專利名稱：一種櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
截至目前國內(nèi)外尚無人建立海洋雙殼類細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，將范圍擴(kuò)展至軟體動物門類，目前僅有一個細(xì)胞系成功建立，來自一種淡水蝸牛。細(xì)胞的取材體外培養(yǎng)的細(xì)胞多取材于動物胚胎、成年動物組織、人體手術(shù)活體材 料，幼蟲細(xì)胞是兼具胚胎細(xì)胞和幼蟲期特有細(xì)胞性質(zhì)的高分裂能力的細(xì)胞，是一類具有體外培養(yǎng)前景的細(xì)胞來源。奸夷扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞的體外培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)Primary cell culturefromembryos of the Japanese seallop Mizuchopecten yessoensis (Bivalvia)(199ICytotechnology)貽貝面盤幼蟲細(xì)胞的體外培養(yǎng)。(備注面盤幼蟲是擔(dān)輪幼蟲下一個發(fā)育階段。)參考文獻(xiàn)！Isolation and partial characterization of myogenicceIlsfrom mussellarvae in vitro (2000Tissue Cell.)紫貽貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞的體外培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)Comparative CharacteristicofMytilus Muscle Cells Developed In Vitro and In Vivo. (2003Journalof ExperimentalZoology.)油黑菜蛤擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞的體外培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)=Muscle andneuronaldifferentiation in primary cell culture of larval Mytilustrossulus(Mollusca Bivalvia) (2010Cell Tissue Research)幼蟲細(xì)胞的解離方式上述幼蟲細(xì)胞均采用無鈣水浸泡后再經(jīng)O. 25%或O. 125%膠原酶解離的方式獲得單個的細(xì)胞。幼蟲細(xì)胞的除菌方法蝦夷扇貝，紫外線消毒海水并添加500U/ml青霉素和40 μ g/ml慶大霉素，培養(yǎng)基中添加40mg/l慶大霉素；油黑菜蛤，Percoll密度梯度離心法。細(xì)胞傳代方式目前尚無關(guān)于幼蟲細(xì)胞的傳代方法的報道，傳代培養(yǎng)的核心工作有兩方面，一是分割培養(yǎng)物，二是再次接種。把貼壁依賴型細(xì)胞從培養(yǎng)基質(zhì)上解離下來的方法主要有1).胰蛋白酶溶液消化；2).對于貼壁不牢的細(xì)胞可采用機(jī)械的振蕩法。幼蟲培養(yǎng)基的優(yōu)化奸夷扇貝幼蟲細(xì)胞培養(yǎng)基L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基；添加如下鹽離子使?jié)B透壓達(dá)到1100毫滲透摩爾濃度NaCl(18. 05克/升)，KCI (O. 29克/升)，CaCl2 · 2H20 (I. 205 克 / 升)，MgCl2 · 6H20 (5. 481 克 / 升)，MgSO4 · 7H20 (4. 28 克 / 升)。另添加如下成分?；撬?25暈克/升)，葡萄糖(50暈克/升)，谷氨酰胺(100暈克/升)，胎牛血清(2%體積比)，慶大霉素(40毫克/升)。擔(dān)油黑菜蛤幼蟲細(xì)胞培養(yǎng)基L_15基礎(chǔ)培養(yǎng)基；胎牛血清(2%體積比)，胰島素(50暈克/升)，維生素E (I. 75暈克/升)。
現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)是無法實(shí)現(xiàn)貝類細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)貝類細(xì)胞的傳代培養(yǎng)的問題。本發(fā)明的目的在于提供一種柿孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法包括以下步驟 將單個櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞均勻分布在含有O. 5毫升櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用培養(yǎng)液的直徑為35毫米細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并放置到20-23°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16-24小時后得貼壁的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞；根據(jù)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基的顏色變化，每3-7天替換櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞專用培養(yǎng)基2毫升，當(dāng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞形成克隆時，挑取出來實(shí)現(xiàn)早期傳代；當(dāng)傳代后的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面后，采用機(jī)械傳代法完成櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。進(jìn)一步，櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用高抗生素培養(yǎng)液中添加有2500-25000單位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升鏈霉素。進(jìn)一步，所述櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基由L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基、5%胎牛血清、I %櫛孔扇貝血清、2毫摩爾谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素、100微克/毫升鏈霉素構(gòu)成。進(jìn)一步，步驟五，當(dāng)傳代后的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面后，采用機(jī)械傳代法完成櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)的實(shí)現(xiàn)方法為當(dāng)傳代后的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面后，用移液管輕輕吹打或用細(xì)胞刮刀刮取獲得解離的單個細(xì)胞，在1000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心5分鐘，再平均分散在兩個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中完成櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。進(jìn)一步，體外培養(yǎng)的細(xì)胞取自櫛孔扇貝晚期胚胎、擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲的細(xì)胞，同時該培養(yǎng)方法也可應(yīng)用在其他種類貝類生物胚胎和幼蟲細(xì)胞的培養(yǎng)中。進(jìn)一步，櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞時，在4°C下培養(yǎng)1-2天，原代培養(yǎng)的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞可存活且可抑制細(xì)菌污染，再轉(zhuǎn)到17-25°C培養(yǎng)箱中，細(xì)胞也可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。進(jìn)一步，在櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞培養(yǎng)早期，使用櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用高抗生素培養(yǎng)液，青霉素濃度為2500單位/毫升至25000單位/毫升，鏈霉素濃度為2500微克/暈升至25000微克/暈升鏈霉素。