專利名稱：修飾型生物素結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾型生物素結(jié)合蛋白。
背景技術(shù)：
抗生物素蛋白是卵清來(lái)源的堿性糖蛋白，其與生物素(維生素H)強(qiáng)烈結(jié)合。另一方面，鏈霉抗生物素蛋白是放線菌(Streptomyces avidinii)來(lái)源的抗生物素蛋白樣蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)在中性附近，且不含糖鏈。這兩種蛋白均形成4聚體，I個(gè)亞基結(jié)合I分子生物素。分子量為60kDa左右?？股锼氐鞍着c生物素、或者鏈霉抗生物素蛋白與生物素之間的親和性非常高(Kd = 10_15 I(T14M)，在生物體二分子之間的相互作用中是最強(qiáng)的。因此，抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白-生物素相互作用廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)或者醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。抗生物素蛋白的等電點(diǎn)大于10，因其高堿性、或者糖鏈的存在而出現(xiàn)有時(shí)與DNA、蛋白質(zhì)等生物分子非特異性結(jié)合的問(wèn)題。生物素的分子量小達(dá)244，且對(duì)pH變化、熱也穩(wěn)定，因而常用作物質(zhì)的標(biāo)記。作為生物素化的方法，有使經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的生物素結(jié)合于蛋白質(zhì)的氨基、羧基、醛基等各種官能團(tuán)的方法。這樣的生物素化試劑是市售的，利用它們可以將蛋白質(zhì)、核酸等生物素化。此夕卜，作為蛋白質(zhì)的生物素化方法之一，有下述方法以重組蛋白質(zhì)的形式表達(dá)可通過(guò)生物體內(nèi)的生物素連接酶而生物素化的序列與目的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)，通過(guò)宿主細(xì)胞內(nèi)的該酶將融合蛋白質(zhì)生物素化。作為這樣的生物素化序列，有例如BioEase Tag(注冊(cè)商標(biāo))，其作為在大腸桿菌、果蠅細(xì)胞或者哺乳類細(xì)胞中以體內(nèi)(in vivo)生物素化的狀態(tài)表達(dá)蛋白質(zhì)的系統(tǒng)有市售?？股锼氐鞍谆蜴溍箍股锼氐鞍着c生物素之間的結(jié)合極強(qiáng)，該結(jié)合是不可逆的，一旦結(jié)合，則基本上無(wú)法解離。由于該強(qiáng)結(jié)合的緣故，傳統(tǒng)的抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白無(wú)法直接應(yīng)用于生物素化生物分子的純化所需的、例如親和色譜等需要可逆性結(jié)合的技術(shù)領(lǐng)域。作為該問(wèn)題的對(duì)策，目前為止已經(jīng)報(bào)告了生物素結(jié)合性降低的抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白。例如，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出將對(duì)與生物素的結(jié)合有貢獻(xiàn)的酪氨酸殘基硝基化而得到的硝基化抗生物素蛋白、硝基化鏈霉抗生物素蛋白。這些在酸性 中性(pH4 7. 5)時(shí)與生物素強(qiáng)結(jié)合，在堿性(PHlO)時(shí)解離。硝基化抗生物素蛋白-瓊脂糖作為CaptAvidin-瓊脂糖有市售。但是，硝基化麻煩，且其效率并非一定。而且，有些情況下，極端的PH變化可能對(duì)生物素化蛋白質(zhì)等造成不良影響。另一方面，目前為止有實(shí)例報(bào)告稱通過(guò)采用基因工程方法在抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白中導(dǎo)入定點(diǎn)氨基酸突變，降低了對(duì)生物素的親和性。作為降低與生物素的親和性的方法，有以下兩種方法在形成生物素結(jié)合口袋的氨基酸中，對(duì)與生物素直接相互作用的氨基酸導(dǎo)入突變的方法；以及對(duì)參與蛋白質(zhì)的亞基之間的連接點(diǎn)的氨基酸導(dǎo)入突變的方法。對(duì)于抗生物素蛋白而言，已經(jīng)報(bào)告了通過(guò)對(duì)與生物素氫鍵結(jié)合的氨基酸引入突變(Marttila et al. (2003)Biochem J. 369 :249-254 ;Laitinen et al. (2003)J. Biol.Chem. 278 :4010-4014 ;Laitinen et al. (2001)J.Biol. Chem. 276 :8219-8224),或者對(duì)與生物素疏水結(jié)合的氨基酸引入突變(Laitinen et al. (1999)FEBS Lett. 461 :52-58 ；Laitinen et al. (2003) J. Biol. Chem. 278 :4010-4014)而降低了對(duì)生物素的親和性的重組
