專利名稱：腸出血性大腸桿菌O157:H7多價fliC-hcpA-tir-eae重組菌及疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腸出血性大腸桿菌0157:H7多價融合型重組菌、重組蛋白制備方法及亞單位疫苗，屬于生物制藥領(lǐng)域。背景技術(shù)：
腸出血性大腸桿菌(enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC)是重要的食源性人獸共患病原，0157:H7是其重要的血清型。近20余年來，EHEC 0157:H7引發(fā)的食物中毒在世界各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。EHEC 0157 :H7感染患者和無癥狀攜帶者可作為傳染源。在動物宿主范圍非常廣泛，其中反芻動物帶菌率較高。相對來講，動物作為傳 染源要比人類更為重要，它往往是動物源食品污染的根源。人類感染可引起嚴重的胃腸道和循環(huán)系統(tǒng)疾病，如出血性結(jié)腸炎(hemorrhagicColitis, HC)、溶血尿毒綜合征(Haemolytic uraemic syndrome, HUS)等,個別患者可因急性和慢性腎功能衰竭而死亡。動物感染一般不引發(fā)明顯的臨床癥狀，但能夠長期甚至終生攜帶。EHEC動物宿主范圍非常廣泛，其中反芻動物帶菌率較高。因此，防控EHEC 0157:H7的重中之重是減少和控制動物帶菌和排菌。目前，對0157:H7的感染缺乏有效的防治方法，只能給予對癥治療和適當?shù)目咕委?。由?157:H7的暴發(fā)流行特點和治療上的困難，疫苗研究就顯得極為緊迫。有效的疫苗研制是預防和治療0157:H7感染最簡單、經(jīng)濟和快捷的手段。選取與EHEC 0157:H7粘附和定植密切相關(guān)的鞭毛(H7)、菌毛(HCP)和緊密素(Intimin)和轉(zhuǎn)位緊密素受體(Tir)四個基因分別設計特異性引物對，擴增相應基因片段，并依次串聯(lián)，構(gòu)建重組菌，獲得重組蛋白，制備亞單位疫苗，用于預防EHEC 0157:H7在動物體內(nèi)的定植。三、發(fā)現(xiàn)內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明目的在于構(gòu)建EHEC 0157:H7多價融合型重組菌，表達重組蛋白，進而研制亞單位疫苗。本發(fā)明在抗原選擇上直接針對EHEC 0157:H7重要的粘附因子，強調(diào)多個粘附因子的聯(lián)合應用以產(chǎn)生最大的免疫保護作用，降低動物帶菌率，進而減少人類感染EHEC的機會，保障人類身心健康。技術(shù)方案本發(fā)明的具體實施方案如下
腸出血性大腸桿菌0157:H7 (EHEC 0157:H7)多價融合型重組菌、重組蛋白制備方法及亞單位疫苗，其特征在于，所說的多價重組菌和重組蛋白為BL21(pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)。多價重組菌和重組蛋白的制備方法包括
(I)腸出血性大腸桿菌0157:H7免疫多價融合型重組菌，其構(gòu)建方法為
根據(jù)GenBank中0157:H7 EDL933的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分別設計引物，并分別在上下游引物兩端加入酶切位點(下劃線部分)，在AcW基因后和me基因前分別加入長度為24個核苷酸的連接片段，引物序列如下
fliC~ I 5-ggggagctcactattaccaacaaa~3Sac IfHC~V2 5-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3Xhol I
AcpA-Pl 5-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3Xhol I
hcpA~ 2 5-tttgaattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3 EcoR Itir~ l 5-gatgaattcgagccggatagccca-3EcoR I
tir~ 2 5~ttagtcgacagcccccgatgaaac~3Sal I
eae~V\ 5-ttagtcgacgctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc~3 Sal I eae~ 2 :5_ ggctctagattattctacacaaaccgc-3Xba I
0157 :H7過夜培養(yǎng)物，ImL/管，12000r離心2分鐘，棄上清，收集菌體重懸于1/5體積雙蒸水，煮10min，4°C 12000r離心10分鐘，吸取上清凍存_20°C，用于PCR擴增用；
