食品中乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的檢測和定量的制作方法
【專利摘要】使用實時PCR快速檢測和/或定量乳酸菌的方法和試劑盒，其包括第一條引物、第二條引物和探針。引物和探針的每一種與乳酸菌的16SrRNA基因的不同區(qū)域互補。所述方法和試劑盒可以用于檢測和/或定量食物如酸奶中的乳酸菌（以支持產(chǎn)品標(biāo)記）和薩爾薩辣醬中的乳酸菌。
【專利說明】食品中乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的檢測和定量
[0001]優(yōu)先權(quán)
本申請要求享受于2011年6月27日提交的標(biāo)題為“食品中乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的檢測和定量”的美國臨時專利申請?zhí)?1/501，470的優(yōu)先權(quán)，其整體內(nèi)容通過引用并入本文。
[0002]背景
產(chǎn)生乳酸作為碳水化合物代謝的終產(chǎn)物的細(xì)菌群稱為乳酸菌。這些細(xì)菌可見于自然界中，如在腐爛的植物中，以及在某些食品，如酸奶中。它們包括例如屬:乳桿菌氣 iLactobaciIlus、、明串珠菌雇i (Zeuconostoc')、片球菌 M^Pediococcus\ 乳球菌屬(Xactococcus、、鏈球菌屬(Streptococcus')、氣球菌屬(Aerococcus)、肉桿菌屬(Carnobac teria? )、腸球菌屬(Mn terococcus )、酒球菌屬(Oenococcus )、芽胞乳桿菌屬{SporolactobaciIlus )、四聯(lián)球菌屬(Jerageiiococcus)、漫游球菌屬(Vagococcus)和魏斯氏菌屬(Zfei1SdJa)的細(xì)菌。
[0003]乳酸菌用于生產(chǎn)酸奶，其中所述細(xì)菌產(chǎn)生對產(chǎn)品的特有風(fēng)味有貢獻(xiàn)的乳酸。根據(jù)酸奶的生產(chǎn)方法，活的乳酸菌可以存在于最終的酸奶產(chǎn)品中。此類活細(xì)菌的存在經(jīng)常被認(rèn)為是酸奶中想要的特征。例如，酸奶中活乳酸菌的存在與某些健康和消化益處相關(guān)聯(lián)。乳酸菌將乳中的乳糖發(fā)酵，使得具有乳糖不耐受的個體更易于消化酸奶。消費者還將其他健康益處與酸奶中活的且有活性的乳酸菌培養(yǎng)物的存在相關(guān)聯(lián)。因而認(rèn)為在酸奶中存在活的乳酸菌是想要的并且被一些消費者所優(yōu)選。
[0004]National Yogurt Association (N.Y.A.)要求，在制造時酸奶具有高于某一濃度的有活性的乳酸菌培養(yǎng)物并且在儲存期結(jié)束時進(jìn)行的活性測試過程中細(xì)菌的總數(shù)增加一個對數(shù)，以用說明產(chǎn)品含有活的且有活性的培養(yǎng)物的封條來標(biāo)記。Food and DrugAssociation (F.D.A.)已經(jīng)提出了這樣的規(guī)定,其同樣要求在制造時和在儲存期結(jié)束時酸奶中存在某一最小量的細(xì)菌，以將產(chǎn)品標(biāo)記為包括活的且有活性的乳酸菌培養(yǎng)物。因而期望定量酸奶中存在的活的乳酸菌，以支持此類標(biāo)記。
[0005]在其他食品中，可能不期望存在高水平的乳酸菌。例如，食品中，如薩爾薩辣醬(salsa)產(chǎn)品和熟食類型的(deli style)肉片中乳酸菌的過度生長可以引起令人討厭的產(chǎn)品質(zhì)量下降并可以在食品上產(chǎn)生粘層。盡管此類細(xì)菌的過度生長對消費者無害，但它卻引不起食欲。因而，期望在將此類產(chǎn)品投放到市場之前或在此類產(chǎn)品成分進(jìn)一步加工之前定量乳酸菌。例如，如果所述產(chǎn)品成分，如用于制備薩爾薩辣醬的蔬菜具有令人難以接受的高水平的細(xì)菌，那么可以丟棄這些成分，從而不使用這些成分制備產(chǎn)品。