蛋白質(zhì)。同樣地，對(duì)于鏈霉抗生物素蛋白而言，已知有對(duì)與生物素氫鍵結(jié)合的氨基酸引入突變的例子(Qureshi et al. (2001) J. Biol. Chem 276 :46422-46428 ；Gabriel etal. (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. 95 :13525-13530 ；Qureshi and Wong(2002)ProteinExpr. Purif. 25 :409-415 ；ffu and Wong (2006)Protein Expr. Purif. 46 :268-273 ；ffu andWong(2005) J. Biol. Chem. 280 :23225-23231)、對(duì)與生物素疏水結(jié)合的氨基酸引入突變的例子(Chilkoti et al. (1995)Proc. Natl. Acad. Sci. 92 :1754-1758 ；Laitinen et al. (1999)FEBS Lett. 461, 52-58 ；Sano et al. (1995)Proc. Natl. Acad. Sci. 92 :3180-3184,；Sano etal. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94 :6153-6158)。 而且，有實(shí)例報(bào)道稱，在抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白中，通過(guò)對(duì)參與這些蛋白質(zhì)的亞基之間的連接點(diǎn)的氨基酸導(dǎo)入突變的方法，制作了單體的突變蛋白質(zhì)，降低了對(duì)生物素的親和性(Laitinen et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 :8219-8224, Wu andWong(2005) J. Biol. Chem. 280 :23225-23231)?？股锼氐鞍住㈡溍箍股锼氐鞍仔纬伤木垠w，各亞基分別帶有I個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。為了形成完整的生物素結(jié)合口袋，相鄰的亞基的氨基酸殘基(例如對(duì)tamavidin2而言是108位的色氨酸(W108))的存在是重要的。因此，可以認(rèn)為，亞基間的結(jié)合對(duì)與生物素的親和性也有大的影響。根據(jù)Wu 等的報(bào)告(J. Biol. Chem. (2005)，280 =23225-23231)，對(duì)于鏈霉抗生物素蛋白而言，如果將各亞基命名為A、B、C、D，則亞基A上的55位的纈氨酸存在于接近亞基B的59位的精氨酸的位置。亞基A上的76位的蘇氨酸配置在與亞基B上的76位的蘇氨酸和59位的丙氨酸非常接近的位置。亞基B上的109位的亮氨酸與亞基A上的125位的纈氨酸相互作用。亞基A上的125位的纈氨酸與亞基D上的109位的亮氨酸、120位的色氨酸、123位的蘇氨酸、125位的纈氨酸、亞基B上的109位的亮氨酸、亞基C上的107位的谷氨酰胺在廣范圍內(nèi)相互作用。因此，可以期待，通過(guò)將這些氨基酸取代成極性高的氨基酸、例如精氨酸、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸等，能夠使亞基間之間發(fā)生電性排斥或產(chǎn)生空間阻礙?？梢哉J(rèn)為，在極性氨基酸中，親水性指數(shù)(Hydrophatyindex)最小的精氨酸的效果好?？梢哉J(rèn)為，為了將抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白等生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)應(yīng)用于親和色譜等需要可逆性結(jié)合的技術(shù)領(lǐng)域，一個(gè)目標(biāo)是要將解離常數(shù)(KD)提高至10_7(M)左右。雖因情況而異，但一般而言，若解離常數(shù)小于這個(gè)水平，則生物素結(jié)合能力過(guò)強(qiáng)，無(wú)法使希望的生物素化物質(zhì)高效地解離，此外，在解離常數(shù)比這個(gè)水平大的情況下，生物素結(jié)合能力過(guò)弱，無(wú)法使希望的生物素化物質(zhì)充分地結(jié)合(Wu and Wong(2006)Protein Expr.Purif. 46 :268-27)?？紤]到這一點(diǎn)，在上述的鏈霉抗生物素蛋白變體中，氫鍵部位單氨基酸變體的解離常數(shù)均小至10_n(M)左右，生物素結(jié)合能力過(guò)強(qiáng)。只是，在這樣的變體中進(jìn)行氨基酸修飾的結(jié)果，大多甚至?xí)绊懙絹喕嗷プ饔茫鼈兂３?huì)成為單體，而成為單體時(shí)的解離常數(shù)為10_9(M)左右。此外，在上述的鏈霉抗生物素蛋白變體中，當(dāng)將對(duì)氫鍵部位的修飾增加到2處以上時(shí)，其基本上成為單體，其中有一些的生物素結(jié)合能力(解離常數(shù))是10_8 10_6(M)左右(Qureshi et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 :46422-46428)。