擴增片段的上下游引物分別加有fee I和通I酶切位點，擴增eae片段的上下游引物分別加有免7 1和油<3 I酶切位點，PCR反應條件均為95°C預變性5分鐘，94°CI分鐘，55°C 30秒，72 0C I分鐘，30個循環(huán)，72°C再延伸10分鐘；
擴增AcW片段的上下游分別引物加有通I和及I酶切位點，擴增Kr片段的上下游引物分別加有I和I酶切位點，PCR反應條件均為95°C預變性5分鐘，94°CI分鐘，56 V 30秒，72 °C 30秒，30個循環(huán)，72 °C再延伸6分鐘。fIiC-VI 和 fIiC-Vl、hcpA-PI 和 IwpA-P2、tir~ I 和 h>_P2、eae_PI 和 eae_P2 擴增片段長度分別為946bp、423bp、309bp和81 Ibp。將擴增的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量比I. 2%的瓊脂糖電泳，切膠稱重，加入3倍體積DE-A緩沖液后65°C作用10分鐘，待膠全部融化后，再加入DE-A緩沖液的0. 5體積的DE-B緩沖液，顛倒混勻后，將融化的液體轉(zhuǎn)移于微型柱子，并12000g離心I分鐘，棄液體，加入洗滌緩沖液I 500uL, 12000g離心30秒，再棄液體，加入洗滌緩沖液II 750uL, 12000g離心I分鐘，棄液體，空管12000g離心I分鐘，轉(zhuǎn)移柱子于干凈的I. 5mL離心管中，并加入60uL洗脫緩沖液,12000g離心I分鐘,收集離心液,即為經(jīng)過純化的fliC、hcpA、tir和eae片段。將fee I和沿07 I酶切的fliC片段4uL與同樣酶切的載體pCold I片段4uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. OuL，同時加入一個離心管，混勻后，4°C連接過夜，用于轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用5^ I和通W I雙酶切，37°C水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到一條fliC片段大小的條帶出現(xiàn)，獲得pCold I重組質(zhì)粒；用ZAo 1和&0/ I酶切hcpA片段和pCold I -f IiC重組質(zhì)粒，膠回收后，PCold I取4. OuL，hcpA片段取2 uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. Oul,補水2 uL, —同加入eppendorf管，混勻后,4°C連接過夜,轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到hcpA片段大小的條帶出現(xiàn),獲得pCold I -fliC-hcpA重組質(zhì)粒；用AcoTP I
Sal I 酶切 tir 片段和 pCold I -fliC-hcpA 重組質(zhì)粒,膠回收后，pCold I -fliC-hcpA取2. OuL, tir片段取3. 0 uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. Oul，補水3 uL，一同加入離心管中，4°C連接過夜，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到tir片段大小的條帶 出現(xiàn)，獲得pCold I -fliC-hcpA-tir重組質(zhì)粒；用5^7 I和ZAa I酶切eae片段和pCold I -fliC-hcpA-tir 重組質(zhì)粒,膠回收后,pCold I -fliC-hcpA-tir和eae各取4. OuL,T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. Oul，一同加入管中，混勻后，4°C連接過夜，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到eae片段大小的條帶出現(xiàn),獲得pCold I -fliC-hcpA-tir-eae重組質(zhì)粒，將測序正確的陽性質(zhì)粒PCold I -fliC-hcpA-tir-eae轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中，獲得多價重組菌 BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)。(2)多價重組菌的構(gòu)建、多價重組融合蛋白的表達和純化
