專利名稱：轉(zhuǎn)基因大豆子葉rna和dna的同步抽提方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因大豆子葉的RNA和DNA的同步分離純化，具體說是使用不同蛋 白變性劑和氯化鋰(LiCl)同步抽提轉(zhuǎn)基因大豆子葉RNA和DNA的方法。
背景技術(shù)：
大豆是極重要的一種經(jīng)濟作物，富含優(yōu)質(zhì)蛋白、不飽和脂肪酸、鈣質(zhì)和保健因子。 除了直接食用外，大豆還可以制成豆腐、豆油、醬油、豆瓣醬、大豆蛋白和磷脂等加工品。隨 著食用油和植物蛋白需求量的不斷增加和大豆應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴大，大豆栽培和加工已逐 步成為重要的支柱產(chǎn)業(yè)。隨著大豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，在分子生物學(xué)領(lǐng)域開展大豆品質(zhì)、產(chǎn)量及功能性食品的研 發(fā)等相關(guān)研究顯得尤為重要。核酸抽提是上述研究的必要且重要的一步，因為核酸質(zhì)量對 后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄、PCR、限制性內(nèi)切酶酶切、Northern雜交、文庫構(gòu)建等諸多實驗都有顯著影 響。在核酸抽提上已有一些相關(guān)的技術(shù)報道，例如在DNA抽提技術(shù)上有CTAB (十六烷 基三甲基溴化銨)法、SDS (十二烷基磺酸鈉)-蛋白酶K法、LiCl法等，在RNA抽提技術(shù)上 有CTAB法、異硫氰酸胍法以及改進的TRIZOL法等。不同生物或不同組織的細胞組分和次 級代謝產(chǎn)物不盡相同，因此不同材料需要不同的核酸抽提方法。目前尚無轉(zhuǎn)基因大豆子葉 RNA和DNA同步抽提方法的報道。通常轉(zhuǎn)基因大豆的分子檢測是以葉片為材料，分別獨立抽提轉(zhuǎn)基因大豆葉片的 RNA和DNA，需要較多樣品、試劑和工序，而同步抽提RNA和DNA既能節(jié)約材料又能節(jié)約時 間。以子葉代替葉片做核酸分析還能提早對轉(zhuǎn)基因大豆是否獲得外源基因以及外源基因是 否表達進行檢測。所以有必要研發(fā)適合轉(zhuǎn)基因大豆子葉RNA和DNA同步抽提的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適用于轉(zhuǎn)基因大豆子葉RNA和DNA同時抽提的方 法，實驗簡便、省時、省料，實驗結(jié)果理想。獲得的高純度的核酸可以用于PCR、RT - PCR, Northern雜交、限制性內(nèi)切酶酶切、文庫構(gòu)建等后續(xù)實驗。經(jīng)過多次實驗探索，得出符合此目的的實驗方法，各種方法及其具體步驟如下 (1)使用含蛋白變性劑(如SDS、異硫氰酸胍或CTAB中的一種或多種試劑)的偏堿性(pH
范圍7. (Γ8. 5)裂解液裂解樣品；
⑵加入等體積的Tris飽和苯酚/氯仿(體積比=1:1)，混勻，離心后取上清；
⑶加入等體積氯仿，混勻，離心后取上清；
⑷加入LiCl (終濃度為廣3mol/L)，離心后RNA沉淀在管底；
⑶轉(zhuǎn)移第⑷步的上清至新管，加入乙醇(終濃度為659Γ70%(體積比))，離心后得到DNA 沉淀；
(6) DNA沉淀經(jīng)漂洗后，溶于含RNase A水中；[7]RNA溶液中加入DNase I處理，然后常規(guī)苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀經(jīng)漂洗后， 于適量RNase-free水中溶解，此步為可選做步驟。
具體實施例方式方案一 SDS裂解與LiCl選擇沉淀
