專利名稱：一種新型三角形銀－硫化銀納米復(fù)合顆粒的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種貴金屬納米復(fù)合顆粒的制備方法及其在制備寡核苷酸探針中的應(yīng)用，尤其涉及一種三角形銀-硫化銀納米復(fù)合顆粒的制備方法及其在制備寡核苷酸探針中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
貴金屬納米顆粒(如金和銀納米顆粒)，在催化、光學(xué)和生物傳感中具有潛在的廣泛應(yīng)用前景。對(duì)金屬納顆粒的研究，尤其是對(duì)其形貌可控制備及相應(yīng)性質(zhì)和應(yīng)用的研究，一直是材料科學(xué)以及相關(guān)領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)。因三角形銀納米顆粒具有獨(dú)特的表面質(zhì)子共振(SPR)性質(zhì)-其具有三個(gè)明顯的SPR峰，即面外四極、面內(nèi)四極和面內(nèi)雙極共振峰，且這種性質(zhì)與它的尺寸和形狀密切相關(guān)。因此，對(duì)于三角銀納米顆粒的研究吸引了越來(lái)越多的人們的注意力。其中一個(gè)重要的應(yīng)用是三角形銀納米顆粒與生物分子的直接功能化得到相應(yīng)的生物納米探針。然而，三角形銀納米顆粒具有很高的表面能量，特別是在尖角和邊緣處，此處的Ag原子極容易被氧化。這種氧化作用會(huì)導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)中尖角的塌陷或是結(jié)構(gòu)的整體溶解，SPR峰移動(dòng)甚至消失。這使得三角形銀納米顆粒幾乎不可能直接應(yīng)用于生物領(lǐng)域。為了實(shí)現(xiàn)其進(jìn)一步的應(yīng)用，需要提高不同環(huán)境中三角形銀納米顆粒的穩(wěn)定性。盡管硫醇和二氧化硅的鈍化層可以用于三角形銀納米顆粒的保護(hù)及提高他們的穩(wěn)定性，但這些方法具有以下缺點(diǎn)I)過(guò)程復(fù)雜繁瑣；2)鈍化的基團(tuán)會(huì)影響生物分子的穩(wěn)定性和檢測(cè)分子的SPR靈敏度。因此，需要找到一種既能保持三角形銀納米顆粒穩(wěn)定性，又不影響其化學(xué)與生物識(shí)別靈敏度的方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種以三角形銀納米顆粒為原料制備三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒及其寡核苷酸探針的制備方法。本發(fā)明的特點(diǎn)是簡(jiǎn)單和快速，并且具有很好的重現(xiàn)性。并進(jìn)一步通過(guò)三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒表面的Ag2S與巰基修飾的寡核苷酸(HS-DNA)偶聯(lián)制備出相應(yīng)的寡核苷酸探針。為了達(dá)到上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明提供一種新型三角形銀-硫化銀納米復(fù)合顆粒，其中包含三角形銀納米顆粒，其特征在于其是由三角形銀納米顆粒與硫化物直接反應(yīng)制備而來(lái)，在三角形銀納米顆粒的表面覆蓋有硫化銀形成的保護(hù)層。所述的硫化銀可直接與巰基修飾的寡核苷酸相偶聯(lián)制備相應(yīng)的寡核苷酸探針。其制備方法包括以下步驟(I)制備聚乙烯吡咯烷酮(PVP)保護(hù)的三角形銀納米顆粒；(2)避光條件下在步驟⑴的溶液中快速加入硫化物的水溶液，恒溫保持20-35 °C，攪拌 5-30 分鐘。、
其中步驟(I)可以采用現(xiàn)有的方法，例如Adv Mater, 2005,17 (4) :412-415公開(kāi)的方法制備得到。其中步驟(2)中加入硫化物的水溶液，使得三角形銀納米顆粒與硫化物的摩爾比為 50 : 1-5 : I。其中步驟(2)中所用的硫化物為硫化鈉或硫化鉀。此外，本發(fā)明還提供了該新型三角形銀-硫化銀納米復(fù)合顆粒在制備寡核苷酸探針中的應(yīng)用方法，包括以下步驟(I)三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒用磷酸緩沖液洗滌；(2)室溫下，將三角形Ag-Ag2Sm米復(fù)合顆粒與巰基修飾的寡核苷酸(HS-DNA)和硼酸緩沖液混合，離心除去上清液；(3)沉淀用磷酸緩沖液洗滌，得到三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒寡核苷酸探針；(4)得到的三角形Ag-Ag2Sm米復(fù)合顆粒寡核苷酸探針重分散到磷酸緩沖液中，于4°C儲(chǔ)存。其中，步驟(I)所用磷酸緩沖液的pH值為7. 5-8. 5，含有濃度為O. 