將BL21 (pCold I -f liC-hcpA-tir-eae)培養(yǎng)物按體積比2%接種于含lOOPg/mL有氨芐抗生素的LB中，37°C振蕩培養(yǎng)至A=O. 6^0. 8時加入誘導劑IPTG至工作濃度為0. 5mM,繼續(xù)15°C震蕩培養(yǎng)24小時，誘導菌液離心收集菌體重懸于TE緩沖液中，超聲裂解后，12000g離心25分鐘，收集上清和沉淀進行SDS-PAGE，可以清晰看到分子量大小為88kD目的蛋白，主要存在于菌體上清中，獲得fliC-hcpA-tir-eae多價重組蛋白。將上述誘導重組菌BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)經(jīng) 12000 g 離心 10 分鐘，收集菌體，用1/10體積的螯合緩沖液重懸，再加入lmg/mL的溶菌酶，混勻后30°C作用2小時，超聲波進行超聲破碎，4°C 12000 g離心30分鐘收集上清，0.45剛濾器過濾后上經(jīng)過預處理(4倍柱體積的螯合緩沖液洗柱子)的Ni+親和層析柱，加入洗脫緩沖液收集蛋白，即為經(jīng)過純化的fliC-hcpA-tir-eae重組蛋白。(3) EHEC 0157:H7多價融合蛋白亞單位疫苗的制備
將上述純化的多價融合蛋白測定蛋白濃度，控制在0.2呢/叱?？乖c佐劑(ISA50V，法國S印pic公司生產(chǎn))按照1:1 (V/V)進行分散處理制成油乳劑。有益效果本發(fā)明的特點和優(yōu)點如下
I、本發(fā)明針對EHEC 0157:H7重要的粘附因子串聯(lián)構(gòu)建了融合型重組菌。利用PCR,獲得fliC、hcpA、tir和eae四個基因片段，并通過串聯(lián)，最終克隆入表達質(zhì)粒pCold中，成功構(gòu)建pCold I -fliC-hcpA-tir-eae,轉(zhuǎn)化入BL21中獲得重組菌，即BL21(pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)。2、本發(fā)明成功獲得 BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)，經(jīng)過 37°C高密度發(fā)酵培養(yǎng)，15°C IPTG的誘導獲得高效表達，表達量約占全菌蛋白的30%，經(jīng)過純化后獲得重組融合型蛋白，即fliC-hcpA-tir-eae重組蛋白。3、本發(fā)明將純化后的fliC-hcpA-tir-eae重組蛋白制備了亞單位疫苗，免疫了Balb/c小鼠和山羊，明確了上述表達的重組蛋白具有良好的免疫原性，為更加安全而有效的防控腸出血性大腸桿菌的感染和致病提供了有效的技術(shù)方法。四

圖I :pCold I -fliC-hcpA-tir-eae重組質(zhì)粒酶切鑒定。M, DL-2000 ; 1-3, pCold I -fliC-hcpA-tir-eae 重組質(zhì)粒質(zhì)粒 fee I /Xba I圖 2 :BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)重組菌電泳分析。M,中分子量蛋白質(zhì) Marker ；1, BL21 (pCold I -f I iC-hcpA-t ir~eae)誘導后全菌蛋白；2, BL21 (pCold I -fIiC-hcpA-tir-eae)誘導前全菌蛋白；3, BL21(pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)誘導后全菌蛋白上清
圖3 :免疫后小鼠血清中IgG滴度測定 圖4 :免疫組和對照組小鼠攻擊排菌變化 圖5 :免疫后山羊糞便中IgG滴度測定圖6 :免疫組和對照組山羊攻擊排菌變化
五具體實施例方式 I、獲取fliC、hcpA、tir和eae基因，并串聯(lián)克隆入pCold I載體根據(jù)GenBank中0157:H7 EDL933 (上海三踏生物科技有限公司)的(序列號L07388)、AcW (序列號NC_013008)、(ir (序列號AF125993)和 eae (序列號Z11541)基因序列分別設計引物，并分別在上下游引物兩端加入酶切位點(下劃線部分)，在AcW基因后和eae基因前分別加入長度為24個核苷酸的連接片段，引物序列如下fliC~ I 5-ggggagctcactattaccaacaaa~3Sac I
fIiC-V2 5-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3Xhol I
AcpA-Pl 5-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3Xhol I
hcpA~ 2 5-tttgaattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3 EcoR Itir~ l 5-gatgaattcgagccggatagccca-3EcoR I
tir~ 2 5~ttagtcgacagcccccgatgaaac~3Sal I
eae~V\ 5-ttagtcgacgctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc~3 Sal Ieae~ 2 :5_ ggctctagattattctacacaaaccgc-3Xba I