(1)100 mg新鮮樣品液氮研磨，加入1 mL SDS裂解液(0.1 mol/L Tris-Cl (pH8. 0)， 0. 5mol/L NaCl，0. 05 mol/L EDTA, 1. 5% (w/v) SDS)，室溫放置 10 min ；
⑵加入等體積的iTris飽和酚(PH8. 0)與氯仿混合液(體積比=1:1)混勻，12000 rpm離 心5min后取上清；
⑶加入等體積的氯仿并混勻，12000 rpm離心5min后取上清；
(4)加入 1/4 體積 10 mol/L LiCl，靜置 30 min, 12000 rpm 離心 10 min 后 RNA 沉淀在管
底；
⑶轉(zhuǎn)移第⑷步的上清至新管，加入2倍體積的無水乙醇，12000 rpm離心5 min后得到 DNA沉淀；
(6)RNA和DNA沉淀分別用75%乙醇漂洗，室溫干燥；
(7)RNA沉淀溶于適量RNase-free水，-70 °C保存，備用；
(8)DNA沉淀溶于含RNaseA水中，37 °C溫浴30min，-20 °C保存，備用；
⑶經(jīng)1.0%非變性瓊脂糖電泳檢測RNA和DNA，電泳條帶清晰完整，無明顯拖帶， 點樣孔無明顯殘留；通過Bio-red核酸蛋白定量儀測得DNA的^0/230=2. (Γ2. 4， 260/280=1. 8 2. 0，RNA 的 260/230=2. 0 2. 5,260/280=1. 9 2. 0。方案二 異硫氰酸胍裂解與LiCl選擇沉淀
⑴100 mg新鮮樣品液氮研磨，加入1 mL異硫氰酸胍裂解液(0. 1 mol/L Tris-Cl (pH8. 0),0. 5mol/L NaCl,0. 05 mol/L EDTA，1 mol/L 異硫氰酸胍)，室溫放置 10 min ；
⑵加入等體積的iTris飽和酚(PH8. 0)與氯仿混合液(體積比=1:1)混勻，12000 rpm離 心5min后取上清；
⑶加入等體積的氯仿并混勻，12000 rpm離心5min后取上清；
(4)加入 1/4 體積 10 mol/L LiCl，靜置 30 min, 12000 rpm 離心 10 min 后 RNA 沉淀在管
底；
⑶轉(zhuǎn)移第⑷步的上清至新管，加入2倍體積的無水乙醇，12000 rpm離心5 min后得到 DNA沉淀；
(6)RNA和DNA沉淀分別用75%乙醇漂洗，室溫干燥；
(7)RNA沉淀溶于適量RNase-free水，-70 °C保存，備用；
(8)DNA沉淀溶于含RNaseA水中，37 °C溫浴30min，-20 °C保存，備用；
⑶經(jīng)1.0%非變性瓊脂糖電泳檢測RNA和DNA，電泳條帶清晰完整，無明顯拖帶， 點樣孔無明顯殘留；通過Bio-red核酸蛋白定量儀測得DNA的^0/230=2. (Γ2. 4， 260/280=1. 8 2. 0，RNA 的 260/230=2. 0 2. 5,260/280=1. 9 2. 0。方案三CTAB裂解與LiCl選擇沉淀
(1)100 mg 新鮮樣品液氮研磨，加入 1 mL CTAB 裂解液(0.1 mol/L Tris-Cl (pH8. 0)， 1.4 mol/L NaCl,0. 05 mol/L EDTA, 2% (w/v) CTAB)，室溫放置 10 min ；⑵加入等體積的iTris飽和酚(PH8. 0)與氯仿混合液(體積比=1:1)混勻，12000 rpm離 心5min后取上清；
⑶加入等體積的氯仿并混勻，12000 rpm離心5min后取上清；
(4)加入 1/4 體積 10 mol/L LiCl，靜置 30 min，12000 rpm 離心 10 min 后 RNA 沉淀在管
底；
⑶轉(zhuǎn)移第⑷步的上清至新管，加入2倍體積的無水乙醇，12000 rpm離心5 min后得到 DNA沉淀；
(6)RNA和DNA沉淀分別用75%乙醇漂洗，室溫干燥；
(7)RNA沉淀溶于適量RNase-free水，加入DNase I處理；
