專利名稱：一種有效降低人體膽固醇、血脂水平的脂肪酶及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明申請涉及一種能夠有效降低人體膽固醇、血脂水平的脂肪酶及其應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
脂肪酶，又稱甘油三酯水解酶，是一類能催化長鏈脂肪酸甘油酯水解的酶，也可以催化該反應的逆反應，許多微生物分泌的脂肪酶還可以催化酯化反應、酯交換反應、醇解反應、酸解反應以及氨解反應等。脂肪肝(Fatty Liver)作為一種病理學概念，系指肝內(nèi)脂肪含量超過肝濕重的 5%，或肝活檢1/3以上肝細胞有脂肪變性且彌漫分布于全肝。其對應的臨床概念是脂肪性肝病(Fatty Liver Disease, FLD)系指病變主體在肝小葉，以彌漫性肝細胞脂肪變(多為大泡性脂肪變)為病理特征的臨床綜合征。目前，按相關專業(yè)委員會的疾病診斷標準及有關共識可以明確的是1、脂肪性肝病在臨床上根據(jù)患者有無過量飲酒史，分酒精性脂肪性肝病(酒精性脂肪肝)和非酒精性脂肪性肝??；2、酒精性肝病臨床診斷通常分為輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化；3、非酒精性脂肪性肝病一般在病理上分為單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化三種類型。高膽固醇血癥和高脂血癥是目前廣泛存在于現(xiàn)代人的一種綜合病征，并且有逐漸年輕化的趨勢，它也是高血壓、冠心病和糖尿病的重要的危險因素。目前，在臨床上缺乏針對高膽固醇血癥和高脂血癥的有效的治療手段和藥物，常用的藥物的治療效果也不理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明申請即是針對上述不足之處，提供一種能夠應用于臨床，并且能夠有效降低人體膽固醇和血脂水平的脂肪酶。本發(fā)明申請的另一個目的是提供該種脂肪酶在制備降低人體膽固醇、血脂水平的藥物中的應用。具體來說，本發(fā)明申請所述的一種有效降低人體膽固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于所述的脂肪酶由以下的方法獲得1、獲得潮霉素抗性表達盒并克隆至目標質(zhì)粒上，獲得潮霉素抗性的重組質(zhì)粒；2、分別擴增青霉的脂肪酶基因(PEL)、構(gòu)巢曲霉的強啟動子3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(PgpdA)和構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶終止子(TtrpC)，得到有強啟動子驅(qū)動的PEL基因表達盒；3、將該PEL基因表達盒插入到潮霉素抗性的重組質(zhì)粒中，獲得了含潮霉素篩選標記的PEL基因超表達載體；4、將含潮霉素篩選標記的PEL基因超表達載體轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法將PEL基因表達盒轉(zhuǎn)化到青霉菌株中，獲得高表達脂肪酶的青霉基因工程菌；
5、將所述的青霉基因工程菌以菌絲體或孢子懸液接入種子培養(yǎng)基，在25-35°C、 200-300rpm條件下培養(yǎng)對小時后，以5% -20 %接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，在25-35 °C、 150-300rpm條件下發(fā)酵2天后，經(jīng)分離純化得到所述的脂肪酶。其中，獲得潮霉素抗性表達盒的方法包括PCR技術或限制性酶切技術。獲得青霉的脂肪酶基因(PEL)、構(gòu)巢曲霉的強啟動子3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子 (PgpdA)和構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶終止子(TtrpC)的方法包括PCR擴增或限制酶克隆或化學合成技術克隆。其中所述的青霉菌為擴展青霉。所述的目標質(zhì)粒為下列之一pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300 或 pHB。其中，所以培養(yǎng)基的成分如下1、種子培養(yǎng)基(% )黃豆餅粉 4，玉米淀粉 0. 8，Na NO3 0. 3，Na2HPO4 0. 2，K2SO4 0. 25，MgSO4 0. 03，F(xiàn)eSO4 0. 003 ；2、發(fā)酵培養(yǎng)基(% )黃豆餅粉 6，玉米淀粉 1，NaNO3 0. 4，Na2HPO4 0. 2，K2SO4 0. 3， MgSO4 0. 035，F(xiàn)eSO4 0. 02，CaCO3 0. 5，Na2CO3 0. 02。本發(fā)明申請所述的脂肪酶在制備降低人體膽固醇、血脂水平的藥物中的應用。


