提供的、為了賦予與非人動物的上皮調(diào)節(jié)蛋白和人動物的上皮調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的種屬交叉反應(yīng)性而修飾氨基酸的位點的非限定例子，優(yōu)選列舉SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈序列中以Kabat編號表示的33位、51位、54位、55位、56位、57位、58位、59位、60位、62位、65位、96位、97位和/或98位的氨基酸。另外，作為由本發(fā)明提供的、為了賦予與非人動物的上皮調(diào)節(jié)蛋白和人動物的上皮調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的種屬交叉反應(yīng)性而修飾氨基酸的位點的非限定性例子，優(yōu)選列舉SEQ ID NO: 29所表示的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的輕鏈序列中以Kabat編號表示的24位、93位和/或94位的氨基酸。作為氨基酸修飾的優(yōu)選例子，可以列舉上述的一個以上的氨基酸向Arg(R)的取代。
[0226]作為賦予了種屬交叉性的本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的重鏈的一個非限定性方案，可以列舉選自SEQ ID NO: 115-127、131-135、137-140和142-150的重鏈。另外，作為等電點已改變的本發(fā)明的人源化抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的輕鏈的一個非限定性方案，可以列舉選自SEQ ID NO: 128-130、136和141的輕鏈。
[0227]作為賦予了種屬交叉性的本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的一個非限定性方案，可以列舉包含選自SEQ ID NO: 98、115-127、131-135、137-140和142-150的重鏈以及選自SEQ ID NO: 29、128-130、136和141的輕鏈的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。
[0228]中和活件
本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，優(yōu)選為具有中和活性的抗體。通常，中和活性是指，抑制病毒或毒素等對細胞具有生物學(xué)活性的配體的該生物學(xué)活性的活性。即，具有中和活性的物質(zhì)是指，與該配體或該配體所結(jié)合的受體結(jié)合，抑制該配體與受體的結(jié)合的物質(zhì)。通過中和活性抑制了與配體的結(jié)合的受體無法發(fā)揮由該受體介導(dǎo)的生物學(xué)活性。具有這種中和活性的抗體通常被稱作中和抗體。該中和活性可以通過在作為對象的配體的存在下、在評價其中和活性的被測物質(zhì)的存在或不存在下的條件之間比較該生物學(xué)活性來測定。
[0229]在認為是本發(fā)明的上皮調(diào)節(jié)蛋白的主要受體的EGF受體的情況下，通過配體的結(jié)合形成二聚物，激活存在于細胞內(nèi)的自身結(jié)構(gòu)域即酪氨酸激酶。被激活的酪氨酸激酶通過自身磷酸化形成含有磷酸化酪氨酸的肽，使各種信號傳遞的輔助分子與之締合。這些輔助分子主要是PLCy (磷脂酶C Y)、She、Grb2等。在這些輔助分子中，前兩者進一步通過EGF受體的酪氨酸激酶而接受磷酸化。從EGF受體開始的信號傳遞中的主要路徑是以She、Grb2、Sos、Ras、Raf/MAPK激酶/MAP激酶的順序傳遞磷酸化的路徑。而且，認為存在作為副路徑的從PLC Y到PKC的路徑。
[0230]這種細胞內(nèi)的信號級聯(lián)根據(jù)各細胞種類而不同，所以可以根據(jù)作為目標的各靶細胞設(shè)定適當(dāng)靶分子，并不限于上述因素。生物體內(nèi)信號活化的測定試劑盒可以使用市售的試劑盒(例如，蛋白激酶C活性測定系統(tǒng)(GE Healthcare B1science株式會社)等)。
[0231]另外，以對于存在于生物體內(nèi)信號級聯(lián)下游的靶基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)作用為指標，也可以檢測生物體內(nèi)信號的活化。轉(zhuǎn)錄活性的變化可以根據(jù)報道基因測定的原理進行檢測。具體而言，在靶基因的轉(zhuǎn)錄因子或啟動子區(qū)的下游配置GFP(綠色熒光蛋白，GreenFluorescence Protein)或螢光素酶等報道基因，測定其報道基因活性，從而可以以報道基因活性的形式測定轉(zhuǎn)錄活性的變化。
[0232]而且，由于EGF受體通常在促進細胞增殖的方向發(fā)揮作用，所以通過測定靶細胞的增殖活性，可以評價生物體內(nèi)信號傳遞的活化。本發(fā)明中，通過評價后者的細胞增殖活性來評價本發(fā)明的中和抗體的中和活性，但并不限于該方法，對于選擇的各靶細胞，可以優(yōu)選采用上述列舉的方法進行評價。
[0233]即，例如通過測定以下的細胞增殖活性，可以評價或測定抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的中和活性。例如，采用以添加在培養(yǎng)基中的[3H]標記的胸苷的活細胞的攝入作為DNA復(fù)制能力的指標進行測定的方法。作為更簡便的方法，采用在顯微鏡下計測將臺盼藍等色素排除到細胞外的能力的色素排除法或MTT法。后一種方法利用的是活細胞具有將作為四氮唑鹽的MTT (3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四氮唑)轉(zhuǎn)換成藍色的甲臜產(chǎn)物的能力。更具體而言，在被測細胞的培養(yǎng)液中添加被測抗體，經(jīng)過一定時間后，將MTT溶液添加到培養(yǎng)液中靜置一定時間，從而MTT被攝入到細胞內(nèi)。其結(jié)果，黃色化合物MTT通過細胞內(nèi)的線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶轉(zhuǎn)變成藍色化合物。將該藍色產(chǎn)物溶解、顯色后，測定其吸光度，以此作為活細胞數(shù)的指標。