⑶常規(guī)苯酚/氯仿抽提，取上清；加入0. 1倍體積2 mol/L NaCl和2倍體積的無水乙 醇，12000 rpm離心10 min后獲得RNA沉淀；RNA沉淀用75%乙醇漂洗，室溫干燥，適量RNase-free水溶解沉淀，-70 °C保存，備
用；DNA直接溶于含RNaseA水中，37 °C溫浴30min，-20 °C保存，備用；經(jīng)1.0%非變性瓊脂糖電泳檢測RNA和DNA，電泳條帶清晰完整，無明顯拖 帶，點樣孔無明顯殘留；通過Bio-red核酸蛋白定量儀測得DNA的^0/230=2. (Γ2. 4， 260/280=1. 8 2. 0，RNA 的 260/230=2. 0 2. 5,260/280=1. 85 2. 0。
權(quán)利要求
1.大豆子葉總RNA和DNA同步抽提試劑中主要包括蛋白變性劑、環(huán)境PH緩沖劑、DNase 活性抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸抽提試劑，其特征在于蛋白變性劑分別為SDS(十二烷 基磺酸鈉)、異硫氰酸胍或CTAB (十六烷基三乙基溴化銨)，各成分在各方案中的用量依次為 1 2% (w/v)、0. 5 1. 5 mol/L、1 2% (w/v)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸抽提試劑，其特征在于環(huán)境PH緩沖劑為Tris-Cl，防止 核酸被破壞，其PH值為7. 0 8· 5，濃度為0. 05 0. 2 mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸抽提試劑，其特征在于DNase活性抑制劑為EDTA，可螯 合Mg2+或Mn2+離子，其濃度為0. 0Γ0. 1 mol/L。
5.使用權(quán)利1所述的抽提試劑來同步抽提大豆子葉總RNA和DNA的方法，其抽提步驟 為使用含蛋白變性劑(如SDS、異硫氰酸胍或CTAB中的一種或多種試劑)的偏堿性(pH范 圍7. (Γ8. 5)裂解液裂解樣品；加入等體積的Tris飽和苯酚/氯仿(體積比=1:1)，混勻，離 心后取上清；加入等體積的氯仿，混勻，離心后取上清；加入LiCl (終濃度為廣3mol/L)，離 心后RNA沉淀在管底；繼續(xù)加入乙醇(終濃度為659Γ70%(體積比))，離心后得到DNA沉淀； DNA沉淀經(jīng)漂洗后，溶于含RNase A水中；向RNA溶液中加入DNase I處理，然后常規(guī)苯酚/ 氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀經(jīng)漂洗后，于適量RNase-free水中溶解，此步為可選做步驟。
全文摘要
在核酸抽提上已有一些相關(guān)的技術(shù)報道，但目前尚無轉(zhuǎn)基因大豆子葉RNA和DNA同步抽提方法的報道。本發(fā)明使用偏堿性SDS、異硫氰酸胍或CTAB裂解液裂解子葉，常規(guī)苯酚/氯仿抽提，用LiCl選擇性沉淀RNA，用乙醇繼續(xù)沉淀DNA，沉淀的DNA用RNaseA處理，最后得到高質(zhì)量的核酸。同步抽提既能節(jié)約樣品、試劑、又能節(jié)約時間。對子葉做核酸分析能夠在大豆剛出苗時對經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大豆進行分子檢測，提早確定是否將外源基因?qū)氪蠖挂约巴庠椿蚴欠癖磉_。
文檔編號C12N15/10GK102146376SQ201110132090
公開日2011年8月10日 申請日期2011年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月21日
發(fā)明者周向紅, 易樂飛, 王萍 申請人:周向紅, 易樂飛, 王萍