解離常數(shù)為10_8 10_7(M)的變體具有適合親和色譜等用途的生物素結(jié)合能力(Qureshi and Wong (2002)Protein Expr. Purif. 25 :409-415 ；ffu and Wong(2006)ProteinExpr. Purif. 46 :268-273)。但是，相反的一面是，已知這樣的單體非常容易被蛋白酶分解(Laitinen et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 :8219-8224, Wu and Wong (2005) J. Biol.Chem. 280 :23225-23231)。在親和色譜中，多是利用各種物質(zhì)混合而成的細(xì)胞粗抽提液，而細(xì)胞粗抽提液中往往含有蛋白酶，單體在用于這樣的用途是會(huì)有問(wèn)題。此外，由于成為單體，因亞基間的結(jié)合而隱藏的疏水性區(qū)域暴露出來(lái)，因而存在蛋白質(zhì)整體的可溶性降低的可能性，此外，還可能成為再凝集的原因。就目前為止以抗生物素蛋白為模型設(shè)計(jì)的單體而言(例如Promega公司的SoftLink Soft Release AvidinResin)，在將其固定化在承載體上時(shí)，單體之間會(huì)結(jié)合形成四聚體，結(jié)果與生物素的親和性提高。因此，必須進(jìn)行下述處理在添加生物素標(biāo)記物質(zhì)前，將四聚體與生物素強(qiáng)結(jié)合的區(qū)·域用生物素包埋。該處理麻煩，且由于前處理的影響，存在生物素標(biāo)記物質(zhì)的產(chǎn)量變化大的隱患。罕見(jiàn)地，在上述的鏈霉抗生物素蛋白變體中，有一些即使對(duì)氫鍵部位的氨基酸進(jìn)行2處以上修飾，仍保持四聚體。但是，即使是這樣的四聚體，亞基相互作用也會(huì)因修飾而減弱，在與承載體結(jié)合后、與生物素化物質(zhì)結(jié)合、然后加入過(guò)量的生物素并洗脫生物素化物質(zhì)時(shí)，可以觀察到構(gòu)成四聚體的單體中的多數(shù)發(fā)生洗脫的現(xiàn)象。而且，抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白這樣的氨基酸修飾蛋白質(zhì)中的多數(shù)無(wú)法在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)，必需用昆蟲(chóng)細(xì)胞、枯草桿菌(Bacillus subtilis)進(jìn)行表達(dá)(Laitinen et al. (1999)FEBS Lett. ,461,52_58、Qureshi and Wong(2002)Protein Expr.Purif. 25 :409-415)，因此工序和成本非常成問(wèn)題。能夠用大腸桿菌可溶性表達(dá)的只是一部分單體鏈霉抗生物素蛋白(Wu and Wong(2006)Protein Expr. Purif. 46 :268-273)。如上述，目前為止，具有能夠充分地結(jié)合希望的生物素化物質(zhì)且能夠解離的程度的生物素結(jié)合能力、且能夠在大腸桿菌中可溶性地高表達(dá)、且具有蛋白酶耐受性的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)尚屬未知。而且，本發(fā)明人在食用菌白黃側(cè)耳(Pueurotus conucopiae)中發(fā)現(xiàn)了作為新的抗生物素蛋白樣生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的tamavidinl和tamavidin2 (W002/072817)。tamavidinl以及tamavidin2能夠在大腸桿菌中大量表達(dá),特別是，tamavidin2能夠通過(guò)使用亞氨基生物素柱的純化而容易地制備(W002/072817)。tamavidinl以及tamavidin2與生物素極強(qiáng)地結(jié)合，特別是tamavidin2顯示出與抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白基本同水平的生物素結(jié)合活性。此外，tamavidin2與抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白相比具有高的耐熱性，且比抗生物素蛋白的非特異性結(jié)合少，從這一點(diǎn)來(lái)看，其是良好的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :TO02/072817
非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I =Marttila et al. (2003)Biochem J. 369 :249-254非專利文獻(xiàn)2 =Laitinen et al. (2003) J. Biol. Chem. 278 :4010-4014非專利文獻(xiàn)3 =Laitinen et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 :8219-8224)非專利文獻(xiàn)4 =Laitinen et al. (1999) FEBS Lett. 461 :52-58非專利文獻(xiàn)5 =Qureshi et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 :46422-46428