[0234]除MTT 以外，MTS、XTT、WST-U WST-8 等試劑也在出售(nacalai tesque 等)，可以優(yōu)選使用。而且，以細胞的ATP或細胞培養(yǎng)物的阻抗為指標來評價細胞增殖活性的方法也是公知的。測定活性時，將作為對照抗體的在具有與抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體相同的同種型的抗體中不具有該中和活性的結(jié)合抗體與抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體一樣使用，由于抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體顯示出比對照抗體強的中和活性，從而可以判定活性。中和活性的測定方法的具體例子還公開在W02008/047723等中，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以適當(dāng)使用這些公知的測定方法。
[0235]細胞毒活性
本發(fā)明中使用的抗體優(yōu)選為具有細胞毒活性的抗體。
[0236]作為本發(fā)明中的細胞毒活性，例如可以列舉:抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity:ADCC)活性、補體依賴性細胞毒(complement-dependent cytotoxicity:Q)C)活性等。本發(fā)明中，⑶C活性是指由補體系統(tǒng)產(chǎn)生的細胞毒活性。而ADCC活性是指，特異性抗體附著在靶細胞的細胞表面抗原上時，在其Fe部分上，經(jīng)由Fe Y受體結(jié)合有Fe Y受體保守細胞(免疫細胞等)，對靶細胞帶來傷害的活性。本發(fā)明中使用的抗體可以是具有CDC活性或ADCC活性的抗體，或者可以是一并具有⑶C活性和ADCC活性的抗體。
[0237]抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體是否具有ADCC活性、或者是否具有⑶C活性，可以通過公知的方法來測定(例如Current protocols in Immunology, Chapter7.1mmunologicstudies in humans, Editor, John E，Coligan等人，John Wiley & Sons, Inc., (1993)
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[0238]具體而言，首先，進行效應(yīng)細胞、補體溶液、靶細胞的制備。
[0239](I)效應(yīng)細胞的制備
從CBA/N小鼠等中取出脾臟，在RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)中分離脾細胞。用包含10%胎牛血清(FBS、HyClone公司制)的相同培養(yǎng)基清洗后，將細胞濃度調(diào)整至5 X 1fVmL，從而可以制備效應(yīng)細胞。
[0240](2)補體溶液的制備
使用含有10%FBS的培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)，將幼兔補體(CEDARLANE公司制)稀釋10倍，可以制得補體溶液。
[0241](3)靶細胞的制備
將表達上皮調(diào)節(jié)蛋白的細胞和0.2mCi的51Cr-鉻酸鈉(GE Healthcare B1science公司制)一同在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中、在37°C下培養(yǎng)I小時，從而能夠?qū)υ摪屑毎M行放射性標記。作為表達上皮調(diào)節(jié)蛋白的細胞，可以使用經(jīng)編碼上皮調(diào)節(jié)蛋白的基因轉(zhuǎn)化的細胞、原發(fā)性大腸癌細胞、轉(zhuǎn)移性大腸癌細胞、肺腺癌細胞、胰癌細胞、胃癌細胞、腎癌細胞、大腸癌細胞、食道癌細胞等。在放射性標記后，用含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基清洗細胞3次，將細胞濃度調(diào)整至2X 105/mL，從而能夠制備該靶細胞。
[0242]ADCC活性或⑶C活性可以通過下述方法來測定。測定ADCC活性時，將各孔中分別加入了 50//L靶細胞和50//L抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的96孔U底板(Becton Dickinson公司制)在冰上靜置15分鐘。之后，將各孔中加入了 100//L效應(yīng)細胞的板在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時?？贵w的終濃度可以調(diào)整至O或10//g/mL。培養(yǎng)后，回收的100//L上清中的放射活性使用 Y 計數(shù)儀(COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005,Packard InstrumentCompany公司制)來測定。至于細胞毒活性(%)，可以使用所得的值根據(jù)下述算式來計算:
(式2)
(A-C) / (B-C) X 100。
[0243]A表示各樣品中的放射活性(cpm), B表示加入了 1%NP_40 (nacalai tesque公司制)的樣品中的放射活性(cpm)，C表示只含有靶細胞的樣品的放射活性(cpm)。
[0244]另一方面，測定⑶C活性時，將各孔中分別加入了 50//L靶細胞和50//L抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的96孔平底板(Becton Dickinson公司制)在冰上靜置15分鐘。之后,將各孔中加入了 100//L補體溶液的板在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時。抗體的終濃度調(diào)整至O或3/zg/mL。培養(yǎng)后，回收的100//L上清中的放射活性使用Y計數(shù)儀來測定。細胞毒活性與ADCC活性的測定一樣來計算。
[0245]ADCC活性增強的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體
作為本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，還可優(yōu)選使用ADCC活性增強的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。如上所述，ADCC活性是指，特異性抗體附著在靶細胞的細胞表面抗原上時，在其Fe部分上經(jīng)由Fe Y受體結(jié)合有Fe Y受體表達細胞(免疫細胞等)，對靶細胞帶來傷害的活性，所以通過增強免疫細胞等的Fe Y受體表達細胞對Fcy受體的結(jié)合活性，可以增強由抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體介導(dǎo)的ADCC活性。作為增強免疫細胞等的Fe Y受體表達細胞對Fe Y受體的結(jié)合活性的方法，至少可以采用下述三種公知的方法。