1-0. 2mol/L的NaCl ;優(yōu)選pH值為8.0，含有濃度為O. 15mol/L的NaCl。其中，步驟(3)和⑷中所用磷酸緩沖液的pH值為6. 5-7. 5，含有濃度為O. 1-0. 2mol/L 的 NaCl ;優(yōu)選 pH 值為 7. 0，含有濃度為 O. 15mol/L 的 NaCl。其中，步驟(2)中所用硼酸緩沖液的pH值為8. 5-9. 5，濃度為45-55mmol/L ;優(yōu)選pH值為9. 2，濃度為50mmol/L。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(I)提供了一種簡(jiǎn)單快速的合成新型的三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒的制備方法;(2)通過(guò)三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒表面的Ag2S與HS-DNA偶聯(lián)制備出相應(yīng)的寡核苷酸探針。利用本發(fā)明所制備的三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒制備寡核苷酸探針的過(guò)程省去了納米材料本身再修飾的過(guò)程，具有突出的簡(jiǎn)單方便的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明合成的新型三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒可用于DNA分子的檢測(cè)，其作為新型納米生物探針在生物傳感領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖I為本發(fā)明的三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒寡核苷酸探針制備示意圖。圖2為本發(fā)明一實(shí)施例制備的三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒的透射電子顯微鏡的圖片( Μ)。圖3為本發(fā)明一實(shí)施例制備的三角形Ag-Ag2S納米顆粒寡核苷酸探針與靶標(biāo)DNA的解鏈溫度示意圖。圖4為本發(fā)明又一實(shí)施例制備的三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒的透射電子顯微鏡的圖片(TEM)。圖5為本發(fā)明又一實(shí)施例制備的三角形Ag-Ag2S納米顆粒寡核苷酸探針與靶標(biāo)DNA的解鏈溫度示意圖。、
圖6為本發(fā)明另一實(shí)施例制備的三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒的透射電子顯微鏡的圖片(TEM)。圖7為本發(fā)明另一實(shí)施例制備的三角形Ag_Ag2S納米顆粒寡核苷酸探針與靶標(biāo)DNA的解鏈溫度示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒制備(I)參照文獻(xiàn)(Adv Mater, 2005，17 (4) =412-415.)的方法制備PVP保護(hù)的三角銀納米顆粒使用PVP和檸檬酸根作為穩(wěn)定劑和模版劑，避光攪拌條件下用NaBH4還原AgNO3制備出PVP保護(hù)的三角銀納米顆粒。(2)避光條件下在步驟(I)制備的三角銀納米顆粒溶液中快速加入lyLlmmol/L硫化鈉水溶液，三角銀納米顆粒和硫化鈉的摩爾比例約是10 I。恒溫25°C攪拌30分鐘，得到三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒。其形貌見(jiàn)附圖2。利用三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒制備寡核苷酸探針及其雜交性能測(cè)試實(shí)例模型寡核苷酸分子如下探針a : 5' -TCT-CAA-CTC-GTA-TTTT-SH-3'探針 b : 5' -SH-TTTT-CGC-ATT-CAG-GAT-3'靶標(biāo)DNA : 5' -TAC-GAG-TTG-AGA-ATC-CTG-AAT-GCG-3'(I)由圖I制備的三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒用磷酸緩沖液(PBS) (pH 8. O7NaClO. 15mol/L)洗漆。(2)室溫條件下，將步驟(I)的三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒與探針a和硼酸緩沖液(50mmol/L,pH 9.2)混合，離心除去上清液，沉淀用磷酸緩沖液(pH 7. O7NaCl O. 15mol/L)清洗。將得到的巰基寡核苷酸修飾的三角形Ag-Ag2Sm米顆粒(納米探針a)重分散到磷酸緩沖液中并于4°C儲(chǔ)存。