非專利文獻(xiàn)6 =Gabriel et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95 :13525-13530非專利文獻(xiàn)7 Qureshi and Wong (2002) Protein Expr. Purif. 25 :409-415非專利文獻(xiàn)8 :Wu and Wong (2006) Protein Expr. Purif. 46 :268-273非專利文獻(xiàn)9 ffu and Wong (2005) J. Biol. Chem. 280 :23225-23231非專利文獻(xiàn)10 =Chilkoti et al. (1995)Proc. Natl. Acad. Sci. 92 :1754-1758非專利文獻(xiàn)11 Sano et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92 :3180-3184非專利文獻(xiàn)12 Sano et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94 :6153-6158

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問(wèn)題本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是通過(guò)能夠在大腸桿菌中可溶性地高表達(dá)、且容易利用生物素固定化承載體進(jìn)行純化的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)。解決問(wèn)題的方法本發(fā)明人為解決上述問(wèn)題進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果成功獲得了具有能夠與希望的生物素化物質(zhì)充分地結(jié)合且能夠解離的程度的生物素結(jié)合能力、且具有蛋白酶耐受性的穩(wěn)定的修飾型生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)，從而想到了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明通過(guò)對(duì)天然的tamavidin2(以下在本說(shuō)明書(shū)中也記作“TM2”)的氨基酸序列(SEQ ID NO)進(jìn)行修飾，得到了具有上述性質(zhì)的修飾型生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式本發(fā)明優(yōu)選包括以下實(shí)施方式。[實(shí)施方式I]一種修飾型生物素結(jié)合蛋白質(zhì)，其是包含SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列、或在該序列中具有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、或與該序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，且其具有選自下組的取代I) SEQ ID NO 2的36位的絲氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基；2) SEQ ID NO : 2的80位的色氨酸殘基取代成親水性氨基酸殘基；3) SEQ ID NO 2的116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基；4) SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基取代成蘇氨酸、絲氨酸或者酪氨酸殘基、以及78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基；5) SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基取代成蘇氨酸、絲氨酸或者酪氨酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基以及6) SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基取代成蘇氨酸、絲氨酸或者酪氨酸殘基，78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基，以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基。