0157 :H7過夜培養(yǎng)物，ImL/管，12000r離心2分鐘，棄上清，收集菌體重懸于1/5體積雙蒸水，煮10min，4°C 12000r離心10分鐘，吸取上清凍存_20°C，用于PCR擴增用；
擴增片段的上下游引物分別加有fee I和通I酶切位點，擴增eae片段的上下游引物分別加有免7 1和油<3 I酶切位點，PCR反應條件均為95°C預變性5分鐘，94°CI分鐘，55°C 30秒，720C I分鐘，30個循環(huán)，72°C再延伸10分鐘;擴增Acpd片段的上下游分別引物加有通I和及^7 I酶切位點，擴增(ir片段的上下游引物分別加有及^7 I和Sal I酶切位點，PCR反應條件均為95°C預變性5分鐘，94°C I分鐘，56°C 30秒，72°C 30秒，30個循環(huán)，72 °C再延伸6分鐘。fIiC-VI 和 fIiC-Vl、hcpA-PI 和 IwpA-P2、tir~ I 和 h>_P2、eae_PI 和 eae_P2 擴增片段長度分別為946bp、423bp、309bp和811bp。將擴增的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量比I. 2%的瓊脂糖電泳，切膠稱重，加入3倍體積DE-A緩沖液(天根公司)后65°C作用10分鐘，待膠全部融化后，再加入DE-A緩沖液的0. 5體積的DE-B緩沖液，顛倒混勻后，將融化的液體轉(zhuǎn)移于微型柱子(天根公司)，并12000g離心I分鐘，棄液體，加入洗滌緩沖液I 500uL，12000g離心30秒，再棄液體，加入洗滌緩沖液II 750uL, 12000g離心I分鐘，棄液體，空管12000g離心I分鐘，轉(zhuǎn)移柱子于干凈的I. 5mL離心管中，并加入60uL洗脫緩沖液，12000g離心I分鐘，收集離心液，即為經(jīng)過純化的fliC、hcpA、tir和eae片段。將fee I和沿o7 I酶切的fliC片段4uL與同樣酶切的載體pCold I (大連寶生物公司)片段4uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. OuL，同時加入一個離心管，混勻后，4°C連接過夜，用于轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用5^ I和通I雙酶切，37 °C水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到fliC片段大小的條帶出現(xiàn)，獲得pCold I重組質(zhì)粒；用沿o I和及I酶切hcpA片段和pCold I -fliC重組質(zhì)粒，膠回收后，pCold I取4. OuL, hcpA片段取2 uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. Oul，補水2 uL，一同加入印pendorf管，混勻后，4°C連接過夜，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到hcpA片段大小的條帶出現(xiàn)，獲得pCold I -fliC-hcpA 重組質(zhì)粒；用 I 和 5^7 I 酶切 tir 片段和 pCold I -fliC-hcpA重組質(zhì)粒，膠回收后，pCold I -fliC-hcpA取2. OuL，tir片段取3.0 uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. Oul，補水3 uL，一同加入離心管中，4 °C連接過夜，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到tir片段大小的條帶出現(xiàn),獲得pCold I -fliC-hcpA-tir重組質(zhì)粒；用5^7 I和油<3 I酶切eae片段和pCold I -fliC-hcpA-tir重組質(zhì)粒，膠回收后，pCold I -fliC-hcpA-tir 和 eae 各取 4. 0uL，T4 DNA 連接緩沖液和 T4 DNA連接酶各 I. Oul，一同加入管中，混勻后，4°C連接過夜，轉(zhuǎn)化ToplO (南京百思凱)感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到eae片段 大小的條帶出現(xiàn)，獲得pCold I -fliC-hcpA-tir-eae重組質(zhì)粒，將測序正確的陽性質(zhì)粒pCold I -fliC-hcpA-tir-eae轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)(南京百思凱)感受態(tài)細胞中，獲得多價重組菌 BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)。2、多價重組菌的構(gòu)建、多價重組融合蛋白的表達和純化
