專利名稱：用于人多能細(xì)胞培養(yǎng)的簡(jiǎn)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制作方法
用于人多能細(xì)胞培養(yǎng)的簡(jiǎn)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用不適用。關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明受到政府支持，在國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的ES017166支持下完成。政府在本發(fā)明中有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
多能細(xì)胞，例如胚胎干(ES)細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞，具有分化為所有三種原胚層細(xì)胞的潛力(Thomson等，Science282，1145-1147 (1998))。已證實(shí)多能細(xì)胞的巨大發(fā)展?jié)摿捎糜诨A(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。人多能細(xì)胞培養(yǎng)的許多基礎(chǔ)方法，例如生長(zhǎng)培養(yǎng)基、鋪板和其它條件，已得到開發(fā)與改進(jìn)(Ludwig等，Nat.Biotechnol24, 185-187(2006)；Ludwig等，Nat.Methods3，637-646 (2006))。例如，當(dāng)在含有胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中，在鼠胚胎成纖維細(xì)胞(murine embryonic fibroblast, MEF)飼養(yǎng)細(xì)胞上起始培養(yǎng)人ES細(xì)胞時(shí)，現(xiàn)可獲得完全限定培養(yǎng)基(fully defined media)和限定的蛋白質(zhì)基質(zhì)(Ludwig等，Nat.Biotechnol24, 185-187(2006))。在過去的十年，多能細(xì)胞培養(yǎng)方法有顯著進(jìn)展。開發(fā)了若干生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其為多能細(xì)胞的生存和擴(kuò)增提供基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，并直接決定細(xì)胞如何生長(zhǎng)與分化。TeSR 是首批限定培養(yǎng)基中的一種，其在無飼養(yǎng)細(xì)胞或條件培養(yǎng)基時(shí)，支持多能細(xì)胞經(jīng)多次培養(yǎng)傳代仍保持在未分化狀態(tài)(Ludwig等，Nat.Methods3，637-646 (2006);美國(guó)專利號(hào)7，449，334，各文件通過引用納入本文并如其完整形式)。TeSR 除本身包含52種成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12外，還包含18種成分(表I)?？捎糜诙嗄芗?xì)胞培養(yǎng)的不同生長(zhǎng)培養(yǎng)基的多樣性造成了研究結(jié)果不一致。現(xiàn)用于多能細(xì)胞衍生和生長(zhǎng)的培養(yǎng)基(包括完全限定培養(yǎng)基)含有會(huì)以不同方式影響多能細(xì)胞的成分。在本文描述的本發(fā)明之前，仍然未知各培養(yǎng)基成分在細(xì)胞培養(yǎng)中如何(單獨(dú)地還是與其它成分聯(lián)合)影響不同多能細(xì)胞的功能，如活力、多能性或分化。例如，在大多數(shù)培養(yǎng)基中含量最豐富的蛋白質(zhì)——白蛋白，是一種脂質(zhì)載體，并且同樣可以通過其聯(lián)合的脂質(zhì)來影響多能性的分化或保持。白蛋白及其聯(lián)合的脂質(zhì)的質(zhì)量決定它是否能用于人多能細(xì)胞培養(yǎng)。然而，白蛋白的質(zhì)量隨其來源而定，差異很大，甚至產(chǎn)自重組遺傳材料時(shí)差異也很大，造成在不同等效實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)之間的差異。同樣，雖然可獲得克隆的人血清白蛋白，但由于其價(jià)格相對(duì)昂貴而很少用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)。從培養(yǎng)基中去除白蛋白的努力已被證實(shí)是不成功的。去除白蛋白或TeSR中存在的任何其它生長(zhǎng)因子都會(huì)導(dǎo)致人ESC培養(yǎng)性能顯著下降，例如細(xì)胞活力、增殖和多能性的減少(Ludwig 等，Nat.Biotechnol24, 185-187 (2006))。為充分開發(fā)多能細(xì)胞用于藥物發(fā)現(xiàn)、測(cè)試和移植治療的潛力，需要使這些細(xì)胞在完全限定且理想的無異源條件下衍生和生長(zhǎng)。因此，本領(lǐng)域中存在對(duì)不含引起不一致性的成分的培養(yǎng)基的未被滿足的需求 ，以保持對(duì)多能細(xì)胞培養(yǎng)條件的控制。本技術(shù)領(lǐng)域中特別需要多能細(xì)胞培養(yǎng)基，其僅包含支持對(duì)特定培養(yǎng)目標(biāo)而言有重要性的多能細(xì)胞功能的那些成分。簡(jiǎn)述本發(fā)明一般涉及用于衍生和培養(yǎng)多能細(xì)胞的培養(yǎng)基、組合物和方法，更具體地涉及用于多能細(xì)胞的完全限定培養(yǎng)基。本發(fā)明的第一方面概括為支持多能細(xì)胞的活力、生長(zhǎng)和多能性的無白蛋白培養(yǎng)基。