專利名稱：一種陸地棉hb紅花種質(zhì)材料的pcr鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種基于PCR技術(shù)的針對(duì)陸地棉HB紅花 品種或品系所具有的紅花性狀進(jìn)行早期快速鑒定的分子生物學(xué)方法。
背景技術(shù)：
棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)我國(guó)紡織工業(yè)的原料供應(yīng)安全和農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重 要的意義。常規(guī)陸地棉花色一般為白色或乳白色花冠。陸地棉HB紅花品系則是利用陸地棉 (Gossypium hirsutum L.)與野生二倍體比克氏棉(Gossypiumbickii)遠(yuǎn)緣雜交獲得的具 有來(lái)自比克氏棉的HB(Hirsutum-Bickii)紅花性狀的后代材料HB321作為HB紅花性狀供 體，用豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗蟲(chóng)的農(nóng)藝性狀優(yōu)良的棉花品種魯棉研16號(hào)、17號(hào)、22號(hào)、28號(hào)、抗 蟲(chóng)棉品系5A58、118和20R37等作輪回親本，自2000年起進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育遺傳改良，2006年獲 得具有HB紅花性狀的新種質(zhì)材料，即陸地棉HB紅花品系，其表現(xiàn)為花瓣粉紅色，具有紫紅 色大基斑，是人工合成的新種質(zhì)資源。針對(duì)這些HB紅花陸地棉品種和品系，田間鑒定方法 主要是在花蕾期通過(guò)觀察花色進(jìn)行鑒定，這種方法較費(fèi)時(shí)費(fèi)工，占用土地，且需要經(jīng)過(guò)2-3 個(gè)月的生長(zhǎng)期。為了對(duì)其提供更完善更便捷的技術(shù)支持和品種保護(hù)，需要開(kāi)發(fā)在棉花生長(zhǎng) 發(fā)育早期在室內(nèi)進(jìn)行的快速簡(jiǎn)便的鑒定手段。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以DNA為基礎(chǔ)的PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法，具有 遺傳穩(wěn)定、不受外界環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，目前已應(yīng)用于農(nóng)作物品種鑒定與純度鑒定。在農(nóng) 產(chǎn)品領(lǐng)域，已有利用PCR法對(duì)豌豆、菜豆品種進(jìn)行鑒定，而作為重要農(nóng)作物的棉花，目前還 未見(jiàn)有關(guān)針對(duì)標(biāo)記性狀進(jìn)行分子鑒定的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，在棉花中利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增 產(chǎn)物的分析可以快速鑒定目標(biāo)材料是否來(lái)源于陸地棉HB紅花品種或品系。它首次針對(duì)陸 地棉HB紅花品種或品系，利用PCR鑒定手段進(jìn)行快速驗(yàn)證，具有穩(wěn)定性好、不受環(huán)境條件影 響等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)對(duì)現(xiàn)有性狀標(biāo)記材料及品種性狀保護(hù)及種子純度檢測(cè)工作的不足，從 而為種子遺傳純度的快速鑒定建立起高效準(zhǔn)確的質(zhì)量控制方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種陸地棉HB紅花種質(zhì)材料的PCR鑒定方法，其特征是，利 用一對(duì)特異性引物對(duì)陸地棉的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果來(lái) 判斷是否來(lái)源于HB紅花陸地棉種質(zhì)材料。包括以下步驟(1)提取待鑒定的陸地棉材料的基因組DNA ；(2)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，序列為弓丨物 PF (左端引物)5，-GCCGAAACTTCCCATCTC-3，引物 PR (右端引物)5，-CACCAAAGCGAACTAACG-3，以提取的陸地棉材料的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
3