將 BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)培養(yǎng)物按體積比 2% 接種于含 lOOPg/mL 有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L ;酵母提取物5g/L ;氯化鈉5g/L)中，37°C振蕩培養(yǎng)至A=O. 6 0. 8時加入誘導劑IPTG至工作濃度為0. 6mM，繼續(xù)15°C震蕩培養(yǎng)24小時，誘導菌液離心收集菌體重懸于TE緩沖液中，超聲裂解后，12000g離心25分鐘，收集上清和沉淀進行SDS-PAGE，可以清晰看到分子量大小為88kD目的蛋白，主要存在于菌體上清中，獲得fliC-hcpA-tir-eae多價重組蛋白。將上述誘導重組菌BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)經(jīng) 12000 g 離心 10分鐘，收集菌體，用1/10體積的螯合緩沖液重懸，再加入lmg/mL的溶菌酶，混勻后30°C作用2小時，超聲波進行超聲破碎，4°C 12000 g離心30分鐘收集上清，0. 45剛濾器過濾后，加入到Ni+親和層析柱(上海英俊公司)，加入洗脫緩沖液收集蛋白，即為經(jīng)過純化的fliC-hcpA-tir-eae 重組蛋白。3, EHEC 0157:H7多價融合蛋白亞單位疫苗的制備
將上述純化的多價融合蛋白測定蛋白濃度，控制在0. 2Pg/ML。抗原與佐劑ISA50V(法國Seppic公司生產(chǎn))按照1:1 (V/V)進行分散處理制成油乳劑。4、免疫試驗 (一)小鼠試驗
(I)實驗動物選取雄性BALB/c小鼠(揚州大學購買)20只，18g-22g/只。(2)實驗動物的前處理在攻毒前所有組均給予5g/L鏈霉素溶液飲用3天，3天后糞檢腸道排菌少于IO3 CFU/g，灌胃攻菌后全部給予0.5g/L的鏈霉素溶液飲用。以排除腸道正常菌群，為0157:H7在小鼠體內(nèi)馴化一個定居和生長的環(huán)境，在腸道中成為優(yōu)勢菌群，增加小鼠的易感性。并在攻毒前斷水斷食12小時，攻毒后6小時恢復飲水飲食，防止攻毒后細菌快速排出動物腸道，延長在其體內(nèi)作用時間。(3)免疫攻毒和分組情況將20只小鼠隨機分為2組，每組10只，即實驗組應用制備的亞單位疫苗，而對照組用等量的無菌磷酸鹽緩沖液替代。采用背部及腹部皮下多點注射方式進行免疫，免疫I次，免疫劑量為25ug/只。免疫后35天后進行灌胃攻毒，劑量約為I X 101° CFU/只。攻菌后密切觀察各組小鼠的行為、攝食情況及精神狀態(tài)的變化，詳細統(tǒng)計各組小鼠死亡情況，并每隔兩天收集小鼠新鮮糞便，測定糞便中排菌時間和排菌量的變化情況。(4)免疫后血清中fliC-hcpA-tir-eae特異性IgG抗體的檢測 小鼠免疫前后，對小鼠采取斷尾方式采血制備血清，應用間接ELISA方法檢測小鼠免疫后血清IgG抗體效價。(5)免疫效果確定依據(jù)
①抗體變化利用ELISA檢測免疫后血清抗體變化，以重組抗原包被酶標板，結(jié)果表明能夠誘導高滴度的IgG，達到3.89X 105以上，并且一致性良好。圖3。②攻毒保護情況35天攻毒，結(jié)果顯示免疫組小鼠存活率為10/10，對照組存活率為6/10。③排菌量變化攻毒后24小時開始采集糞便，之后每隔兩天采集一次，經(jīng)過適當處理后涂布篩選性麥康凱平板，37°C培養(yǎng)18 24小時，取出平板計數(shù)，并對菌落用二重PCR進行鑒定，均為0157:H7。免疫組排菌時間縮短，免疫組攻毒之后第4天檢測不到0157:H7，而對照組于第14天仍能檢測到高達IO4CFU以上的排菌，圖4。(二)山羊試驗
(I)實驗動物選取雄性山羊(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院羊場購買)10只，3月齡。(2)實驗動物的前處理在攻毒前所有山羊斷食斷水12小時，攻毒后6小時恢復飲水飲食，防止攻擊后細菌快速排出動物腸道，延長在其體內(nèi)作用時間。(3)免疫攻毒和分組情況將10只山羊隨機分為2組，5只/組。頸部多點注射免疫，免疫劑量為200ug/只。間隔21天后,進行2次免疫,二次免疫后14天后進行灌胃攻毒，劑量約為IXlOici CFU/只。攻菌后密切觀察各組羊的行為，并每隔2天收集山羊的新鮮糞便，測定糞便中排菌時間和排菌量的變化情況。(4)免疫后血清中fliC-hcpA-tir-eae特異性IgG抗體的檢測
山羊免疫前和二免后，耳靜脈采血制備血清，應用間接ELISA方法檢測免疫后血清IgG抗體效價。(5)免疫效果確定依據(jù)
①抗體變化利用ELISA檢測免疫后血清抗體變化，以重組抗原包被酶標板，結(jié)果表明能夠誘導高滴度的IgG，達到2. 48 X IO4以上。圖5。②攻毒保護情況對照山羊和免疫山羊沒有任何不良反應，無死亡。③排菌量變化攻毒后24小時開始采集糞便，之后每2天采集一次，經(jīng)過適當處理后涂布篩選性麥康凱平板，37°C培養(yǎng)18 24小時，取出平板計數(shù)，并對菌落用二重PCR進行鑒定，均為0157:H7。免疫山羊不排菌，而對照山羊第12天仍然在排菌。圖6。