在所述第一方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包含硒。在所述第一方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包含NODAL。在所述第一方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包含轉(zhuǎn)鐵蛋白。在所述第一方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-P (TGF-3 )。在所述第一方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基僅包含水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，各所述成分的量足以支持多能干細(xì)胞的活力。在所述第一方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基僅包含水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干細(xì)胞的增殖。在所述第一方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基支持多能細(xì)胞在傳代、冷凍、增殖、多能性、衍生和克隆化后的存活。在所述第一方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基是無異源的。本發(fā)明的第二方面概括為用于在限定培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞的方法。在所述第二方面的一些實(shí)施方式中，用于培養(yǎng)多能細(xì)胞的所述培養(yǎng)基僅包含水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素和FGF，各所述成分的量足以支持多能細(xì)胞的活力。在所述第二方面的一些實(shí)施方式中，用于培養(yǎng)多能細(xì)胞的所述培養(yǎng)基僅包含水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、以及TGF- ^和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干細(xì)胞的增殖。在所述第二方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包含支持多能細(xì)胞的擴(kuò)大生長(zhǎng)、多能性、克隆化、冷凍或衍生的限定的因子。在所述第二方面的一些實(shí)施方式中，所述用于培養(yǎng)多能細(xì)胞的培養(yǎng)基是無異源的。本發(fā)明的第三方面針對(duì)在基本不含￠-巰基乙醇和白蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)組合物。在所述第三方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)組合物不含成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞、條件培養(yǎng)基和異源污染物。本發(fā)明的第四方面概括為用于在完全限定的條件下從成熟個(gè)體衍生iPS細(xì)胞的方法。所述方法包括以下步驟:在培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自成熟個(gè)體的體細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包含水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素和FGF，所述成分的量皆足以保持活力，以及在限定條件(例如用來衍生iPS細(xì)胞的條 件)中重編程所述細(xì)胞。在所述第四方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基在部分或全部所述重編程步驟中包含TGF- 3。在所述第四方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包含丁酸鹽。在所述第四方 面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包含氫化可的松。在所述第四方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基是無異源的。
本發(fā)明的第五方面概括為用于在無白蛋白培養(yǎng)基中克隆多能干細(xì)胞的方法。所述方法包括以下步驟:將多能干細(xì)胞以克隆密度在支持多能干細(xì)胞克隆化的無白蛋白培養(yǎng)基中鋪板。在所述第五方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包含ROCK抑制劑。在所述第五方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包含肌球蛋白抑素(blebbis tatin)。在所述第五方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基僅包含水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干細(xì)胞的克隆化。本發(fā)明的第六方面概括為在無白蛋白培養(yǎng)基中凍存保存多能干細(xì)胞的方法。所述方法包括以下步驟:在無白蛋白培養(yǎng)基中冷凍多能干細(xì)胞。