[0246](I) Fe區(qū)的氨基酸被修飾的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體
通過修飾本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體中所含的Fe區(qū)的氨基酸，能夠獲得對Fe Y受體的結(jié)合活性增強的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體。作為用于修飾的優(yōu)選的IgG型免疫球蛋白的Fe區(qū)，例如可以列舉人IgG(IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4和它們的修飾體)的Fe區(qū)。
[0247]關(guān)于向其他氨基酸的修飾，只要對Fe Y受體的結(jié)合活性增強，則可以修飾任何位置的氨基酸。在本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體包含人IgGl的Fe區(qū)作為人Fe區(qū)的情況下，優(yōu)選包含帶來對Fe Y受體的結(jié)合與來自人IgGl的Fe區(qū)的結(jié)合活性相比增強的效果的修飾。作為用于增強對Fe Y受體的結(jié)合活性的氨基酸修飾，例如在W02007/024249、W02007/021841, W02006/031370, W02000/042072, W02004/029207, W02004/099249,W02006/105338, W02007/041635, W02008/092117, W02005/070963, W02006/020114,W02006/116260 和 W02006/023403 等中有報道。
[0248]作為可以進行這種修飾的氨基酸，例如可以列舉:選自以EU編號表示的221位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249 位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266 位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279 位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293 位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305 位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327 位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376 位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429 位、434位、436位和440位的至少一個以上的氨基酸。通過這些氨基酸的修飾，能夠增強本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的Fe區(qū)對Fe Y受體的結(jié)合。本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體可以包含下述取代:在SEQ ID NO: 26的重鏈恒定區(qū)中，例如選自以EU編號表示的230位、240位、244 位、245 位、247 位、262 位、263 位、266 位、273 位、275 位、299 位、302 位、313 位、323位、325位、328位和332位的氨基酸的至少一個取代。
[0249]為了在本發(fā)明中使用，作為特別優(yōu)選的修飾，例如可以列舉:本發(fā)明的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的Fe區(qū)的以EU編號表示的、選自以下的至少一個以上的氨基酸的修飾:
221位的氨基酸為Lys或Tyr中的任一個；
222位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
223位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中的任一個；
224位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
225位的氨基酸為Glu、Lys或Trp中的任一個；
227位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
228位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
230位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一個；
231位的氨基酸為Glu、Gly、Lys> Pro或Tyr中的任一個；
232位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
233位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
234位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
235位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、IIe、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
236位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
237位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
238位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
239 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