圖1為PV2+載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為pCAMBIA2300載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為pCAMBIA2302載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4 為 PMD18-T: :gpdA-Lip-TtrpC 載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖5 為 pCHAMBIA2302: PgpdA-Lip-TtrpC 最終載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖6為超表達載體pCHAMBIA2302 PgpdA-PEL-TtrpC的構(gòu)建路線圖；圖7為構(gòu)建的超表達載體pCHAMBIA2302: PgpdA-PEL-TtrpC的PCR鑒定圖譜；其中，1-6 獨立的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子、+ 陽性對照、-陰性對照、M :DL-2000Marker ；圖8為青霉轉(zhuǎn)基因菌株的PCR鑒定圖譜；其中，1-5 獨立的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子、+ 陽性對照、-陰性對照、M :DL-2000Markero
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明申請所述的本發(fā)明申請所述的一種有效降低人體膽固醇、血脂水平的脂肪酶進行進一步描述，目的是為了公眾更好的理解本發(fā)明的技術內(nèi)容，而不是對所述技術內(nèi)容的限制，事實上，在本發(fā)明精神實質(zhì)內(nèi)，對本發(fā)明申請所述方法的改進，目標質(zhì)粒和限制性內(nèi)切酶的替換都是本領域一般技術人員無需創(chuàng)造性的勞動即可獲得的，因此都在本發(fā)明申請所要求保護的技術方案之內(nèi)。實施例一、超表達載體的構(gòu)建采用如下的步驟(1)利用限制性內(nèi)切酶Mc I, Kpn I將潮霉素抗性表達盒從質(zhì)粒PV2+上酶切出來(如圖1所示)，片段經(jīng)凝膠回收，克隆到PCAMBIA2300質(zhì)粒(如圖2所示)的相應酶切位點上，獲得具有潮霉素抗性的重組質(zhì)粒pCHAMBIA2302(如圖3所示)；潮霉素表達盒也可來自其它含該序列的任何DNA或者直接合成，用于構(gòu)建PEL基因超表達載體的質(zhì)粒除PCAMBIA2300外，還可用能在絲狀真菌中表達的質(zhì)粒如pCAMBIA1300、pCAMBIA3300等 pCAMBIA系列載體和pHB載體；(2)根據(jù)擴展青霉菌P. expansium的脂肪酶基因PEL (AF330635)的序列設計引物 (正向引物:TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT下劃線的序列為限制性酶Spe I切點；反向引物:TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC下劃線的序列為限制件酶Not I切點)，利用 PCR 技術擴增全基因序列，PCR 反應條件為95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 90s, 35 個循環(huán)；72 °C IOmin ；(3)根據(jù)質(zhì)粒pPAN7_l(Punt et al. 1987 Gene 56 :117-124)的序列設計引物(正向引物GCTATCTGAGCTGATAAGCGGCCGCGGATCCACTTAACGTTA,下劃線的序列為限制性酶Not I 切點；反向引物:GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC,下劃線的序列為限制件酶PmeI切點)，利用PCR技術擴增出色氨酸合成酶終止子TtrpC，PCR反應條件為95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 60s，35 個循環(huán)；72°C IOmin ；(4)取(2)禾Π (3)的反應液各 1 μ L 作為模板，以(TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCA ATCTTT)作為正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作為反向引物，進行 PCR 擴增，PCR 