在所述第六方面的一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基僅包含水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、TGF-P和NODAL 二者之一、以及二甲亞砜(DMSO)。本發(fā)明的第七方面概括為在無白蛋白條件下衍生的iPS細(xì)胞。在無白蛋白存在時(shí)衍生的iPS細(xì)胞不受內(nèi)源白蛋白的污染。本文中描述的方法和組合物可用于各種應(yīng)用以衍生、培養(yǎng)和使用多能細(xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)目的是為多能細(xì)胞限定短期和長(zhǎng)期培養(yǎng)條件，所述多能細(xì)胞受限于支持所需培養(yǎng)目標(biāo)的因子。本發(fā)明的另一個(gè)目的是為多能細(xì)胞提供培養(yǎng)條件，在所述培養(yǎng)條件下，處于未分化狀態(tài)的培養(yǎng)細(xì)胞的百分比最大化。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基可作為必要平臺(tái)用以檢測(cè)各種條件如何影響多能細(xì)胞，并用于比較先前報(bào)道的在不同培養(yǎng)基背景下的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明的這些及其它特征、目的和優(yōu)勢(shì)將從以下的說明中得到更好的理解。在該說明中，以附圖作為參考，這些附圖是本文的一部分，這一部分僅以說明方式呈現(xiàn)，而并非對(duì)本發(fā)明的限制或者實(shí)施方式。優(yōu)選實(shí)施方式的說明并非限制本發(fā)明以概括所有變化形式、等價(jià)形式和可選形式。因此，應(yīng)參考本文列舉的權(quán)利要求來理解本發(fā)明的范圍。附圖簡(jiǎn)要說明考慮以下詳細(xì)描述將更好地理解本發(fā)明，并且除以上所述之外的特征、方面和優(yōu)勢(shì)將會(huì)更加明顯。所述詳細(xì)的說明參考以下附圖，其中:

圖1A-E顯示在培養(yǎng)中使人ES細(xì)胞存活和自我更新的培養(yǎng)基成分。圖1A顯示鋪板在不同培養(yǎng)基中的個(gè)體化細(xì)胞的24小時(shí)存活指數(shù)。培養(yǎng)基縮寫列于表I中。胰島素和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(IF)、牛血清白蛋白(BSA)、0_巰基乙醇(BME)的存在以“ + ”表示，不存在以表示。圖1B顯示鋪板在不同培養(yǎng)基中的個(gè)體化細(xì)胞的24小時(shí)或96小時(shí)存活指數(shù)。胰島素和成纖維生長(zhǎng)因子(FGF)的添加以“ + ”表示，去除以表示。圖1C顯示培養(yǎng)在有維生素C的TeSR 培養(yǎng)基(TeSR)、無維生素C的TeSR 培養(yǎng)基(TeSR _LAA)或DF5培養(yǎng)基中的個(gè)體化細(xì)胞的24小時(shí)或129小時(shí)存活指數(shù)。圖1D顯示各在DF5、添加硒的DF5 (DF5+硒)、DF12或已去除硒的DF12(DF12-硒)中傳三代后的細(xì)胞增殖。圖1E顯示十二種不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基的對(duì)比分析。圖2A-F顯示人ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞使用DF5S的培養(yǎng)條件的優(yōu)化。圖2A顯示在DF5S(下圖)或TeSR (上圖)中以低密度(約1，500個(gè)細(xì)胞/cm2)接種，并于不同O2和CO2 濃度(015C5:15%02 和 5%C02 ；015C10:15%02 和 10%C02 ；05C10:5%02 和 10%C02)培養(yǎng)的個(gè)體化細(xì)胞的存活指數(shù)。在24小時(shí)和124小時(shí)檢測(cè)細(xì)胞存活。圖2B顯示培養(yǎng)在存在小分子HA100 (+HA100)或不存在小分子撤100化11100:含100叩/1111 FGF的條件培養(yǎng)基)的不同培養(yǎng)基中的Hl細(xì)胞的克隆率(cloning efficiency)。圖2C顯示不同培養(yǎng)基中Hl細(xì)胞和衍生自包皮成纖維細(xì)胞的iPS細(xì)胞的克隆率。圖2D顯示不同培養(yǎng)基中衍生自包皮成纖維細(xì)胞的iPS細(xì)胞的克隆率。DF5StrFe代表其中加入了全轉(zhuǎn)鐵蛋白的DF5S培養(yǎng)基。圖2E顯示在存在HA100 (10 u M，24小時(shí))、肌球蛋白抑素(10 y M，4小時(shí))、或Y27632 (10 u M，24小時(shí))的不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Hl細(xì)胞的克隆率，與不存在這些因子(對(duì)照)時(shí)的克隆率做比較。星號(hào)代表P〈0.05。圖2F顯示在條件培養(yǎng)基(CM)、含有ROCK抑制劑(HA100)的CM、含有ROCK抑制劑的TeSR和含有ROCK抑制劑的E8中，在含氧量正常(深灰柱)和低氧(淺灰柱)條件中的Hl細(xì)胞的克隆率。誤差柱代表均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差；星號(hào)代表P〈0.05。圖3A-B顯示補(bǔ)充了胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒、L-抗壞血酸、FGF2和TGF-P或NODAL的DMEM/F12 (在本文中分別稱為“E8 (TGF- ^ ) ”和“E8 (NODAL) ” )中的多能細(xì)胞生長(zhǎng)和基因表達(dá)。