240位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
241位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一個；
243位的氨基酸為Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp或Tyr中的任一個；
244位的氨基酸為His ；
245位的氨基酸為Ala;
246位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
247 位的氨基酸為 Ala、Phe> Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
249位的氨基酸為Glu、His、Gln或Tyr中的任一個；
250位的氨基酸為Glu或Gln中的任一個；
251位的氨基酸為Phe ；
254位的氨基酸為Phe、Met或Tyr中的任一個；
255位的氨基酸為Glu、Leu或Tyr中的任一個；
256位的氨基酸為Ala、Met或Pro中的任一個；
258位的氨基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一個；
260位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
262位的氨基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一個；
263位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
264位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr > Trp或Tyr中的任一個；
265位的氨基酸為 Ala、Leu、Phe、Gly、Hi S、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
266位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
267位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
268位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe> Gly、lie、Lys> Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或Trp中的任一個；
269位的氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro> Arg> Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
270位的氨基酸為 Glu、Phe> Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr> Trp 或Tyr中的任一個；
271 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
272位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val> Trp或Tyr中的任一個；
273位的氨基酸為Phe或Ile中的任一個；
274位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
275位的氨基酸為Leu或Trp中的任一個；
276 位的氨基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
278 位的氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中的任一個；
279位的氨基酸為Ala;
280 位的氨基酸為 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一個；
281位的氨基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
282位的氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
283 位的氨基酸為 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一個；
284位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一個； 285位的氨基酸為Asp、Glu、Lys、Gin、Trp或Tyr中的任一個；
286位的氨基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一個；
288位的氨基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一個；
290 位的氨基酸為 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個；
291位的氨基酸為Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln或Thr中的任一個；
292位的氨基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一個；
293位的氨基酸為 Pheλ Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
294位的氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
295位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、IIe、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
296位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr或Val中的任一個；
297位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
298位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
299位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
300位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一個；