的反應條件為95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s，72°C 150s，；35 個循環(huán)；72°C IOmin0反應結(jié)束后，將PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠柱回收，并克隆到PMD-18-T 載體，獲得中間載體 PMD-18-T: PEL-TtrpC ；(5)根據(jù)質(zhì)粒 pPAN7-l (Punt et al. 1987 Gene 56 :117-124 的序列設計引物(正向引物:GAGTCGAC GAATTCCCTTGTATCTCTACACAC下劃線的序列為限制性酶Not I切點；反向引物:GAACTAGTCTGCTCAAGCGGGGTAGCTGTTAGT下劃線的序列為限制性酶PmeI切點)利用PCR技術擴增強啟動子PgpdA。PCR反應條件為95°C 5min ;95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 150 35個循環(huán)；721 IOmin0利用限制性內(nèi)切酶Ml I和Spe I將PgpdA克隆到載體 PMD-18-T: PEL-TtrpC 的相應位點，獲得中間載體 PMD-18-T: :PgpdA-PEL_TtrpC(如圖 4 所示)；(6)利用限制內(nèi)切酶I和Rne I對載體PMD-18-T: PgpdA-PEL-TtrpC進行消化，回收表達盒PgpdA-PEL-TtrpC，然后克隆至pCHAMBIA2302相應位點，獲得最終載體 PCHAMBIA2302: :PgpdA-PEL_TtrpC(如圖5所示)，整個的構(gòu)建過程如圖6所示； (7)對含有最終載體pCHAMBIA2302 PgpdA-PEL-TtrpC的菌進行擴大培養(yǎng)， 并抽提質(zhì)粒，利用凍融法轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌EHA105，隨機挑選6株轉(zhuǎn)化子，以(TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作為正向引物；以(TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC)作為反向引物，以載體PMD-18-T: =PEL-TtrpC為陽性對照，空EHA105為陰性對照，對這6株菌進行PCR鑒定，結(jié)果顯示這6株菌均為陽性，見圖7。實施例二、青霉基因工程菌的獲得所述青霉基因工程菌的活動包括如下的步驟(1)挑取分離純化后的野生型青霉接種于PDA平板上，于培養(yǎng)20天左右，用無菌水洗下成熟孢子；(2)將實例一中含終載體 pCHAMBIA2302: PgpdA-PEL-TtrpC 的工程農(nóng)桿菌 EHA105接種于含有鏈霉素、卡那霉素(均為100μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中^°C，200rpm過夜培養(yǎng)，用含有鏈霉素和卡那霉素(均為100yg/ml)的MM培養(yǎng)基重新活化，28°C，220rpm培養(yǎng) 48小時。吸取適量的培養(yǎng)物5000rpm離心去上清，并用IM液體培養(yǎng)基洗滌，最后用IM液體培養(yǎng)基稀釋至0D600 = 0. 15，然后在^°C，220rpm的條件下培養(yǎng)6-8小時，至0D600 = 0. 5-0. 6 ；(3)將第(1)步得到的新鮮孢子配制成IX IO7個/mL濃度的懸浮液，隨后取上述孢子懸液與步驟O)中的工程農(nóng)桿菌等體積混合，取200 μ L均勻涂布到鋪有玻璃紙的IM 固體培養(yǎng)基(含AS 200yg/mL)之上二8°C共培養(yǎng)60h，然后將玻璃紙反鋪到含有潮霉素 (100 μ g/mL轉(zhuǎn)化選擇抗生素)、頭孢菌素(500 μ g/mL，抑制農(nóng)桿菌生長抗生素)的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，揭下玻璃紙，在條件下培養(yǎng)1-3天，將抗潮霉素的轉(zhuǎn)化子挑出接種到二篩培養(yǎng)基上，如穩(wěn)定傳代，即是所述的青霉基因工程菌，如此獲得了 30株青霉基因工程菌。隨機挑選5株轉(zhuǎn)化子進行擴大培養(yǎng)，并分別抽提基因組DNA，以(TGACTAGTATGTTG TTCAACTACCAATCTTT)作為正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作為反向引物，以載體PMD-18-T: :PEL-TtrpC為陽性對照，野生型青霉基因組DNA為陰性對照，對這 5株菌進行PCR鑒定，結(jié)果顯示這5株菌均為陽性，見圖8。