圖3A顯示在TeSR (深灰線)或E8 (TGF-P)(淺灰線)中保持的HlES細(xì)胞(上圖)和iPS細(xì)胞(下圖)的倍數(shù)擴(kuò)增。圖3B顯示在E8 (TGF-P)中生長(zhǎng)的HlES細(xì)胞和在TeSR 中生長(zhǎng)的HlES細(xì)胞的全基因表達(dá)。通過用伊魯米那基因組分析儀(Illumina Genome Analyzer)GAIIX(全基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)R=0.954(斯皮爾曼相關(guān)(Spearman Correlation)))進(jìn)行RNA-測(cè)序，分析在TeSR或E8 (TGF ^ )培養(yǎng)基中保持三代的Hl細(xì)胞的RNA。圖4A-F顯示在多種限 定條件下的iPS細(xì)胞衍生。圖4A顯示添加了各種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)的基于DF5SFe培養(yǎng)基中的包皮成纖維細(xì)胞增殖，與在含有FBS的培養(yǎng)基中的增殖做比較。圖4B顯示補(bǔ)充了氫化可的松的不同培養(yǎng)基中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。圖4C顯示多能性標(biāo)記物0CT4(左圖)和SSEA4(右圖)的表達(dá)。圖4D顯示由包皮成纖維細(xì)胞、hES細(xì)胞、在飼養(yǎng)細(xì)胞上衍生的iPS細(xì)胞(iPS細(xì)胞(飼養(yǎng)細(xì)胞))以及在E8培養(yǎng)基中衍生的iPS細(xì)胞(iPS細(xì)胞(E8))的所選基因表達(dá)。在RNA分析之前，除了成纖維細(xì)胞被保持在含有氫化可的松的E8中，所有細(xì)胞都保持在E8 (TGF ^ )培養(yǎng)基中。圖4E顯示在E8 (TGF ^ )培養(yǎng)基中衍生的人ES和iPS細(xì)胞的全基因表達(dá)(R=0.955)。圖4F是在MEF上衍生的iPS細(xì)胞和在E8 (TGF ^ )培養(yǎng)基中衍生的iPS細(xì)胞的全基因表達(dá)。圖5A-C顯示用于iPS細(xì)胞衍生的培養(yǎng)基的改進(jìn)。圖5A顯示補(bǔ)充了 TGF-P、氫化可的松、TGF- ^和氫化可的松、或TGF- ^和氫化可的松但不含F(xiàn)GF的DF5SFe培養(yǎng)基中的包皮(深灰柱)和PRPF8-2成熟成纖維細(xì)胞(淺灰柱)增殖。圖5B顯示TGF- ^和丁酸鹽對(duì)包皮成纖維細(xì)胞重編程的影響。在重編程轉(zhuǎn)染開始后的四 五周，對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和真iPS細(xì)胞的克隆數(shù)進(jìn)行評(píng)分，并計(jì)算iPS克隆與非iPS細(xì)胞克隆的比率。圖6A-B顯示在未經(jīng)二次傳代的完全限定條件下，從成熟成纖維細(xì)胞衍生iPS細(xì)胞。圖6A顯示重編程方案的一個(gè)示例。圖6B顯示通過流式細(xì)胞術(shù)分析在補(bǔ)充了胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒、L-抗壞血酸、FGF2以及TGF-P或N0DAL( “E8”)的DMEM/F12傳代20次維持的iPSC細(xì)胞系所測(cè)定的多能性標(biāo)記物0CT4和SSEA4的表達(dá)。陰影峰:由0CT4 (左)和SSEA4(右)特異性抗體染色；非陰影峰:小鼠IgG對(duì)照抗體。圖7A-C顯示不同培養(yǎng)基中的人成纖維細(xì)胞重編程效率。圖7A顯示使用小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞(MEF)或在基于E8的培養(yǎng)基中經(jīng)重編程處理的每80，OOO個(gè)成纖維細(xì)胞的iPS細(xì)胞克隆數(shù)。為提高效率，向兩種條件中都添加了 IOOii M 丁酸鈉。圖7B顯示在TeSR 中或在基于E8的培養(yǎng)基中經(jīng)重編程處理的每80，000個(gè)成纖維細(xì)胞的iPS細(xì)胞克隆數(shù)。圖7C顯示與TGF-P和丁酸鹽的接觸時(shí)間對(duì)完全限定條件下的包皮成纖維細(xì)胞重編程效率的影響。成纖維細(xì)胞在補(bǔ)充了胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒、L-抗壞血酸和FGF2的DMEM/F12(E8無TGF-￠)或在E8中(存在或不存在100 PM 丁酸鹽)重編程。在重編程30天后檢測(cè)所有條件下的重編程效率。星號(hào)代表P〈0.05。由于本發(fā)明易受不同變化和選擇形式的影響，因此通過附圖中實(shí)施例的方式顯示示例性實(shí)施方式，并在本文中詳細(xì)描述。但是應(yīng)理解，對(duì)示例性實(shí)施方式的說明不是為了將本發(fā)明限制于所公開的特定形式，而與之相反，本發(fā)明適用于如所附權(quán)利要求所限定的所有落入本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的變化形式、等量形式和可選形式。實(shí)施方式的示例性說明本發(fā)明涉及本發(fā)明人的如下觀察:曾被認(rèn)為是培養(yǎng)多能細(xì)胞所必需的某些培養(yǎng)基成分可從多能細(xì)胞培養(yǎng)基配方中去除以達(dá)到某種的培養(yǎng)目的。本文中所用術(shù)語(yǔ)“多能細(xì)胞(pluripotent cell) ”指的是有能力分化為所有三種胚層細(xì)胞的細(xì)胞。多能細(xì)胞的例子包括胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞。本文中所用術(shù)語(yǔ)“ iPS細(xì)胞”指的是在遺傳上與其各自分化的來源體細(xì)胞基本上相同，并顯示與較高潛能細(xì)胞(比如本文所述的ES細(xì)胞)相似特性的細(xì)胞。所述細(xì)胞可通過非多能細(xì)胞(例如專能(multipotent)細(xì)胞或體細(xì)胞)的重編程而獲得。本發(fā)明涉及不含對(duì)特定培養(yǎng)目標(biāo)非必需的因子的新培養(yǎng)基。培養(yǎng)目標(biāo)的實(shí)施例包括但不限于:細(xì)胞存活、傳代、增殖、多能性、克隆化和iPS細(xì)胞衍生。本發(fā)明特別涉及無白