301位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
302位的氨基酸為Ile ；
303位的氨基酸為Asp、Gly或Tyr中的任一個；
304位的氨基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一個；
305位的氨基酸為Glu、lie、Thr或Tyr中的任一個；311位的氨基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一個；
313位的氨基酸為Phe ；
315位的氨基酸為Leu;
317位的氨基酸為Glu或Gln ；
318 位的氨基酸為 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
320 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
322 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個;
323位的氨基酸為Ile ；
324位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
325位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
326位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
327位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
328位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
329位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
330位的氨基酸為 CyS、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
331位的氨基酸為 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個;
332位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、LyS、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
333位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一個；
334位的氨基酸為Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro或Thr中的任一個；
335 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
336位的氨基酸為Glu、Lys或Tyr中的任一個；
337位的氨基酸為Glu、His或Asn中的任一個；
339 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一個； 376位的氨基酸為Ala或Val中的任一個；
377位的氨基酸為Gly或Lys中的任一個；
378位的氨基酸為Asp ；379位的氨基酸為Asn ；
380位的氨基酸為Ala、Asn或Ser中的任一個；
382位的氨基酸為Ala或Ile中的任一個；
385位的氨基酸為Glu ；
392位的氨基酸為Thr ；
396位的氨基酸為Leu ；
421位的氨基酸為Lys ；
427位的氨基酸為Asn ；
428位的氨基酸為Phe或Leu中的任一個；
429位的氨基酸為Met ；
434位的氨基酸為Trp ；
436位的氨基酸為Ile ;或
440位的氨基酸為Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一個。另外，對所修飾的氨基酸的數(shù)量沒有特別限定，可以僅修飾一處氨基酸，也可以修飾兩處以上的氨基酸。作為兩處以上氨基酸的修飾的組合，例如可以列舉表1-1和表1-2中記載的組合。
[0250][表 1-1]

【權(quán)利要求】
1.抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，其特征在于:是與包含SEQID NO: 9、10和11所表示的重鏈可變區(qū)⑶R以及SEQ ID NO: 12、13和14所表示的輕鏈可變區(qū)⑶R的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體所結(jié)合的表位結(jié)合的抗體，該抗體對SEQ ID NO: 170所表示的猴上皮調(diào)節(jié)蛋白的KD值cEREG KD與對SEQ ID NO: 34所表示的人上皮調(diào)節(jié)蛋白的KD值hEREG KDiKcEREG KD/hEREG KD小于包含SEQ ID NO: 9、10和11所表示的重鏈可變區(qū)CDR以及SEQ ID NO: 12、13和14所表示的輕鏈可變區(qū)⑶R的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體的cEREG KD/hEREG KD。
2.權(quán)利要求1所述的抗體，其中，cEREGKD/hEREG KD小于40。
3.權(quán)利要求1所述的抗體，其中，cEREGKD/hEREG KD小于10。
4.權(quán)利要求1所述的抗體，其中 ，cEREGKD/hEREG KD小于6。
5.權(quán)利要求1所述的抗體，其中，cEREGKD/hEREG KD小于4。
6.權(quán)利要求1~5中任一項所述的抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)以及輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含:SEQ ID NO: 9所表示的重鏈CDRl、選自SEQ ID NO: 161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101 和 100 的重鏈 CDR2、以及選自 SEQ IDNO: 158、154、152、151、112、111、110和11的重鏈CDR3，所述輕鏈可變區(qū)包含:選自SEQ IDNO: 163、68、67和12的輕鏈CDR1、選自SEQ ID NO: 71、69和13的輕鏈CDR2、以及選自SEQID NO: 164、48、47 和 14 的輕鏈 CDR3。
