專(zhuān)利名稱(chēng)：可降解酰胺類(lèi)聚陽(yáng)離子及其制備方法、納米顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種藥物技術(shù)領(lǐng)域的可降解亞胺類(lèi)聚陽(yáng)離子的合成方法，尤其涉及一種可用于核酸(DNA與RNA)的輸送的可降解酰胺類(lèi)聚陽(yáng)離子及其制備方法、納米顆粒。
背景技術(shù)：
DNA和SiRNA藥物從概念走向臨床應(yīng)用的關(guān)鍵性瓶頸是其體內(nèi)輸送系統(tǒng)的研發(fā)。 各類(lèi)基因載體中，聚陽(yáng)離子載體和病毒及脂質(zhì)體載體相比具有基因擔(dān)載密度和擔(dān)載量均大、制備簡(jiǎn)單，便于化學(xué)修飾等優(yōu)勢(shì)，也存在著化學(xué)毒性大、體內(nèi)循環(huán)周期短(不利于靶向) 的缺點(diǎn)。高分子量的聚乙烯亞胺(PEI，25kDa)由于其氨基密度大，易于包裹帶負(fù)電荷的基因物質(zhì)而成為最早在體外和體內(nèi)被廣泛研究的轉(zhuǎn)染活性較高的基因物質(zhì)(DNA、siRNA)輸送載體，但無(wú)法避免其高分量烷基骨架無(wú)法降解所帶來(lái)的細(xì)胞毒性。因此設(shè)計(jì)和構(gòu)建可降解的聚陽(yáng)離子是提高基因物質(zhì)轉(zhuǎn)染活性、降低其細(xì)胞毒性的一個(gè)關(guān)鍵策略。比如，利用小分子量的聚乙烯亞胺通過(guò)在生理?xiàng)l件下可斷裂的連接鍵構(gòu)建可降解的聚乙烯亞胺類(lèi)聚陽(yáng)離子基因載體是本領(lǐng)域科學(xué)家所熟知的一個(gè)例子。俄亥俄州立大學(xué)的Robert J. Lee等最早采用交聯(lián)劑二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)(DSP)及雙硫二丙二亞氨甲基醚(DTBP)作為連接劑分別與低分子量PEI (PEI SOODa) 交聯(lián)得到高分子量可降解的聚乙烯亞胺類(lèi)聚陽(yáng)離子[Gosselin MA, Guo W, Lee RJ.低分子量聚乙烯可逆交聯(lián)形成的有效輸送基因載體。生物共軛化學(xué)，[J12001 ；12 =989-94.]。這兩個(gè)含有二硫鍵衍生物在中國(guó)倉(cāng)鼠(CHO)卵巢細(xì)胞中具有與市售高分子量PEI (25KDa)相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染活性，二硫鍵的引入使得聚合物可以被體內(nèi)的還原試劑谷胱甘肽還原，從而二硫鍵斷開(kāi)，降解成為細(xì)胞毒性小的低分子量PEI，但是文獻(xiàn)中沒(méi)有給出具體的細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)。隨后有大量文獻(xiàn)報(bào)道了將低分子量PEI (PEI SOODa)通過(guò)含有二硫鍵、酯鍵、胺酯鍵等能夠自我斷裂的連接劑交聯(lián)而成的聚合物[Kloeckner J,WagnerE,Ogris M.利用多胺低聚物構(gòu)建的可降解聚陽(yáng)離子基因載體。].歐洲藥劑學(xué).2006 ；四414-25.等刊物]。這些研究雖然顯示了概念上的可行性，小分子量的PEI以及帶有各種連接劑斷裂片段的低分子量PEI在人體的應(yīng)用仍然不被接受。為了使降解后的低分子量PEI不帶有連接劑片段，猶他大學(xué)的Sung Wan Kim等人報(bào)道了采用戊二醛作為連接劑與低分子量PEI (ISOODa)交聯(lián)，生成亞胺鍵連接的可降解聚乙烯亞胺類(lèi)聚陽(yáng)離子[Kim YH, Park JH, Kim Sff, et al.通過(guò)酸敏感鍵構(gòu)建可降解的聚乙烯亞胺類(lèi)聚陽(yáng)離子基因載體。[J].控制釋放研究2005;103:209-19.]。這一結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)是細(xì)胞攝取后，凝聚基因的聚陽(yáng)離子在內(nèi)吞體和溶酶體的酸性條件下，與低分子量PEI直接相連的亞胺鍵斷開(kāi)，生成無(wú)細(xì)胞毒性的小分量PEI。但是亞胺鍵的聚合結(jié)構(gòu)不能保證這一聚陽(yáng)離子攜帶核酸進(jìn)入細(xì)胞之前足夠穩(wěn)定，其轉(zhuǎn)染活性較也不理想。為了改善亞胺結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，Jin和du采用能夠與伯胺形成帶有共軛π鍵結(jié)構(gòu)的亞胺的乙二醛作為連接劑，將人體內(nèi)源性多氨基單體-精胺和亞精胺聚合成聚陽(yáng)離子， 顯示了較好的穩(wěn)定性和基因轉(zhuǎn)染活性[Du Z，Jin Τ.以人體內(nèi)源性多胺單體為基本構(gòu)建單元并可降解為人體內(nèi)源性多胺單體的聚陽(yáng)離子基因載體，用于DNA(包括DNA疫苗)包裹與輸送.Jin T, 2009. J0因此，我們通過(guò)相同的連接鍵，利用低分子量PEI為基本構(gòu)建單元并可降解為初始低分子量PEI的聚陽(yáng)離子基因載體。前期我們利用乙二醛作為連接劑，將低分子量的PEI聚合為可降解為初始低分子量PEI與乙二醛的聚陽(yáng)離子基因載體。體外實(shí)驗(yàn)顯示了良好的轉(zhuǎn)染效果與細(xì)胞活性。