MM培養(yǎng)基的成分如下所述IM K2HPO4-KH2PO4 (PH7. 0) IOmL, M-N (MgSO4 ‘ 7H20 30g/L, NaCl 15g/L)20mL，l % CaCl2 ·2Η20 111^，20%葡萄糖1011^，0.01% 6504 IOmL, Spore element (ZnSO4 ·7Η20 IOOmg/ L, CuSO4 · 5H20 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L, MnSO4 · H2O lOOmg/L, Na2MoO4 · 2H20 lOOmg/L) 5mL, 20% NH4NO3 2. 5mL，無菌水 941. 5mL。IM培養(yǎng)基的成分如下所述IM K-buf f er (PH4. 9) IOmL, M-N (MgSO4 ‘ 7H20 30g/L, NaCl 15g/L)20mL，l % CaCl2 ·2Η20 111^，20%葡萄糖1011^，0.01% 6504 IOmL, Spore element (ZnSO4 ·7Η20 IOOmg/ L, CuSO4 · 5H20 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L, MnSO4 · H2O lOOmg/L, Na2MoO4 · 2H20 lOOmg/L) 5mL, 20% NH4NO3 2. 5mL，50%甘油 10mL，IM MES (PH5. 5)40mL, IOOmM AS(乙酰丁香酮)2mL，無菌 7jC 898. 7mLCM培養(yǎng)基加一半IM培養(yǎng)基的葡萄糖量，外加1. 5%瓊脂，其它成份同IM培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基(g/L)馬鈴薯，200 ；蔗糖，20 ；瓊脂，15 ；PH自然。實施例三、產(chǎn)脂肪酶能力對比實驗隨機挑選實例2所得的青霉基因工程菌接種到PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10天后分別接入種子培養(yǎng)基50mL中，在^°C，210rpm搖床培養(yǎng)Mh，然后以10%的接種量分別轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基Q50mL三角瓶裝30mL發(fā)酵培養(yǎng)基)，在，210rpm條件下發(fā)酵48h ；然后將發(fā)酵液離心，取上清液進行脂肪酶活力檢測。利用酸堿滴定法對脂肪酶活力進行檢測。步驟取IOOmL三角瓶20只，分別加入4. OmL ρΗ9· 4的Gly-NaOH緩沖液和5. OmL橄欖油乳化液；放入震蕩恒溫水浴鍋36°C水浴鍋預熱5分鐘.酶液過濾后，用0.05mol/L pH9. 4 的Gly-NaOH緩沖液稀釋使酶活為4_5u/mL后測定。往其中兩個各加入ImL稀釋好的酶液，緩慢振蕩(60次/min) 10分鐘(精確計時).另外兩瓶做空白對照.立即加入95%酒精20mL(空白對照加入ImL稀釋好的酶液)，搖勻，加入10mL30%的氯化鈉溶液，搖勻；用 0. Olmol/LNaOH溶液滴定樣品使其與空白對照的pH相同，記下0. Olmol/LNaOH用量。計算X = AXBXl/TXn式中 X—樣品的酶活力(u/g或u/mL)；A——滴定樣品時消耗標準0. Olmol/LNaOH的體積(mL)；B——滴定用NaOH的濃度(μ mol/mL)T——酶促反應時間(min)，η—稀釋倍數(shù)；同時做兩份平行，結(jié)果取平均值，所得結(jié)果表示至整數(shù)。平行試驗相對誤差不得超過 5.0%。PDA培養(yǎng)基(g/L)馬鈴薯，200 ；蔗糖，20 ；瓊脂，15 ；PH自然種子培養(yǎng)基(%)黃豆餅粉 4，玉米淀粉 0. 8，Na NO3 0. 3，Na2HPO4 0. 2，K2SO4 0. 25，MgSO4 0. 03，F(xiàn)eSO4 0. 003發(fā)酵培養(yǎng)基(%)黃豆餅粉 6，玉米淀粉 1，NaNO3 0. 4，Na2HPO4 0. 2，K2SO4 0. 3， MgSO4 0. 035，F(xiàn)eSO4 0. 02，CaCO3 0. 5，Na2CO3 0. 02橄欖油乳化液的制取4% PVA溶液和橄欖油為2 1 (ν/ν)，放到小三角瓶里(外包冰塊)，調(diào)整為轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分，一次乳化3分鐘，間隔3分鐘，共乳化3次。轉(zhuǎn)基因青霉和非轉(zhuǎn)基因青霉的酶活力測定結(jié)果見下表