這樣，在最終將具有令人難以接受的高水平細(xì)菌的產(chǎn)品生產(chǎn)和包裝中不會消耗額外投資。熟食類型的肉產(chǎn)品在制造過程中是經(jīng)過衛(wèi)生處理的并且在真空或改良的大氣中進(jìn)行包裝的；如果此類產(chǎn)品儲存于10°C以下，那么期望它們能夠維持高感官品質(zhì)2-4周。然而，由乳酸菌引起的酸敗有時候在儲存期內(nèi)發(fā)生，這需要生產(chǎn)者進(jìn)行召回。重要的是能夠檢測熟食肉產(chǎn)品中的乳酸菌并降低損失和產(chǎn)品召回。
[0006]傳統(tǒng)上，已經(jīng)使用選擇性培養(yǎng)基如酸化的MRS (de Man, Rogosa和Sharpe)瓊脂檢測并定量食品中的乳酸菌。然而，此類方法耗時，細(xì)菌生長需要若干天以達(dá)到細(xì)菌菌落在培養(yǎng)基平板上可見的足夠程度。這種方法稱為平板培養(yǎng)，盡管有用，但卻在獲得結(jié)果前需要大量的工作并且延遲。在這段時間里，食物成分或產(chǎn)品在進(jìn)行進(jìn)一步加工或投放到市場之前可能要先保持。因而，期望開發(fā)定量食品中的乳酸菌的快速方法，來降低加工和產(chǎn)品投放的延遲。
[0007]更快速的方法使用Bactometer來檢測乳酸菌。Bactometer可以用于檢測食品如沙拉醬和用于薩爾薩辣醬生產(chǎn)的食物成分如切碎的蔬菜中的乳桿菌(Iactobacilli)。方法可以包括產(chǎn)品在含有對乳桿菌具有選擇性的培養(yǎng)基的模塊孔中在30± 1°C下孵育24 土I小時。然后將所述模塊置于Bactometer系統(tǒng)中，并將菌落計數(shù)與檢測時間相關(guān)聯(lián)。如果在模塊孔中檢測到任何生長，那么可以將材料劃線到瓊脂平板上，其中在選擇性培養(yǎng)基上生長后可以進(jìn)一步鑒定所述菌落。然而，Bactometer通過測量由細(xì)菌生長引起的具體物理化學(xué)變化來定量細(xì)菌。因為直至生長出現(xiàn)才可以檢測細(xì)菌，所以該方法也是耗時的。此外，一些細(xì)菌盡管是活的，但卻不可以在所用的培養(yǎng)基中生長。這些細(xì)菌稱為活而非可培養(yǎng)(VBNC)細(xì)菌，并且不能通過Bactometer或培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測。因而，期望開發(fā)定量食品中的總?cè)樗峋目焖偾也灰蕾囉谂囵B(yǎng)的方法。
[0008]用于檢測細(xì)菌核酸的一種不依賴于培養(yǎng)的技術(shù)是聚合酶鏈反應(yīng)的方法，通常稱為PCR，其一般被認(rèn)為是用于檢測給定樣品中的核酸的最靈敏和最快速的方法。為了進(jìn)行PCR，需要與細(xì)菌的核酸互補的一對寡核苷酸序列作為引物。一條引物與目標(biāo)細(xì)菌核酸序列的5’端的細(xì)菌核酸互補，而另一條引物與目標(biāo)核酸序列的3’端的細(xì)菌核酸互補。對于實時PCR(RT-PCR)的技術(shù)，使用這樣的探針，其也與兩條引物之間的目標(biāo)細(xì)菌核酸序列互補，允許檢測和定量目標(biāo)材料。
[0009]盡管已知實時PCR的技術(shù)可以用于檢測和定量目標(biāo)核酸序列，但是它們依賴于鑒定獨特序列，以充當(dāng)引物和探針，并且這種鑒定可能是有挑戰(zhàn)性的。此類序列必須不僅對目標(biāo)材料獨特，而且還不能與其自身結(jié)合來形成引物二聚體。所述探針還應(yīng)該滿足設(shè)計指導(dǎo)方針，包括在探針的5’端不具有鳥嘌呤殘基；具有適當(dāng)?shù)腡m值(解鏈溫度);盡可能地短，但至少具有13個核苷酸；不具有相同核苷酸串(runs of identical nucleotides);及其他特征。因而，鑒定滿足對于提高實時PCR的成功可能性所必需的這些指導(dǎo)方針的第一條和第二條引物序列以及探針序列可能是困難的。
[0010]概述