蛋白培養(yǎng)基。澄清一點(diǎn):“傳代”和“克隆化”是不同的方法?！皞鞔泵枋龅氖菍⑴囵B(yǎng)容器中已培養(yǎng)至一定密度的細(xì)胞分成團(tuán)塊，然后將其放入新培養(yǎng)容器中的過程。這些團(tuán)塊可包含任意數(shù)量的細(xì)胞，一般在100 1，000個(gè)細(xì)胞之間，其易起始在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。相反，“克隆化”指的是通過從單個(gè)個(gè)體ES細(xì)胞生長(zhǎng)人ES細(xì)胞克隆來創(chuàng)建純系集落。本文所用的術(shù)語(yǔ)“克隆率”指的是形成新細(xì)胞集落的個(gè)體化細(xì)胞的數(shù)量除以在培養(yǎng)物中鋪板的個(gè)體化細(xì)胞的數(shù)量。克隆率根據(jù)培養(yǎng)條件的不同具有很大差異。例如，在限定且無異源的條件下，
MATR1GEL/上的人ES細(xì)胞的克隆率很低(即少于約0.1%),而用成纖維細(xì)胞-條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的這些細(xì)胞的克隆率盡管仍然低(即少于約2%)，但就創(chuàng)建純系ES細(xì)胞集落而言已足夠高了?，F(xiàn)有所用的某些培養(yǎng)基成分會(huì)對(duì)培養(yǎng)`的細(xì)胞或誘導(dǎo)性分化有害。例如，^ -巰基乙醇會(huì)損傷或甚至殺死培養(yǎng)的多能細(xì)胞。血清培養(yǎng)基添加劑，如牛血清白蛋白(BSA)或胎牛血清(FCS)，會(huì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的多能細(xì)胞分化。市售可得的血清成分在其組成上也可有顯著差異(甚至當(dāng)其由同一來源供應(yīng))，引起不可預(yù)期的培養(yǎng)可變性。本文所述的培養(yǎng)基基本不含在大多數(shù)傳統(tǒng)多能細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的損傷性、有差異、不確定的因子。所公開的培養(yǎng)基已成功用于各種培養(yǎng)目的，比如支持短期多能細(xì)胞活力(例如24小時(shí))、短期增殖(例如4 5天)、在延長(zhǎng)的培養(yǎng)周期(例如在3個(gè)月內(nèi)傳代多于25次)中維持多能細(xì)胞以及用慢病毒和附加型載體從胎兒和成人成纖維細(xì)胞衍生iPS細(xì)胞。
開發(fā)了為某些細(xì)胞培養(yǎng)目的而特別定制的新型最簡(jiǎn)培養(yǎng)基。測(cè)試單一或聯(lián)合的各種培養(yǎng)基成分，例如鹽、維生素、葡萄糖源、礦物質(zhì)和氨基酸，以測(cè)定它們對(duì)于活力、增殖或多能性的單獨(dú)影響。開發(fā)了新的存活分析方法，并將其用于測(cè)定哪些成分對(duì)解離(dissociation)后多能細(xì)胞的存活是必需的。測(cè)試了新型培養(yǎng)基支持增殖和保持多能性的能力。這些培養(yǎng)基也用于克隆分析，以測(cè)定各培養(yǎng)基如何影響單個(gè)細(xì)胞及其克隆率。表I列出了本文所述的各新型培養(yǎng)基的完整成分列表(淺色和深色陰影區(qū)域代表該培養(yǎng)基中存在該成分，格紋區(qū)域表示可互換的成分，無色區(qū)域表示該培養(yǎng)基中不存在該成分)。表1.培養(yǎng)基成分

權(quán)利要求
1.一種無白蛋白培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基支持多能干細(xì)胞增殖。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含: 水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干細(xì)胞增殖。
3.一種用于培養(yǎng) 多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟: 將多能干細(xì)胞置于基質(zhì)上；以及 使所述細(xì)胞接觸無白蛋白培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基支持多能干細(xì)胞增殖。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含: 水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干細(xì)胞增殖。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述基質(zhì)包含層粘連蛋白。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述基質(zhì)包含玻連蛋白。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，使所述細(xì)胞在低氧條件下接觸所述培養(yǎng)基。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述多能干細(xì)胞是誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述多能干細(xì)胞是人細(xì)胞。