[實(shí)施方式2]實(shí)施方式I所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其選自下組I-a) SEQ ID NO :2的36位的絲氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 S36A)；2-a) SEQ ID NO 2的80位 的色氨酸殘基被取代成賴氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 W80K)；3-a) SEQ ID NO 2的116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 D116A)；4-a) SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基被取代成蘇氨酸、且78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2P46T-T78A)；5-a) SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基被取代成蘇氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2P46T-D116A);以及6-a) SEQ ID NO :2的46位的脯氨酸殘基被取代成蘇氨酸、78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2P46T-T78A-D116A)。[實(shí)施方式3]實(shí)施方式I或2所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其滿足下述性質(zhì)中的一個(gè)至全部i)可以使用生物素進(jìn)行純化；ii)保持由SEQ ID NO 2的記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的四聚體結(jié)構(gòu)；iii)對(duì)蛋白酶具有耐受性；以及iv)在大腸桿菌的可溶性級(jí)分中顯示高表達(dá)。[實(shí)施方式4]修飾型生物素結(jié)合蛋白，其是包含SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列、或在該序列中具有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、或與該序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，其具有下述取代6) SEQ ID NO 2的78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基。[實(shí)施方式5]6-a) SEQ ID NO 2的78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸殘基的方式4所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 T78A)。[實(shí)施方式6]實(shí)施方式4或5所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其滿足下述性質(zhì)中的一個(gè)至全部i)可以使用生物素進(jìn)行純化；ii)保持由SEQ ID NO 2的記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的四聚體結(jié)構(gòu)；iii)對(duì)蛋白酶具有耐受性；以及V)與由SEQ ID NO :2的記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)相比，具有更高的耐熱性。
[實(shí)施方式7]一種修飾型生物素結(jié)合蛋白，其是包含SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列、或在該序列中具有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、或與該序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，且其具有選自下組的取代7) SEQ ID NO 2的36位的絲氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基；以及8) SEQ ID NO :2的36位的絲氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基。[實(shí)施方式8]實(shí)施方式7所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其選自下組
·