(與前一段重復(fù))進(jìn)一步，所述櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基中添加物的最寬范圍胎牛血清添加量2% -20%，扇貝血清1% -10%，青霉素100-500單位/毫升、鏈霉素100-500微克/毫升。本發(fā)明提供的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，將櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲用正壓濾器過濾的無菌海水在500目篩絹上流水沖洗半小時以上，去除表面的微生物；使用櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞專用無鈣消毒海水滲緩沖液浸泡櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲30分鐘以上，采用機(jī)械解離法解離得到分散的單個的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞；將得到的單個櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞均勻分布在含有O. 5毫升櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用高抗生素培養(yǎng)液的直徑為35毫米細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并放置到20-23°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16-24小時后得貼壁的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞；根據(jù)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基的顏色變化，每3-7天替換櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞專用培養(yǎng)基2毫升，當(dāng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞形成克隆時，挑取出來實(shí)現(xiàn)早期傳代；當(dāng)傳代后的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面后，采用機(jī)械傳代法完成櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，本發(fā)明建立了一種穩(wěn)定的海洋無脊椎動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的體外增殖和傳代培養(yǎng)，是首個海洋貝類的連續(xù)細(xì)胞系，對除櫛孔扇貝之外的其他貝類細(xì)胞建系具有重要的指導(dǎo)意義。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例提供的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)方法的實(shí)現(xiàn)流程圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定發(fā)明。圖I示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)方法的實(shí)現(xiàn)流程。該培養(yǎng)方法包括以下步驟步驟S101，將櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲用正壓濾器過濾的無菌海水在500目篩絹上流水沖洗半小時以上，去除表面的微生物；步驟S102，使用櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞專用無鈣海水等滲緩沖液浸泡櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲30分鐘以上，采用機(jī)械解離法解離得到分散的單個的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞；步驟S103，將步驟S102得到的單個櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞均勻分布在含有O. 5毫升櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用高抗生素培養(yǎng)液的直徑為35毫米細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并放置到20-23°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16-24小時后得貼壁的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞；步驟S104，根據(jù)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基的顏色變化，每3-7天替換櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞專用培養(yǎng)基2毫升，當(dāng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞形成克隆時，挑取出來實(shí)現(xiàn)早期傳代；步驟S105，當(dāng)傳代后的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面后，采用機(jī)械傳代法完成櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。在本發(fā)明實(shí)施例中，在步驟S102中，櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞專用無鈣海水等滲緩沖液為含有2500單位/毫升青霉素、2500微克/毫升鏈霉素的高壓滅菌過濾海水的高滲透壓磷酸鹽緩沖溶液。在本發(fā)明實(shí)施例中，在步驟S102中，機(jī)械解離法的實(shí)現(xiàn)方法為手動搖晃含有櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲的容器，并用移液管反復(fù)吹打含有櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲的液體I分鐘以上，以1000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘后，收集得到解離的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞。在本發(fā)明實(shí)施例中，櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用高抗生素培養(yǎng)液中添加有2500-25000單位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升鏈霉素。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基由L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基、5%胎牛血清、I %櫛孔扇貝血清、2毫摩爾谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素、100微克/暈升鏈霉素構(gòu)成。在本發(fā)明實(shí)施例中，步驟S105，當(dāng)傳代后的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面后，采用機(jī)械傳代法完成櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)的實(shí)現(xiàn)方法為當(dāng)傳代后的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面后，用移液管輕 輕吹打或用細(xì)胞刮刀刮取獲得解離的單個細(xì)胞，在1000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心5分鐘，再平均分散在兩個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中完成櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。在本發(fā)明實(shí)施例中，體外培養(yǎng)的細(xì)胞取自櫛孔扇貝晚期胚胎、擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲的細(xì)胞，同時該培養(yǎng)方法也可應(yīng)用在其他種類貝類生物胚胎和幼蟲細(xì)胞的培養(yǎng)中。