(3)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳判定結(jié)果，如果具有長(zhǎng)度為330bp擴(kuò)增條帶(如圖 1、2所示)的即來(lái)源于HB紅花陸地棉種質(zhì)材料，如果不具有該擴(kuò)增條帶的樣品則非HB紅花 陸地棉種質(zhì)材料。上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳步驟包括本發(fā)明中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μ 1，其中含基因組DNA 50 200ng，10XPCR buffer (含 1. 5mM MgCl2) 2 μ 1,200 μ M dNTP，0. 25 μ M 引物 PF，0· 25 μ M 引物 PR, 0. 5U Taq ； PCR 反應(yīng)在 PCR 儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 5min ；94°C 30s, 55°C lmin，72°C lmin，35 個(gè)循 環(huán)；72°C IOmin ；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 XTAE瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀觀察并拍照。擴(kuò)增出 330bp譜帶的鑒定為來(lái)源于陸地棉HB紅花種質(zhì)材料，未擴(kuò)增出330bp譜帶的鑒定為非陸地 棉HB紅花種質(zhì)材料。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)了一個(gè)新的特異引物，能夠擴(kuò)增到陸地棉HB紅花種質(zhì)材料的紅 花性狀密切相關(guān)的關(guān)鍵譜帶，且?guī)颓逦?、重?fù)性好、可靠性強(qiáng)，可作為陸地棉HB紅花種質(zhì) 材料鑒定的特異引物。本發(fā)明引物的應(yīng)用，具有準(zhǔn)確性高、結(jié)果穩(wěn)定、不受環(huán)境條件和發(fā)育時(shí)期的影響等 特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定出陸地棉HB紅花種質(zhì)材料及其純度。本發(fā)明可用于陸地棉HB紅花種質(zhì)商品種子的快速室內(nèi)鑒定，在早期就可以通過(guò) PCR方法進(jìn)行鑒定，加強(qiáng)了對(duì)陸地棉HB紅花種質(zhì)資源的保護(hù)，有利于提高陸地棉HB紅花種 質(zhì)商品種子高效準(zhǔn)確的質(zhì)量控制，加快了商品種子的質(zhì)量檢測(cè)進(jìn)程。


圖1為魯HB22紅花陸地棉純系及其白花近等基因系單株雜交獲得的F2代分離群 體的 PCR 電泳圖譜(M IOOObp Ladder Marker ； 1，4，5，6，9-16 魯HB22 紅花單株；2，3，7，8 魯HB22白花近等基因系單株；一鑒定HB紅花性狀的特異性譜帶，330bp)圖2為魯HB118系紅花陸地棉、HB28系紅花陸地棉及其白花近等基因系單株的 PCR電泳圖譜(NC 陰性PCR對(duì)照；M =IOOObp Ladder Marker ； 1-4 魯HBl 18系不同紅花品 系單株；5 魯118系白花近等基因系單株；6-13 魯HB28系不同紅花品系單株；14 魯28系 白花近等基因系單株；一=HB紅花性狀緊密相關(guān)的特異性譜帶，330bp)
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)材料為由1個(gè)魯HB22單株與1個(gè)其白花近等基因系單株雜交？工 代紅花株自交得到F2代分離群體1-16，能夠分離出HB紅花與白花株，鑒定該群體中具有HB 紅花性狀的單株。方法提取棉花葉片的DNA，特定擴(kuò)增弓I物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳， 觀察電泳譜帶結(jié)果。1、棉花基因組DNA提取(1)將目標(biāo)材料種子置于發(fā)芽盒中30°C光照培養(yǎng)一周，發(fā)出真葉后即可提取基因
4組 DNA。(2)取0. Ig新發(fā)幼葉，在液氮中研磨成粉狀，轉(zhuǎn)入1.5ml小管，加入65°C預(yù)熱的 2% CTAB 溶液(具體配方內(nèi)含 1. 4M NaCl, 0. IM Tris-HCl, 20mM Na2EDTA, 2% (質(zhì)量比) CTAB,2% PVP，1 % (體積比)β -巰基乙醇)600 μ 1，劇烈振蕩混勻后，65°C水浴加熱30min 至2h ；(3)加等體積氯仿_異戊醇(體積比24 1)，顛倒混勻，室溫12000rpm離心 20min ；(4)吸取上清到新管，加入0.8倍體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，出現(xiàn)絮狀DNA 沉淀；(5)挑出絮狀DNA，70%乙醇洗滌2次；(6)干燥DNA，用TE溶液或者超純水溶解后備用，保存于4°C或-20°C。2、分子標(biāo)記分析PCR 反應(yīng)體系為 20 μ 1，其中含基因組 DNA 50 200ng，10XPCR buffer (含 1. 5mM MgCl2) 2 μ 1,200 μ M dNTP，0. 25 μ M 引物 PF，0· 25 μ M 引物 PR，0. 5U Taq ；PCR 反應(yīng)在 PCR 儀 上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 5min ；94°C 30s, 55°C lmin,72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；擴(kuò) 增產(chǎn)物經(jīng)IXTAE瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀觀察并拍照。