(3)納米探針b通過(guò)同樣的方法與探針b反應(yīng)制備，重分散于磷酸緩沖液中并于4°C儲(chǔ)存。(4)將納米探針a和b與靶標(biāo)DNA混合，加熱到70°C以上10分鐘，自然冷卻，使用分光光度計(jì)對(duì)其解鏈溫度進(jìn)行檢測(cè)。見(jiàn)附圖3。實(shí)施例2 三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒制備制備方法和實(shí)例I基本相同；不同點(diǎn)在于步驟(2)中避光條件下在步驟I)制備的三角銀納米顆粒溶液中快速加入3 μ L 2mmol/L的硫化鈉水溶液，三角銀納米顆粒和硫化鈉的摩爾比例約是20 I。恒溫30°C攪拌15分鐘，反應(yīng)后得到三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒。其形貌見(jiàn)附圖4。利用三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒制備寡核苷酸探針及其雜交性能測(cè)試實(shí)例
模型寡核苷酸分子如下探針a : 5' -CAA-TCT-CTC-GTA-TTTT-SH-3'探針b : 5' -SH-TTTT-AGT-CAG-ATT-GAT-3'、
靶標(biāo)DNA : 5' -TAC-GAG-AGA-TTG-ATC-AAT-CTG-ACT-3'(I)由圖4制備的三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒用磷酸緩沖液(PBS) (pH 8. O7NaClO. 15mol/L)洗漆。(2)室溫條件下，將步驟(I)的三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒與探針a和硼酸緩沖液(50mmol/L,pH 9.2)混合，離心除去上清液，沉淀用磷酸緩沖液(pH 7. O7NaCl O. 15mol/L)清洗。將得到的巰基寡核苷酸修飾的三角形Ag-Ag2Sm米顆粒(納米探針a)重分散到磷酸緩沖液中并于4°C儲(chǔ)存。(3)納米探針b通過(guò)同樣的方法與探針b反應(yīng)制備，重分散于磷酸緩沖液中并于4°C儲(chǔ)存。(4)將納米探針a和b與靶標(biāo)DNA混合，加熱到60°C以上10分鐘，自然冷卻，使用分光光度計(jì)對(duì)其解鏈溫度進(jìn)行檢測(cè)。見(jiàn)附圖5。實(shí)施例3 三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒制備制備方法和實(shí)例I基本相同；不同點(diǎn)在于步驟(2)中避光條件下在步驟I)制備的三角銀納米顆粒溶液中快速加入2 μ L 3mmol/L的硫化鉀水溶液,三角銀納米顆粒和硫化鉀的摩爾比例約是30 I。恒溫20°C攪拌25分鐘，反應(yīng)后得到三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒。其形貌見(jiàn)附圖6。利用三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒制備寡核苷酸探針及其雜交性能測(cè)試實(shí)例模型寡核苷酸分子如下探針a : 5' -CAC-TCT-CTC-GTA-TTTT-SH-3'探針b : 5' -SH-TTTT-AGT-CAG-ATT-GAG-3'靶標(biāo)DNA : 5' -TAC-GAG-AGA-GTG-CTC-AAT-CTG-ACT-3'(I)由圖6制備的三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒用磷酸緩沖液(PBS) (pH 8. O7NaClO. 15mol/L)洗漆。(2)室溫條件下，將步驟(I)的三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒與探針a和硼酸緩沖液(50mmol/L,pH 9.2)混合，離心除去上清液，沉淀用磷酸緩沖液(pH 7. O7NaCl O. 15mol/L)清洗。將得到的巰基寡核苷酸修飾的三角形Ag-Ag2Sm米顆粒(納米探針a)重分散到磷酸緩沖液中并于4°C儲(chǔ)存。(3)納米探針b通過(guò)同樣方法與探針b反應(yīng)制備，重分散于磷酸緩沖液中并于4°C儲(chǔ)存。(4)將納米探針a和b與靶標(biāo)DNA混合，加熱到80°C以上5分鐘，自然冷卻，使用分光光度計(jì)對(duì)其解鏈溫度進(jìn)行檢測(cè)。見(jiàn)附圖7。本發(fā)明實(shí)施例1-3制備得到的三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒寡核苷酸探針相比于已報(bào)道的以三角銀為前軀體制備的寡核苷酸探針有著制備簡(jiǎn)便，容易重復(fù)的特點(diǎn)，而且從附圖3、5、7的解鏈溫度曲線上可以明顯看出來(lái)通過(guò)監(jiān)測(cè)吸光度的突變就可以得到很準(zhǔn)確的解鏈溫度數(shù)值，這說(shuō)明該探針在未來(lái)寡核苷酸檢測(cè)方面將是一種很理想的材料。權(quán)利要求