在本發(fā)明實(shí)施例中，櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞時，在4°C下培養(yǎng)1-2天，原代培養(yǎng)的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞可存活且可抑制細(xì)菌污染，再轉(zhuǎn)到17_25°C培養(yǎng)箱中，細(xì)胞也可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。在本發(fā)明實(shí)施例中，在櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞培養(yǎng)早期，使用櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用高抗生素培養(yǎng)液，青霉素濃度為2500單位/毫升至25000單位/毫升，鏈霉素濃度為2500微克/毫升至25000微克/毫升鏈霉素。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基中添加物的最寬范圍胎牛血清添加量2% -20%，扇貝血清1% -10%，青霉素100-500單位/毫升、鏈霉素100-500微克/毫升。下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。本發(fā)明的技術(shù)方案首先將櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲用正壓濾器過濾的無菌海水在500目篩絹上流水沖洗半小時以上，去除表面的微生物；配制櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞專用無鈣海水等滲緩沖液，配方是含有2500單位/毫升青霉素、2500微克/毫升鏈霉素的高壓滅菌過濾海水的高滲透壓磷酸鹽緩沖溶液；使用上述櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞專用無鈣海水等滲緩沖液浸泡櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲30分鐘以上，僅僅采用機(jī)械解離法即手動搖晃含有櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲的容器并用移液管反復(fù)吹打含有櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲的液體I分鐘以上，以1000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘后收集得到解離的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞，均勻分布在含有O. 5毫升櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用高抗生素培養(yǎng)液(添加2500-25000單位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升鏈霉素)的直徑為35毫米的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，再置于20-23°C的生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，16-24小時后得到貼壁的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基的顏色變化，每3-7天替換櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞專用培養(yǎng)基2毫升，以維持櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞正常生長。當(dāng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞形成克隆時，將其挑取出來實(shí)現(xiàn)早期傳代。當(dāng)傳代后的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面后，僅使用機(jī)械傳代法即用移液管輕輕吹打或用細(xì)胞刮刀刮取得解離的單個細(xì)胞，在1000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心5分鐘，再平均分散在兩個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中完成櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。所述的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基，其中含有L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基、5%胎牛血清、I %櫛孔扇貝血清、2毫摩爾谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素、100微克/毫升鏈霉素。所述的機(jī)械解離法為手動劇烈晃動盛有櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲個體的容器，以獲得分散的單個細(xì)胞的方法。所述的機(jī)械傳代法為通過移液管的吹打或細(xì)胞刮刀使體外培養(yǎng)的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞無損傷地從培養(yǎng)基質(zhì)上脫離的方法。櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲專用細(xì)胞培養(yǎng)基中添加維持細(xì)胞代謝需求的少量營養(yǎng)因子，SP實(shí)現(xiàn)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的良好生長狀態(tài)，隨著細(xì)胞的分裂能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，該方法操作簡單且成本低廉。
采用櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲專用無鈣海水等滲緩沖液浸泡與機(jī)械法結(jié)合的方式不經(jīng)任何酶類的消化實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的完全解離，該方法對櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的損傷小，成本低效率高，具有可重復(fù)性。細(xì)胞取材取自櫛孔扇貝晚期胚胎、擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲的細(xì)胞均可在體外實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定培養(yǎng)。理論上，該培養(yǎng)方法是可以應(yīng)用在其他種類貝類生物胚胎和幼蟲細(xì)胞的培養(yǎng)中。細(xì)胞培養(yǎng)溫度在4°C下培養(yǎng)1-2天，原代培養(yǎng)的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞可存活且可抑制細(xì)菌污染。隨后再轉(zhuǎn)到17_25°C培養(yǎng)箱中，細(xì)胞也可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定傳代培養(yǎng)?？股氐氖褂迷诩?xì)胞培養(yǎng)早期使用櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用高抗生素培養(yǎng)液，其濃度在2500單位/暈升青霉素、2500微克/暈升鏈霉素至25000單位/暈升青霉素、25000微克/毫升鏈霉素均可抑制污染且得到穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系。培養(yǎng)基添加物的最寬范圍胎牛血清添加量2% -20% ;扇貝血清1% -10% ;青霉素100-500單位/毫升、鏈霉素100-500微克/毫升。機(jī)械法方法進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)由于細(xì)胞貼壁能力較低，除了用細(xì)胞刮刀和移液管吹打法，一切可以將細(xì)胞機(jī)械搖晃下的辦法均可行。