本發(fā)明的實施方案允許使用實時PCR的技術(shù)快速且特異性檢測和定量乳酸菌。
[0011]實施方案還包括用于檢測乳酸菌的試劑盒，其包括第一條引物序列、第二條引物序列，和探針序列，其中每條序列與乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的16S rRNA基因的不同區(qū)域互補。例如，在一些實施方案中，第一條和第二條引物序列和探針序列的每一種與SEQ.1D.N0.4的不同區(qū)域互補。
[0012]在一些實施方案中，用于PCR檢測乳酸菌的試劑盒包括:包含SEQ.1D.N0.1的第一條引物、包含SEQ.1D.N0.2的第二條引物，和包含SEQ.1D.N0.3的探針。
[0013]在一些實施方案中，探針包括熒光團(tuán)，如羧基熒光素。在一些實施方案中，試劑盒還包括膜不透性染料。
[0014] 在其他實施方案中，本發(fā)明包括檢測樣品中乳酸菌的方法，其包括將樣品稀釋，將樣品離心以產(chǎn)生沉淀，使用沉淀進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取，將所提取的細(xì)菌DNA與包含以下的PCR試劑組合:包含SEQ.1D.N0.1的第一條引物、包含SEQ.1D.N0.2的第二條引物、包含SEQ.1D.N0.3的探針、DNA聚合酶和脫氧核苷酸三磷酸，使組合的提取DNA與PCR試劑通過熱循環(huán)儀循環(huán)，并獲得對應(yīng)于通過熱循環(huán)儀檢測到的信號的數(shù)據(jù)。所述方法還可以包括將對應(yīng)于所檢測到的信號的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，以定量樣品中存在的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的量。在一些實施方案中，所述樣品是食物樣品，如酸奶。在一些實施方案中，探針包括熒光團(tuán)，如羧基熒光素。
[0015]附圖
圖1是根據(jù)本發(fā)明的實施方案檢測乳酸菌的方法的流程圖；
圖2是酸奶產(chǎn)品的實時PCR結(jié)果；
圖3是酸奶產(chǎn)品中乳酸菌相對于使用圖2中所示的PCR結(jié)果產(chǎn)生的Ct的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖4a是薩爾薩辣醬蔬菜的實時PCR結(jié)果；
圖4b是薩爾薩辣醬蔬菜的實時PCR結(jié)果；
圖4c是薩爾薩辣醬蔬菜的實時PCR結(jié)果；
圖5a是細(xì)菌濃度相對于圖4a所示的薩爾薩辣醬蔬菜的Ct的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖5b是細(xì)菌濃度相對于使用圖4b所示的PCR結(jié)果的薩爾薩辣醬蔬菜的Ct的標(biāo)準(zhǔn)曲線；和
圖5c是細(xì)菌濃度相對于使用圖4c所示的PCR結(jié)果的薩爾薩辣醬蔬菜的Ct的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0016]詳細(xì)描述
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以使用實時PCR鑒定乳酸菌。這些乳酸菌可以使用對這些細(xì)菌特異的一對引物序列使用PCR技術(shù)進(jìn)行選擇性地擴增，然后可以使用也對這些細(xì)菌特異的探針進(jìn)行鑒定。本發(fā)明的實施方案可用于快速檢測和定量食品中的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌。示例性食品例如包括酸奶產(chǎn)品、蔬菜如用于薩爾薩辣醬生產(chǎn)的蔬菜和腌黃瓜、熟食類型的肉產(chǎn)品、沙拉醬、番茄醬、乳制品如乳酪、魚產(chǎn)品如鯡魚、酒、啤酒、檸檬水、果汁和花蜜(nectars)。本發(fā)明的實施方案還可以用于環(huán)境測試，如測試食品生產(chǎn)設(shè)備。