3、根據(jù)擴(kuò)增譜帶結(jié)果進(jìn)行HB紅花陸地棉種質(zhì)材料鑒定PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1，魯HB22單株與1個(gè)其白花近等基因系單株雜交獲得的F2代 分離群體中，泳道1，4，5，6，9-16為紅花單株，具有大小為330bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，泳 道2，3，7，8為白花單株，未擴(kuò)增出該譜帶。實(shí)施例2 本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)材料為不同的HB紅花陸地棉品系及其白花近等基因系，包括4個(gè) 不同的HB118系及其白花近等基因系，8個(gè)不同的HB28系及其白花近等基因系。檢驗(yàn)該方 法在不同的HB紅花系中的PCR擴(kuò)增譜帶結(jié)果。按照上述(實(shí)施例1)技術(shù)方案提取棉花葉片的DNA，特定擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增。PCR反應(yīng)體系組成嚴(yán)格按照技術(shù)方案。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)IXTAE瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠 成像儀觀察并拍照。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2，其中泳道1-4為HB118系紅花種質(zhì)材料，具有箭頭所示大小 為330bp的特異性擴(kuò)增條帶；泳道5為HB118系的白花近等基因系，沒(méi)有330bp的特異性擴(kuò) 增條帶；泳道6-13為HB28系紅花種質(zhì)材料，具有箭頭所示大小為330bp的特異性擴(kuò)增條 帶；泳道14為HB28系的白花近等基因系，沒(méi)有330bp的特異性擴(kuò)增條帶。由此也重復(fù)驗(yàn)證 了該發(fā)明的具體實(shí)際可行性。
權(quán)利要求
一種陸地棉HB紅花種質(zhì)材料的PCR鑒定方法，其特征是，利用一對(duì)特異性引物對(duì)陸地棉的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果來(lái)判斷是否來(lái)源于HB紅花陸地棉種質(zhì)材料。
2.如權(quán)利要求1所述的陸地棉HB紅花種質(zhì)材料的PCR鑒定方法，其特征 是，所述特異性引物，序列為引物PF :5，-GCCGAAACTTCCCATCTC-3，；引物PR 5， -CACCAAAGCGAACTAACG-3，。
3.如權(quán)利要求2所述的陸地棉HB紅花種質(zhì)材料的PCR鑒定方法，其特征是，(1)提取待鑒定的陸地棉材料的基因組DNA；(2)設(shè)計(jì)如權(quán)利要求2所述的引物，以提取的陸地棉材料的基因組DNA為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；(3)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳判定結(jié)果，如果具有長(zhǎng)度為330bp擴(kuò)增條帶的即來(lái)源于 HB紅花陸地棉種質(zhì)材料，如果不具有該擴(kuò)增條帶的樣品則非HB紅花陸地棉種質(zhì)材料。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的陸地棉HB紅花種質(zhì)材料的PCR鑒定方法，其特 征是，所述PCR擴(kuò)增體系為20 μ 1，其中含基因組DNA 50 200ng，10XPCR buffer 2μ 1, 200 μ M dNTP, 0. 25 μ M 引物 PF，0. 25 μ M 弓 I 物 PR, 0. 5UTaq ；PCR 反應(yīng)在 PCR 儀上進(jìn)行，擴(kuò)增 程序?yàn)?4°C 5min ；94°C 30s, 55°C lmin，72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種陸地棉HB紅花種質(zhì)材料的PCR鑒定方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明以HB紅花陸地棉品種或品系為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，利用該引物對(duì)陸地棉的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)能否擴(kuò)增出特異性的單一譜帶來(lái)快速準(zhǔn)確的鑒定樣品是否來(lái)自HB紅花陸地棉品種或品系。本發(fā)明引物的應(yīng)用，具有準(zhǔn)確性高、結(jié)果穩(wěn)定、不受環(huán)境條件和發(fā)育時(shí)期的影響等特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定出陸地棉HB紅花種質(zhì)材料及其純度。它有利于提高陸地棉HB紅花種質(zhì)商品種子高效準(zhǔn)確的質(zhì)量控制，加快了商品種子的質(zhì)量檢測(cè)進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101967521SQ20101055595
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者楊靜, 王家寶, 王留明, 王秀麗, 趙軍勝, 陳瑩, 高明偉 申請(qǐng)人:山東棉花研究中心