本發(fā)明實(shí)施例提供的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，將櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲用正壓濾器過濾的無菌海水在500目篩絹上流水沖洗半小時以上，去除表面的微生物；使用櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞專用無鈣海水等滲緩沖液浸泡櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲30分鐘以上，采用機(jī)械解離法解離得到分散的單個的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞；將得到的單個櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞均勻分布在含有O. 5毫升櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用高抗生素培養(yǎng)液的直徑為35毫米細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并放置到20-23°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16-24小時后得貼壁的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞；根據(jù)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基的顏色變化，每3-7天替換櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞專用培養(yǎng)基2毫升，當(dāng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞形成克隆時，挑取出來實(shí)現(xiàn)早期傳代；當(dāng)傳代后的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面后，采用機(jī)械傳代法完成櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，本發(fā)明建立了一種穩(wěn)定的海洋無脊椎動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的體外增殖和傳代培養(yǎng)，是首個海洋貝類的連續(xù)細(xì)胞系，對除櫛孔扇貝之外的其他貝類細(xì)胞建系具有重要的指導(dǎo)意義。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi) 。
權(quán)利要求
1.一種柿孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)方法,其特征在于，該培養(yǎng)方法包括以下步驟 將單個櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞均勻分布在含有O. 5毫升櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用高抗生素培養(yǎng)液的直徑為35毫米細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并放置到20-23°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16-24小時后得貼壁的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞； 根據(jù)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基的顏色變化，每3-7天替換櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞專用培養(yǎng)基2毫升，當(dāng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞形成克隆時，挑取出來實(shí)現(xiàn)早期傳代； 當(dāng)傳代后的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面后，采用機(jī)械傳代法完成櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用高抗生素培養(yǎng)液中添加有2500-25000單位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升鏈霉素。
3.如權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基由L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基、5%胎牛血清、I %櫛孔扇貝血清、2毫摩爾谷氨酰胺、100單位/暈升青霉素、100微克/暈升鏈霉素構(gòu)成。
4.如權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟五，當(dāng)傳代后的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面后，采用機(jī)械傳代法完成櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)的實(shí)現(xiàn)方法為 當(dāng)傳代后的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面后，用移液管輕輕吹打或用細(xì)胞刮刀刮取獲得解離的單個細(xì)胞，在1000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心5分鐘，再平均分散在兩個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中完成櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。
5.如權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，體外培養(yǎng)的細(xì)胞取自櫛孔扇貝晚期胚胎、擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲的細(xì)胞，同時該培養(yǎng)方法也可應(yīng)用在其他種類貝類生物胚胎和幼蟲細(xì)胞的培養(yǎng)中。
6.如權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞時，在4°C下培養(yǎng)1-2天，原代培養(yǎng)的櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞可存活且可抑制細(xì)菌污染，再轉(zhuǎn)到17-25°C培養(yǎng)箱中，細(xì)胞也可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。
7.如權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，在櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞培養(yǎng)早期，使用聞濃度的青鏈霉素雙抗液，青霉素濃度為2500單位/暈升至25000單位/暈升,鏈霉素濃度為2500微克/毫升至25000微克/毫升鏈霉素。
8.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基中添加物的最寬范圍胎牛血清添加量2% -20%，扇貝血清1% -10%，青霉素100-500單位/毫升、鏈霉素100-500微克/毫升。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲專用細(xì)胞培養(yǎng)基中添加維持細(xì)胞代謝需求的少量營養(yǎng)因子，即實(shí)現(xiàn)了櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的良好生長狀態(tài)，隨著細(xì)胞的分裂能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，操作簡單且成本低廉，同時采用櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲專用無鈣海水等滲緩沖液浸泡與機(jī)械法結(jié)合的方式實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞的完全解離，無需經(jīng)任何酶類的消化，該培養(yǎng)方法對櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的損傷小，成本低效率高，具有可重復(fù)性，本發(fā)明建立了一種穩(wěn)定的海洋無脊椎動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的體外增殖和傳代培養(yǎng)，是首個海洋貝類的連續(xù)細(xì)胞系，對除櫛孔扇貝之外的其他貝類細(xì)胞建系具有重要的指導(dǎo)意義。
文檔編號C12N5/07GK102965331SQ20121048014
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者張志峰, 晏萌, 季愛昌, 畢穎 申請人:中國海洋大學(xué)