1.ー種三角形銀-硫化銀納米復(fù)合顆粒，其中包含三角形銀納米顆粒，其特征在于在三角形銀納米顆粒的表面覆蓋有硫化銀形成的保護(hù)層，所述硫化銀由三角形銀納米顆粒與硫化物直接反應(yīng)制備而來(lái)。
2.如權(quán)利要求I所述的三角形銀-硫化銀納米復(fù)合顆粒，其特征在于所述的硫化銀可直接與巰基修飾的寡核苷酸相偶聯(lián)制備相應(yīng)的寡核苷酸探針。
3.一種制備如權(quán)利要求I或2所述的三角形銀-硫化銀納米復(fù)合顆粒的方法，，其特征在于主要包括以下步驟 (1)制備聚こ烯吡咯烷酮(PVP)保護(hù)的三角形銀納米顆粒； (2)避光條件下在步驟(I)的溶液中快速加入硫化物的水溶液，恒溫保持20-35°C，攪拌5-30分鐘。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在干步驟(I)所述的三角形銀納米顆粒由現(xiàn)有方法(Adv Mater, 2005,17 (4) :412-415.)所制備。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在干所述步驟(2)中加入的硫化物的水溶液，使得三角形銀納米顆粒與硫化物的摩爾比為50 1-5 I。
6.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在干所述步驟(2)中所用的硫化物為硫化鈉或硫化鉀。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的三角形銀-硫化銀納米復(fù)合顆粒的應(yīng)用，是將其制備相應(yīng)的寡核苷酸探針，包括以下步驟 (1)三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒用磷酸緩沖液洗漆； (2)室溫下，將三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒與巰基修飾的寡核苷酸和硼酸緩沖液混合，離心除去上清液； (3)沉淀用磷酸緩沖液洗滌，得到三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒寡核苷酸探針； (4)得到的三角形Ag-Ag2S納米復(fù)合顆粒寡核苷酸探針重分散到磷酸緩沖液中，于4°C儲(chǔ)存。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟⑴所用磷酸緩沖液的pH值為7.5-8. 5，含有濃度為O. 1-0. 2mol/L的NaCl ;優(yōu)選pH值為8. O,含有濃度為O. 15mol/L的NaCl。
9.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，在步驟(3)和(4)中所用磷酸緩沖液的pH值為6. 5-7. 5，含有濃度為O. 1-0. 2mol/L的NaCl ;優(yōu)選pH值為7. 0，含有濃度為O. 15mol/L 的 NaCl。
10.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中所用硼酸緩沖液的pH值為.8.5-9. 5，濃度為 45-55mmol/L ;優(yōu)選 pH 值為 9. 2，濃度為 50mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新型三角形銀-硫化銀納米復(fù)合顆粒的制備方法及其在寡核苷酸探針合成中的應(yīng)用，其由三角形銀納米顆粒與硫化物直接反應(yīng)制備而來(lái)，在三角形銀納米顆粒的表面覆蓋有硫化銀形成的保護(hù)層。本發(fā)明還提供了所述納米復(fù)合顆粒的制備方法，其特點(diǎn)是過(guò)程簡(jiǎn)單快速，且合成的納米復(fù)合顆粒既能夠保持三角形銀納米顆粒的穩(wěn)定性，而又不影響其化學(xué)與生物識(shí)別的靈敏度，而且無(wú)需對(duì)納米顆粒進(jìn)行表面修飾，即可直接通過(guò)該三角形銀-硫化銀納米復(fù)合顆粒表面的硫化銀與巰基修飾的寡核苷酸探針相偶聯(lián)制備出相應(yīng)的生物納米探針，其過(guò)程簡(jiǎn)單快速，在生物傳感領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102672167SQ201110063379
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者劉兵, 韓景漫, 馬占芳 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)