7-a) SEQ ID NO 2的36位的絲氨酸殘基被取代成丙氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2S36A-D116A);以及8-a) SEQ ID NO 2的36位的絲氨酸殘基被取代成丙氨酸、78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2S36A-T78A-D116A)。[實(shí)施方式9]實(shí)施方式7或8所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其滿足下述性質(zhì)中的一個(gè)至全部i)可以使用生物素進(jìn)行純化；iii)對(duì)蛋白酶具有耐受性；以及vi)在弱酸性條件下與生物素結(jié)合，且在中性條件下不與生物素結(jié)合。[實(shí)施方式10]一種修飾型生物素結(jié)合蛋白，其是包含SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列、或在該序列中具有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、或與該序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，且其具有下述取代9) SEQ ID NO 2的78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基。[實(shí)施方式11]實(shí)施方式10所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其中9_a)SEQ ID NO 2的78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸(TM2 T78A-D116A)。[實(shí)施方式12]實(shí)施方式10或11中任一項(xiàng)所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其滿足下述性質(zhì)中的一個(gè)至全部i)可以使用生物素進(jìn)行純化；ii)保持由SEQ ID NO 2的記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的四聚體結(jié)構(gòu)；iii)對(duì)蛋白酶具有耐受性；iv)在大腸桿菌的可溶性級(jí)分中顯示高表達(dá)；以及vii)不能用亞氨基生物素來(lái)純化。
[實(shí)施方式13]實(shí)施方式I 12中任一項(xiàng)所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其與由SEQ IDNO 2所述的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)相比，顯示更低的生物素結(jié)合性。[實(shí)施方式14]實(shí)施方式I 13中任一項(xiàng)所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其滿足以下a)-I)的條件中的一個(gè)至全部 a) SEQ ID NO 2的14位的天冬酰胺殘基未被修飾，或者被取代成谷氨酰胺或天冬
氨酸；b) SEQ ID NO 2的18位的絲氨酸殘基未被修飾，或者被取代成蘇氨酸或酪氨酸；c) SEQ ID NO 2的34位的酪氨酸殘基未被修飾，或者被取代成絲氨酸或蘇氨酸；d) SEQ ID NO 2的36位的絲氨酸殘基未被修飾，或者被取代成蘇氨酸或酪氨酸；e) SEQ ID NO 2的40位的天冬氨酸殘基未被修飾，或者被取代成天冬酰胺以外的
殘基;f) SEQ ID NO 2的69位的色氨酸殘基未被修飾；g) SEQ ID NO 2的76位的絲氨酸殘基未被修飾，或者被取代成蘇氨酸或酪氨酸；h) SEQ ID NO 2的78位的蘇氨酸殘基未被修飾，或者被取代成絲氨酸或酪氨酸；i) SEQ ID NO 2的80位的色氨酸殘基未被修飾；j) SEQ ID NO 2的96位的色氨酸殘基未被修飾；k) SEQ ID NO 2的108位的色氨酸殘基未被修飾；DSEQ ID NO :2的116位的天冬氨酸殘基未被修飾，或者被取代成谷氨酸或天冬酰胺；m) SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基未被修飾；n) SEQ ID NO 2的66位的丙氨酸殘基未被修飾；ο) SEQ ID NO 2的97位的亮氨酸殘基未被修飾、或者被修飾成異亮氨酸；以及P) SEQ ID NO 2的113位的纈氨酸殘基未被修飾；但是，這其中，I) 9)中限定的氨基酸殘基如I) 9)中分別限定的那樣被取代。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，提供了修飾型ΤΜ2，其能夠在大腸桿菌中可溶性高表達(dá)、且具有能夠與生物素結(jié)合和解離的適宜強(qiáng)度的生物素結(jié)合活性。將本發(fā)明的修飾型ΤΜ2固定化于例如承載體，可以用于純化生物素化物質(zhì)用的親和色譜等。


[圖I]圖IA是顯示野生型tamavidin2(WT-TM2 :左側(cè))與TM2 S36A (右側(cè))的生物素-瓊脂糖純化的照片；圖IB是顯示TM2 T78A的生物素-瓊脂糖純化的照片；圖IC是顯示TM2 D116A的生物素-瓊脂糖純化的照片。將各蛋白質(zhì)與生物素-瓊脂糖結(jié)合后，通過(guò)添加含IOmM生物素的PBS (pH7. 4)進(jìn)行洗脫。在各級(jí)分溶液中添加等量的2xSDS樣品緩沖液后，95°C處理10分鐘，進(jìn)行SDS-PAGE，然后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色。Sup是上柱前的可溶性級(jí)分，F(xiàn)T是柱穿透(flow through)級(jí)分，W是洗潘級(jí)分，Elu是洗脫級(jí)分。