11.一種用于克隆多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟: 在無白蛋白培養(yǎng)基中以克隆密度將多能干細(xì)胞鋪板，所述培養(yǎng)基支持多能干細(xì)胞克隆。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含: 水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干細(xì)胞克隆。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基還包含ROCK抑制劑。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述ROCK抑制劑選自HA100和Y27632。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基還包含肌球蛋白抑素。
16.一種凍存多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟: 在無白蛋白培養(yǎng)基中冷凍多能干細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含: 水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干細(xì)胞增殖。
18.一種用于在限定條件下衍生誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟: 在無白蛋白培養(yǎng)基中重編程體細(xì)胞，所述培養(yǎng)基支持體細(xì)胞的重編程以衍生iPS細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含: 水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持iPS細(xì)胞衍生。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述重編程步驟包括使所述細(xì)胞接觸TGF-3 5 10 天。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其還包括以下步驟: 在5 10天后移除TGF- P ；以及 使所述細(xì)胞接觸培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基基本由以下成分組成: 水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒和轉(zhuǎn)鐵蛋白。
22.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述重編程步驟包括使所述細(xì)胞接觸氫化可的松。
23.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述重編程步驟包括使所述細(xì)胞接觸丁酸鹽。
24.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，在無異源條件下衍生所述iPS細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述體細(xì)胞是成熟體細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述重編程步驟包括使用病毒載體。
27.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述重編程步驟包括使用附加型載體。
28.一種無白蛋白生長(zhǎng)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基支持多能干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基基本由以下成分組成:水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、以及TGF-3和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)。
29.一種用于培養(yǎng)多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟: 將多能干細(xì)胞置于基質(zhì)上；以及 使所述細(xì)胞接觸無白蛋白培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基基本由以下成分組成: 水、鹽、氨基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、以及TGF- ^和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)。
全文摘要
描述了支持多能干細(xì)胞活力、增殖、克隆和衍生的完全限定培養(yǎng)基，以及包括這些培養(yǎng)基的方法和組合物。還描述了用于在限定的、無異源條件下，從成熟個(gè)體衍生iPS細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12N5/00GK103180434SQ201180038596
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月5日
發(fā)明者J·A·托馬森, 陳國(guó)凱 申請(qǐng)人:威斯康星校友研究基金會(huì)