7.權(quán)利要求1~5中任一項所述的抗體，該抗體包含選自SEQID NO: 150、149、148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116 和 115 的重鏈可變區(qū)、以及選自 SEQ ID NO: 141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57 和 29 的輕鏈可變區(qū)。
8.選自下述⑴~(3)的任一項的抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體: (1)抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，其包含選自SEQID NO: 150、149、148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、115、98、97、96、95、94、93、92、79、78、77、76、75、74、73、72、56、55、54、53、52、51、50、49和38的重鏈可變區(qū)； (2)抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，其包含選自SEQID NO: 141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57和29的輕鏈可變區(qū)；或 (3)抗上皮調(diào)節(jié)蛋白抗體，其包含選自SEQID NO: 150、149、148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、115、98、97、96、95、94、93、92、79、78、77、76、75、74、73、72、56、55、54、53、52、51、50、49 和 38 的重鏈可變區(qū)、以及選自 SEQ ID NO: 141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57和29的輕鏈可變區(qū)。
9.權(quán)利要求6~8中任一項所述的抗體，該抗體包含SEQID NO: 26的重鏈恒定區(qū)。
10.權(quán)利要求6~9中任一項所述的抗體，該抗體包含SEQID NO: 27的輕鏈恒定區(qū)。
11.權(quán)利要求1~10中任一項所述的抗體，該抗體具有中和活性。
12.權(quán)利要求1~11中任一項所述的抗體，該抗體具有細胞毒活性。
13.權(quán)利要求12所述的抗體，其中，細胞毒活性為CDC和/或ADCC。
14.權(quán)利要求1~12中任一項所述的抗體，該抗體連接有增殖抑制劑或細胞毒性物質(zhì)。
15.權(quán)利要求14所述的抗體，該抗體為低分子抗體。
16.權(quán)利要求12~15中任一項所述的抗體，其中，在SEQID NO: 26的重鏈恒定區(qū)中包含選自以EU編號表示的230位、240位、244位、245位、247位、262位、263位、266位、273位、275位、299位、302位、313位、323位、325位、328位和332位的氨基酸的至少一個取代。
17.載體，該載體包含編碼重鏈可變區(qū)的多核苷酸，所述重鏈可變區(qū)包含:SEQID NO:9 的重鏈 CDRl、選自 SEQ ID NO: 161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101 和 100 的重鏈 CDR2、以及選自 SEQ ID NO: 158、154、152、151、112、111、110 和11的重鏈CDR3。
18.權(quán)利要求17所述的載體，該載體包含編碼SEQID NO: 26的重鏈恒定區(qū)的多核苷酸。
19.載體，該載體包含編碼輕鏈可變區(qū)的多核苷酸，所述輕鏈可變區(qū)包含:選自SEQIDNO: 163、68、67和12的輕鏈CDR1、選自SEQ ID NO: 71、69和13的輕鏈CDR2、以及選自SEQID NO: 164、48、47 和 14 的輕鏈 CDR3。
20.權(quán)利要求19所述的載體，該載體包含編碼SEQID NO: 27的輕鏈恒定區(qū)的多核苷酸。
21.載體,該載體包含下述的多核苷酸: (1)編碼重鏈可變區(qū)的多核苷酸，所述重鏈可變區(qū)包含:SEQID NO: 9所表示的重鏈CDR1、選自 SEQ ID NO: 161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101 和 100 的重鏈 CDR2、以及選自 SEQ ID NO: 158、154、152、151、112、111、110 和 11 的重鏈CDR3 ;以及 (2)編碼輕鏈可變區(qū)的多核苷酸，所述輕鏈可變區(qū)包含:選自SEQID NO: 163、68、67和12的輕鏈CDR1、選自SEQ ID NO: 71、69和13的輕鏈CDR2、以及選自SEQ ID NO: 164、48、47和14的輕鏈CDR3。
22.載體,該載體包含下述的多核苷酸: (1)編碼重鏈可變區(qū)的多核苷酸，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO: 9所表示的重鏈CDR1、選自 SEQ ID NO: 161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101 和 100 的重鏈 CDR2、以及選自 SEQ ID NO: 158、154、152、151、112、111、110 和 11 的重鏈⑶R3;以及編碼SEQ ID NO: 26所表示的重鏈恒定區(qū)的多核苷酸；以及 (2)編碼輕鏈可變區(qū)的多核苷酸，所述輕鏈可變區(qū)包含選自SEQID NO: 163、68、67和12 的輕鏈 CDRl、選自 SEQ ID NO: 71、69 和 13 的輕鏈 CDR2、以及選自 SEQ ID NO: 164、48、47和14的輕鏈⑶R3 ;以及編碼SEQ ID NO: 27所表示的輕鏈恒定區(qū)的多核苷酸。