權(quán)利要求
1.腸出血性大腸桿菌0157:H7多價融合型重組菌，其構(gòu)建方法為 根據(jù)GenBank中0157 :H7 EDL933的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分別設計引物，并分別在上下游引物兩端加入酶切位點，在AcW基因后和咖基因前分別加入長度為24個核苷酸的連接片段，引物序列如下 fliC~ I 5-ggggagctcactattaccaacaaa~3Sac I fHC~V2 5-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3Xhol I AcpA-Pl 5-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3Xhol IhcpA~ 2 5-tttgaattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3 EcoR Itir~ l 5-gatgaattcgagccggatagccca-3EcoR I tir~ 2 5~ttagtcgacagcccccgatgaaac~3Sal I eae~V\ 5-ttagtcgacgctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc~3 Sal I eae~ 2 :5_ ggctctagattattctacacaaaccgc-3Xba I 0157:H7過夜培養(yǎng)物，ImL/管，12000r離心2分鐘，棄上清，收集菌體重懸于1/5體積雙蒸水，煮10min，4°C 12000r離心10分鐘，吸取上清凍存_20°C，用于PCR擴增用； 擴增片段的上下游引物分別加有fee I和通I酶切位點，擴增eae片段的上下游引物分別加有免7 1和油<3 I酶切位點，PCR反應條件均為95°C預變性5分鐘，94°CI分鐘，550C 30秒，720C I分鐘，30個循環(huán)，72°C再延伸10分鐘;擴增Acpd片段的上下游分別引物加有通I和及^7 I酶切位點，擴增(ir片段的上下游引物分別加有及^7 I和Sal I酶切位點，PCR反應條件均為95°C預變性5分鐘，94°C I分鐘，56°C 30秒，72°C 30秒，30個循環(huán)，72°C再延伸6分鐘； fIiC- I 和 fliC-V2、hcpA-V\ 和 Ac/^_P2、tir~ l 和 tir_ 2、eae~ l 和 eae_P2 擴增片段長度分別為946bp、423bp、309bp和81 Ibp ; 將擴增的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量比I. 2%的瓊脂糖電泳，切膠稱重，加入3倍體積DE-A緩沖液后65°C作用10分鐘，待膠全部融化后，再加入DE-A緩沖液的0.5體積的DE-B緩沖液，顛倒混勻后,將融化的液體轉(zhuǎn)移于微型柱子,并12000g離心I分鐘，棄液體，加入洗滌緩沖液I 500uL, 12000g離心30秒，再棄液體，加入洗滌緩沖液II 750uL, 12000g離心I分鐘，棄液體，空管12000g離心I分鐘，轉(zhuǎn)移柱子于干凈的I. 5mL離心管中，并加入60uL洗脫緩沖液,12000g離心I分鐘,收集離心液,即為經(jīng)過純化的fliC、hcpA、tir和eae片段； 將5^ I和通I酶切的fliC片段4uL與同樣酶切的載體pCold I片段4uL，T4DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. OuL，同時加入一個離心管，混勻后，4°C連接過夜，用于轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用5^ I和通W I雙酶切，37°C水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到fliC片段大小的條帶出現(xiàn)，獲得pCold I重組質(zhì)粒；用ZAo I和&0/ I酶切hcpA片段和pCold I -fliC重組質(zhì)粒，膠回收后，PCold I取4. OuL，hcpA片段取2 uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. Oul,補水2 uL, —同加入eppendorf管，混勻后,4°C連接過夜,轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到hcpA片段大小的條帶出現(xiàn),獲得pCold I -fliC-hcpA重組質(zhì)粒；用AcoTP ISal I 酶切 tir 片段和 pCold I -fliC-hcpA 重組質(zhì)粒,膠回收后，pCold I -fliC-hcpA取2. OuL, tir片段取3. 