[0017]在酸奶中發(fā)現(xiàn)為活的且有活性的培養(yǎng)物的乳酸菌包括嗜熱鏈球菌{Streptococcus thermophiIus)> 德氏乳桿菌保加利亞亞砍(XactobaciIIusdelbrueckii subspecies buIgaricuS、和德氏乳桿菌乳酸亞種{Lactobacillusdelbruickii subspecies lactis)0當(dāng)實時定量PCR的技術(shù)應(yīng)用于酸奶樣品時,可以快速并準(zhǔn)確地確定這些細(xì)菌的菌落形成單位的濃度(如每克酸奶的CFU)。如此，本發(fā)明的方法可以用于在特定時間，如在生產(chǎn)完成時(以支持標(biāo)記所述酸奶產(chǎn)品含有活的且有活性的培養(yǎng)物)或在儲存期結(jié)束時，定量酸奶產(chǎn)品中存在的活乳酸菌的數(shù)量。
[0018]或者，本發(fā)明的實施方案可以用于定量蔬菜，如用于生產(chǎn)薩爾薩辣醬或其他食品的蔬菜中存在的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的水平。例如在薩爾薩辣醬生產(chǎn)過程中，首先將蔬菜切碎，然后與糖和鹽及其他成分混合，然后置于容器如罐或玻璃瓶中，并且在最后進(jìn)行加熱，以進(jìn)行巴氏滅菌來殺死潛在的病原體。這些蔬菜可以包括番茄、洋蔥、辣椒、玉米、芫荽等。監(jiān)測薩爾薩辣醬成分質(zhì)量的一種方式是在巴氏滅菌之前定量蔬菜中存在的乳酸菌。如果蔬菜具有大于閾值量的乳酸菌，那么在加工過程中可能不會殺死足夠量的乳酸菌，從而終產(chǎn)品可能會被乳酸菌破壞，降低儲存期和產(chǎn)品質(zhì)量。此類蔬菜可以丟棄并且不可以用于薩爾薩辣醬生產(chǎn)。相反，如果蔬菜含有小于閾值數(shù)的乳酸菌，那么可認(rèn)為進(jìn)一步的加工步驟足以使最終的薩爾薩辣醬產(chǎn)品在正常儲存期內(nèi)不被乳酸菌破壞。在一些實施方案中，用于薩爾薩辣醬生產(chǎn)的切碎的蔬菜中的閾值是IO5 Cfu/克，而在其他實施方案中，閾值是IO6 Cfu/克。
[0019]在其他實施方案中，方法和試劑盒用于檢測和定量沙拉醬中的乳酸菌?；镜臋z測步驟與蔬菜的檢測定量相似，包括樣品制備、DNA分離和RT-PCR反應(yīng)。
[0020]在仍其他實施方案中，所述方法和試劑盒用于檢測和定量熟食類型的肉中的乳酸菌?？梢杂糜诒景l(fā)明實施方案的熟食類型的肉的實例包括火雞、火腿、烤牛肉、意大利臘腸、雞肉等。為了避免這種情況，可以根據(jù)本發(fā)明的實施方案測試熟食肉，以檢測和定量如最終熟食肉產(chǎn)品中的乳酸菌。
[0021]本發(fā)明的實施方案使用一對寡核苷酸引物和探針，設(shè)計其每一種以特異性靶向乳酸菌。引物對包括與位于目標(biāo)核酸序列的5’端的序列互補的正向或上游引物和與位于目標(biāo)核酸目標(biāo)的序列的3’端的序列互補的反向或下游引物。所述目標(biāo)核酸序列對乳酸菌是獨特的，并且允許將所檢測的細(xì)菌特異地鑒定為乳酸菌。此外，引物對和探針對目標(biāo)核酸序列是特異的，從而它們不結(jié)合任何其他細(xì)菌的核酸。
[0022]用于本發(fā)明實施方案的引物包括下文所示的SEQ ID Nos.1和2。上文示為SEQID.N0.1的引物是正向或上游引物。鑒定為SEQ ID.N0.2的引物是反向或下游引物。用于本發(fā)明實施方案的探針在下文示為SEQ ID.N0.3。在一些實施方案中，鑒定為SEQ ID.N0.3的探針是在其5’端具有熒光團(tuán)并且在其3’端具有猝滅劑的TaqMan?探針。
【權(quán)利要求】
1.用于PCR檢測乳酸菌的試劑盒，其包含: 包含SEQ.1D.N0.1的第一條引物； 包含SEQ.1D.N0.2的第二條引物；和 包含SEQ.1D.N0.3的探針。
2.權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述探針進(jìn)一步包含熒光團(tuán)。