進(jìn)一步利用組氨酸與丁二酸酐反應(yīng)生成中間體 Histiden-acid，然后Histiden-acid與低分子量的PEI合成未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的酰胺類(lèi)聚陽(yáng)離子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，在前期利用乙二醛作為連接劑，將低分子量的PEI聚合為可降解為初始低分子量PEI與乙二醛的聚陽(yáng)離子基因載體的基礎(chǔ)上提供一種可降解酰胺類(lèi)聚陽(yáng)離子及其制備方法、納米顆粒。本發(fā)明構(gòu)建的聚陽(yáng)離子化學(xué)穩(wěn)定性較好，能夠緊密包裹DNA和RNA，在體內(nèi)循環(huán)過(guò)程中不易降解，兼顧到達(dá)靶細(xì)胞之前的穩(wěn)定性和進(jìn)入靶細(xì)胞之后的生物響應(yīng)性。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種中間體，結(jié)構(gòu)式為
權(quán)利要求
1. 一種中間體，其特征在于，結(jié)構(gòu)式為:
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述中間體制得的可降解酰胺類(lèi)聚陽(yáng)離子，其特征在于，結(jié)構(gòu)式為
3.一種制備根據(jù)權(quán)利要求2所述的可降解酰胺類(lèi)聚陽(yáng)離子的方法，其特征在于，包括如下步驟a、在15 30°C，將組氨酸與丁二酸酐溶解在液態(tài)有機(jī)酸溶液中，攪拌、合成如權(quán)利要求1所述的中間體；b、在25 40°C條件下，將中間體、N,N' - 二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺以 1:2: 5的摩爾比在無(wú)水N、N-二甲基甲酰胺中反應(yīng)，然后注入溶于N、N-二甲基甲酰胺的PEI，所述PEI與中間體的摩爾比為0. 5 2，在15 30°C下縮合反應(yīng)，得產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可降解亞胺類(lèi)聚陽(yáng)離子的制備方法，其特征在于，步驟a中所述組氨酸與丁二酸酐為等物質(zhì)的量，所述液態(tài)有機(jī)酸為乙酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可降解亞胺類(lèi)聚陽(yáng)離子的制備方法，其特征在于，步驟b中所述在無(wú)水N、N- 二甲基甲酰胺中反應(yīng)的時(shí)間為30 80min。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可降解亞胺類(lèi)聚陽(yáng)離子的制備方法，其特征在于，步驟b中所述PEI與中間體的摩爾比為1。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可降解亞胺類(lèi)聚陽(yáng)離子的制備方法，其特征在于，所述產(chǎn)物進(jìn)一步分離純化，步驟如下將所述產(chǎn)物置于透析袋透析后低溫凍干真空除去水。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的可降解亞胺類(lèi)聚陽(yáng)離子的制備方法，其特征在于，所述透析袋的分子量為10000 ；所述透析的時(shí)間為20 30小時(shí)。
9.一種納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒由包括如下步驟的方法制備而得a、將權(quán)利要求2所述的可降解酰胺類(lèi)聚陽(yáng)離子加超純水、生理鹽水、PBS或DEPC配置成聚陽(yáng)離子溶液，將核酸物質(zhì)加超純水、生理鹽水、PBS或DEPC配置成核酸物質(zhì)溶液；b、將所述聚陽(yáng)離子溶液快速加入到核酸物質(zhì)溶液中，混合；c、將混合溶液于室溫下孵育，即得所述納米顆粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的納米顆粒，其特征在于，所述核酸物質(zhì)為DNA或RNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可降解酰胺類(lèi)聚陽(yáng)離子及其制備方法、納米顆粒。本發(fā)明用低分子量的PEI與組氨酸構(gòu)建和降解回到低分子量的PEI的起始狀態(tài)的聚陽(yáng)離子，該聚陽(yáng)離子的制備方法為組氨酸與丁二酸酐在冰醋酸為溶劑的條件下開(kāi)環(huán)反應(yīng)，得到含有兩個(gè)羧酸基團(tuán)的中間體；然后將中間體與等物質(zhì)的量的精胺通過(guò)縮合反應(yīng)得到目標(biāo)化合物。本發(fā)明不僅可以降解，而且在降解過(guò)程中釋放出含未質(zhì)子化的氨基的低分子量PEI，而且它們的降解產(chǎn)物不會(huì)像其他可降解的聚合物那樣產(chǎn)生酸性基團(tuán)；能夠有助于逃逸溶酶體，在低表面電荷的細(xì)胞質(zhì)中釋放基因；對(duì)于質(zhì)子海綿效應(yīng)，溶酶體是由于質(zhì)子海綿效應(yīng)產(chǎn)生的滲透壓破裂的，聚陽(yáng)離子的氨基鍵起質(zhì)子海綿作用。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102516178SQ20111035915
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者杜子秀, 段詩(shī)悅, 臧怡, 金拓 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)