23.權(quán)利要求18或22所述的包含多核苷酸的載體，其中，在編碼SEQID NO: 26所表示的重鏈恒定區(qū)的多核苷酸中，包含編碼選自以EU編號表示的221位、222位、223位、224位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、236 位、237 位、238位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249 位、250 位、251 位、254位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266 位、267 位、268 位、269位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279 位、280 位、281 位、282位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293 位、294 位、295 位、296位、297 位、298 位 、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305 位、311 位、313 位、315位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327 位、328 位、329 位、330位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376 位、377 位、378 位、379位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429 位、434 位、436 位和 440位的氨基酸的至少一個取代的突變核苷酸。
24.宿主細胞，該宿主細胞包含權(quán)利要求17和19所述的載體、權(quán)利要求18和20所述的載體、權(quán)利要求21或22所述的載體。
25.宿主細胞，該宿主細胞包含權(quán)利要求23所述的載體。
26.權(quán)利要求25所述的宿主細胞，其中，上述宿主細胞為在糖鏈中添加巖藻糖的能力低的宿主細胞。
27.權(quán)利要求26所述的宿主細胞，其中，上述在糖鏈中添加巖藻糖的能力低的宿主細胞為選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖轉(zhuǎn)運蛋白、GMD(GDP-甘露糖4，6-脫水酶)、Fx (⑶P-酮-6-脫氧甘露糖3，5-差向異構(gòu)酶，4-還原酶)和GFPP (⑶P- β -L-巖藻糖焦磷酸化酶)的功能性蛋白的一種或一種以上缺損的宿主細胞。
28.權(quán)利要求25所述的宿主細胞，其中，上述宿主細胞為具有在糖鏈中形成二等分的N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)的能力的宿主細胞。
29.權(quán)利要求28所述的宿主細胞，其中，上述具有在糖鏈中形成二等分的N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)的能力的宿主細胞為具有β (1，4)_半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性、且包含載體的宿主細胞，所述載體包含編碼高爾基體定居多肽的功能性的高爾基體局部化結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。
30.權(quán)利要求29所述的宿主細胞，該宿主細胞為包含載體、并且包含編碼含有β (I, 4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的催化結(jié)構(gòu)域的融合多肽的多核苷酸的宿主細胞，所述載體包含編碼選自甘露糖苷酶II的局部化結(jié)構(gòu)域、β (I, 2)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶I的局部化結(jié)構(gòu)域、β (I, 2)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶II的局部化結(jié)構(gòu)域、甘露糖苷酶I的局部化結(jié)構(gòu)域和α 1-6核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的局部化結(jié)構(gòu)域的功能性的高爾基體局部化結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。
31.權(quán)利要求24~30中任一項所述的宿主細胞，其中，宿主細胞為選自CHO細胞、BHK細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、Ρ3Χ63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞、HEK293細胞或雜交瘤細胞的宿主細胞。
32.權(quán)利要求1~16中任一項所述的抗體的制備方法，該方法包括:從權(quán)利要求24~31中任一項所述的宿主細胞的培養(yǎng)液中回收。
33.抗體，該抗體是通過權(quán)利要求32所述的方法制備的。
34.權(quán)利要求33所述的抗體，該抗體連接有增殖抑制劑或細胞毒性物質(zhì)。
35.藥物組合物，該藥物組合物含有權(quán)利要求1~16或權(quán)利要求33~34中任一項所述的抗體作為有效成分。
36.癌癥治療藥或癌癥的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移抑制劑，其中含有權(quán)利要求1~16或權(quán)利要求33~34中任一項所述的抗體作為有效成分。
37.權(quán)利要求36所述的癌癥治療藥或癌癥的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移抑制劑，其中，癌癥為選自大腸癌、肺腺癌、胰癌、胃癌和腎癌的任一種癌。
38.權(quán)利要求37所述的癌癥治療藥或癌癥的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移抑制劑，其中，上述大腸癌為低分化大腸癌、中分化大腸癌、高分化大腸癌。
39.權(quán)利要求36~38中任一項所述的癌癥治療藥或癌癥的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移抑制劑，其中，上述癌癥治療藥的 給予對象為包含在分離的組織樣本中檢測到的上皮調(diào)節(jié)蛋白表達的癌細胞的對象。
【文檔編號】C12P21/08GK104136610SQ201280070788
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月28日
【發(fā)明者】白巖宙丈, 江崎圭子, 井川智之, 倉持太一, 前田敦彥, 丹波茂郎, 角田浩行, 橘達彥, 木下恭子, 鈴木雅實, 加藤淳彥, 竹入悅子, 橋本枝里, 渡邊祥規(guī) 申請人:中外制藥株式會社