0 uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. OuL，補水3 uL，一同加入離心管中，4°C連接過夜，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到tir片段大小的條帶出現(xiàn)，獲得pCold I -fliC-hcpA-tir重組質(zhì)粒；用5^7 I和ZAa I酶切eae片段和pCold I -fliC-hcpA-tir 重組質(zhì)粒,膠回收后,pCold I -fliC-hcpA-tir和eae各取4. OuL,T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. Oul，一同加入管中，混勻后，4°C連接過夜，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到eae片段大小的條帶出現(xiàn),獲得pCold I -fliC-hcpA-tir-eae重組質(zhì)粒，將測序正確的陽性質(zhì)粒PCold I -fliC-hcpA-tir-eae轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中，獲得多價重組菌 BL21 (pCold I -f liC-hcpA-tir-eae)。
2.權(quán)利要求I所述腸出血性大腸桿菌0157:H7多價融合型重組菌BL21(pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)表達的重組蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組蛋白，其特征在于， 將權(quán)利要求I所述BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)培養(yǎng)物按體積比2%接種于含lOOPg/mL有氨芐抗生素的LB中，37°C振蕩培養(yǎng)至A=O. 6^0. 8時加入誘導劑IPTG至工作濃度為0. 5mM，繼續(xù)15°C震蕩培養(yǎng)24小時，誘導菌液離心收集菌體重懸于TE緩沖液中，超聲裂解后，12000g離心25min，收集上清和沉淀進行SDS-PAGE，可以清晰看到分子量大小為88kD目的蛋白，主要存在于菌體上清中，獲得fliC-hcpA-tir-eae多價重組蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛋白，其特征在于，將權(quán)利要求3所述經(jīng)過0.6mMIPTG誘導的重組菌BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)菌液經(jīng)12000 g離心10分鐘，收集菌體，用1/10體積的螯合緩沖液重懸，再加入lmg/mL的溶菌酶，混勻后30°C作用2小時，超聲破碎，4°C 12000 g離心30分鐘收集上清，0.45剛濾器過濾后上親和層析柱，加入洗脫緩沖液收集蛋白，即為經(jīng)過純化的fliC-hcpA-tir-eae重組蛋白。
5.用權(quán)利要求I所述腸出血性大腸桿菌0157:H7多價融合型重組菌制備的疫苗。
6.用權(quán)利要求2-4之一所述重組蛋白制備的疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于，將權(quán)利要求2-4之一所述重組蛋白作為抗原，與佐劑ISA50V按照體積比I: I進行分散處理制成油乳劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及腸出血性大腸桿菌O157:H7多價fliC-hcpA-tir-eae重組菌及疫苗，屬于生物制藥領(lǐng)域。分別擴增出EHECO157:H7的H7鞭毛(fliC)基因、菌毛(hcpA)基因、轉(zhuǎn)位緊密素受體(tir)基因和緊密素(eae)基因，依次串聯(lián)，克隆入表達載體pColdⅠ中，獲得重組質(zhì)粒pCold-fliC-hcpA-tir-eae，在BL21(DE3)獲得高效表達。經(jīng)過高密度發(fā)酵和一系列的純化程序獲得高純度的融合蛋白分子疫苗。該疫苗的制備工藝簡捷、易于放大、重復性好，所獲得目標蛋白純度較高，動物試驗證明可刺激機體在體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫方面產(chǎn)生高效的免疫應答，免疫預防保護和治療作用。
文檔編號C12P21/02GK102747024SQ20121020125
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者何孔旺, 俞正玉, 倪艷秀, 葉青, 呂立新, 周俊明, 張雪寒, 李彬, 欒曉婷, 溫立斌, 王小敏, 茅愛華, 郭容利 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院