菌林編號WTTlT2T3T4T5酶活力 (IU/mL)3100 + 155320 + 305210 + 256130 + 405460 + 455750 + 50其中，WT為青霉野生型菌株，Tl，Τ2，Τ3，Τ4，Τ5 為獨立的青霉轉(zhuǎn)化子，由圖可知， 轉(zhuǎn)基因青霉的酶活力顯著高于非轉(zhuǎn)基因青霉的酶活力。實施例四、所述脂肪酶防治大鼠非酒精性脂肪肝實驗研究一、試驗材料1.受試藥物及試劑脂肪酶(ZFM)受試藥，0. 4g/粒，每瓶40粒，每人每次3 4粒，一日3次，由中國醫(yī)藥工業(yè)科研開發(fā)促進會提供，批號081223。成人(以60Kg體重計算)日用藥量為4800mg， 即人每日每千克體重用量為80mg/kg。實驗時先用適量吐溫研磨，再用0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC)按設計濃度配制。陽性藥易善復(多烯磷脂酰膽堿膠囊)，228mg/粒，2粒/次，3次/d，M粒/盒。 塞諾菲安萬特(北京)制藥有限公司，批號D8139，國藥準字H20059010。實驗時先用適量吐溫研磨，再用0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC)按設計濃度配制。膽固醇(分析純級)，成都科龍化工試劑廠，批號20071229 ；吐溫_80(化學純)，成都科龍化工試劑廠，批號:20050402 ；膽酸鈉(Sodium Taurochlate)，上海Solarbio, 批號20060826 ；丙硫氧嘧啶片，50mg/片X 100片/瓶，上海復星朝暉藥業(yè)有限公司，批號071105，國藥準字H31021082，1,2丙二醇(分析純)，天津市大茂化學試劑廠，批號 20051128 ；羧甲基纖維素鈉，上海三浦化工有限公司，批號20010911。2.實驗分組及劑量設計劑量分組見表1表1大鼠脂肪肝試驗劑量與分組
權利要求
1.一種有效降低人體膽固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于所述的脂肪酶由以下的方法獲得(1)獲得潮霉素抗性表達盒并克隆至目標質(zhì)粒上，獲得潮霉素抗性的重組質(zhì)粒；(2)分別擴增青霉的脂肪酶基因(PEL)、構(gòu)巢曲霉的強啟動子3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(PgpdA)和構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶終止子(TtrpC)，得到有強啟動子驅(qū)動的PEL基因表達盒；(3)將該PEL基因表達盒插入到潮霉素抗性的重組質(zhì)粒中，獲得了含潮霉素篩選標記的PEL基因超表達載體；(4)將含潮霉素篩選標記的PEL基因超表達載體轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法將PEL基因表達盒轉(zhuǎn)化到青霉菌株中，獲得高表達脂肪酶的青霉基因工程菌；(5)將所述的青霉基因工程菌以菌絲體或孢子懸液接入種子培養(yǎng)基，在25-35°C、 200-300rpm條件下培養(yǎng)對小時后，以5% -20 %接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，在25-35 °C、 150-300rpm條件下發(fā)酵2天后，經(jīng)分離純化得到所述的脂肪酶。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種有效降低人體膽固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于 其中所述的青霉菌為擴展青霉菌。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種有效降低人體膽固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于 所述的目標質(zhì)粒包括 pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300 或 pHB。
4.權利要求1所述的脂肪酶在制備降低人體膽固醇、血脂水平的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明申請?zhí)峁┮环N能夠有效降低人體膽固醇、血脂水平的脂肪酶及其在制備抗高膽固醇血癥和高脂血癥的藥物中的應用，通過高脂乳液灌胃大鼠，造成大鼠非酒精單純性脂肪肝模型，考查該脂肪酶對大鼠非酒精單純性脂肪肝的防治作用，結(jié)果表明，脂肪酶劑量組和模型對照組比較，可顯著降低ALT活性及肝組織甘油三酯含量，同時也可減輕肝脂肪變性的程度，具有推廣應用的價值。
文檔編號C12N15/55GK102154238SQ20111000058
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月4日 優(yōu)先權日2011年1月4日
發(fā)明者曹勇, 王劍英 申請人:深圳市綠微康生物工程有限公司