3.權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述熒光團(tuán)包含羧基熒光素。
4.權(quán)利要求2的試劑盒，其進(jìn)一步包含膜不透性染料。
5.用于檢測乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的試劑盒，其包含: 與SEQ.1D.N0.4的第一個區(qū)域互補的第一條引物； 與SEQ.1D.N0.4的第二個區(qū)域互補的第二條引物； 與SEQ.1D.N0.4的第三個區(qū)域互補的探針。
6.權(quán)利要求5的試劑盒，其中所述第一條引物包含SEQ.1D.N0.1。
7.權(quán)利要求5的試劑盒，其中所述第二條引物包含SEQ.1D.N0.2。
8.權(quán)利要求5的試劑盒，其中所述探針包含SEQ.1D.N0.3。
9.權(quán)利要求8的試劑盒，其中所述探針進(jìn)一步包含熒光團(tuán)。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其中所述熒光團(tuán)包含羧基熒光素。
11.用于PCR檢測乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的試劑盒，其包含: 與乳酸菌的16S rRNA基因的第一個區(qū)域互補的第一條引物； 與乳酸菌的16S rRNA基因的第二個區(qū)域互補的第二條引物； 與乳酸菌的16S rRNA基因的第三個區(qū)域互補并且標(biāo)記有熒光團(tuán)的探針。
12.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述第一條引物包含SEQ.1D.N0.1。
13.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述第二條引物包含SEQ.1D.N0.2。
14.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述探針包含SEQ.1D.N0.3。
15.權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述探針進(jìn)一步包含熒光團(tuán)。
16.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述熒光團(tuán)包含羧基熒光素。
17.檢測樣品中乳酸菌的方法，其包括: 制備所述樣品； 使用制備的樣品進(jìn)行細(xì)菌DNA提取，以獲得提取的細(xì)菌DNA ； 將所述提取的細(xì)菌DNA與PCR試劑組合，所述PCR試劑包含含有SEQ.1D.N0.1的第一條引物、含有SEQ.1D.N0.2的第二條引物、含有SEQ.1D.N0.3的探針、DNA聚合酶和脫氧核苷酸三磷酸； 使組合后的提取的DNA與PCR試劑通過熱循環(huán)儀循環(huán)；和 獲得對應(yīng)于通過所述熱循環(huán)儀檢測到的信號的數(shù)據(jù)。
18.權(quán)利要求17的方法，其進(jìn)一步包括將所述對應(yīng)于檢測到的信號的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，以定量所述樣品中存在的乳酸產(chǎn)生細(xì)菌的量。
19.權(quán)利要求18的方法，其中食物樣品包含酸奶。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述探針進(jìn)一步包含熒光團(tuán)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述熒光團(tuán)包含羧基熒光素。
【文檔編號】C12Q1/68GK103930564SQ201280041709
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月27日
【發(fā)明者】Y.胡, M.C.墨菲, K.斯蒂芬斯 申請人:通用工廠公司