[圖2]圖2A是顯示TM2P46TD116A的生物素-瓊脂糖純化的照片；圖2B是顯示TM2 P46TT78AD116A的生物素-瓊脂糖純化的照片；圖2C是顯示T78AD116A的生物素-瓊脂糖純化的照片。通過(guò)添加含IOmM的生物素的PBS(pH7.4)，進(jìn)行洗脫。而且，圖2D是顯示TM2 P46TT78A的亞氨基生物素-瓊脂糖純化以及生物素-瓊脂糖純化的照片。在各級(jí)分溶液中添加等量的2xSDS樣品緩沖液后，95°C處理10分鐘，進(jìn)行SDS-PAGE，然后進(jìn)行CBB染色。Sup是上柱前的可溶性級(jí)分，F(xiàn)T是柱穿透(flow through)級(jí)分，W是洗潘級(jí)分，Elu是洗脫級(jí)分。M是分子量標(biāo)記。[圖3]圖3A是顯示TM2S36A-D116A的生物素-瓊脂糖純化的照片；圖3B是顯示TM2 S36A-T78A-D116A的生物素-瓊脂糖純化的照片。在pH5、或pH6、或者pH7，使TM2S36A-D116A與生物素-瓊脂糖結(jié)合，在pH5和pH6進(jìn)行結(jié)合時(shí)，用含500mM的NaCl的pH4的磷酸鉀緩沖液，在pH7進(jìn)行結(jié)合時(shí)用含500mM的NaCl的pH7的磷酸鉀緩沖液，分別進(jìn)行洗滌。然后，在PH5或pH6進(jìn)行結(jié)合時(shí)，添加pH7的磷酸鉀緩沖液lmL，在pH7進(jìn)行結(jié)合時(shí)，添加含IOmM的生物素的pH7. 4的PBS ImL,分別進(jìn)行洗脫。此外，在pH4或pH7的磷酸鉀緩沖液、或者PH12的50mM CAPS緩沖液中，使TM2S36A-T78A-D116A與生物素-瓊脂糖結(jié)合后，進(jìn)行洗滌，添加PH7的IOOmM磷酸鉀緩沖液lmL，進(jìn)行洗脫。在各級(jí)分溶液中添加等量的2xSDS樣品緩沖液后，95°C處理10分鐘，進(jìn)行SDS-PAGE，然后進(jìn)行CBB染色?！圖4]圖 4 是顯示各種修飾型 tamavidin2 (TM2 S36A (圖 4A)、TM2T78A、TM2D116A、TM2 T78A-D116A(以上圖 4C))、野生型的 tamavidin2 (WT-TM2、圖 4A)、以及作為對(duì)照的BSA(Bovine Serum Albumin、圖4B)的蛋白酶(Protease)耐受性的照片。使這些修飾型tamavidin2與蛋白酶K于30°C反應(yīng)15分鐘后，在各反應(yīng)溶液中添加5xSDS樣品緩沖液，然后95°C處理10分鐘，終止反應(yīng)。將樣品進(jìn)行SDS-PAGE，并進(jìn)行CBB染色。[圖5]圖 5 是顯示各種修飾型 tamavidin2(TM2 S36A_D116A(圖 5A、C)、TM2T78A、TM2 P46T-T78A(以上圖 5A)、TM2 P46T_D116A(圖 5B)、TM2S36A_T78A_D116A(圖 5C)、TM2 W80K、TM2 P46T_T78A_D116A(以上圖 ))的蛋白酶耐受性的照片。使這些修飾型tamavidin2與蛋白酶K于30°C反應(yīng)15分鐘后，在各反應(yīng)溶液中添加5xSDS樣品緩沖液，然后95°C處理10分鐘，終止反應(yīng)。而且，對(duì)于打星號(hào)的TM2T78A，100°C處理10分中終止反應(yīng)。將樣品進(jìn)行SDS-PAGE，并進(jìn)行CBB染色。[圖6]圖6是顯示TM2T78A的熱穩(wěn)定性的照片。將TM2 T78A在存在或不存在生物素的條件下于指定的溫度、IxSDS樣品緩沖液中熱處理20分鐘后，進(jìn)行SDS-PAGE，并進(jìn)行CBB染色。[圖7]圖7是顯示用TM2S36A-S印harose進(jìn)行的生物素化BSA的純化的照片。對(duì)于將大腸桿菌(TBl)的菌體抽提液和生物素化BSA、或者單獨(dú)的生物素化BSA樣品用TM2S36A_Sepharose進(jìn)行純化時(shí)的純化前(total)、柱穿透(flow through)級(jí)分(FT)、洗漆級(jí)分(W)、洗脫級(jí)分(Elu)的各溶液，添加等量的2xSDS樣品緩沖液后，95°C處理10分鐘，進(jìn)行SDS-PAGE。通過(guò)銀染色I(xiàn)I試劑盒(和光純藥公司制造)確認(rèn)了生物素化BSA的存在。而且，洗脫液中添加了 5mM的生物素。[圖8]圖8A是顯示利用TM2D116A-S印harose進(jìn)行的生物素化BSA的純化的照片；圖88是顯示利用TM2 P46TT78A-S印harose進(jìn)行的生物素化BSA的純化的照片；圖8(是顯示利用TM2 P46TD116A-S印harose進(jìn)行的生物素化BSA的純化的照片。對(duì)于用各承載體分別進(jìn)行生物素化BSA、或者大腸桿菌抽提液和生物素化BSA的純化時(shí)的純化前(total)、柱穿透(flow through)級(jí)分(FT)、洗漆級(jí)分(W)、洗脫級(jí)分(Elu)的各溶液,添加等量的2xSDS樣品緩沖液后，95°C處理10分鐘，進(jìn)行SDS-PAGE。通過(guò)銀染色I(xiàn)I試劑盒(和光純藥公司制造)確認(rèn)了生物素化BSA的存在。而且，洗脫液中添加5mM的生物素。[圖9]圖9是顯示生物素化BSA對(duì)TM2S36A_D116A_s印harose的結(jié)合的pH依賴性的照片。在pH5、pH6或者pH7的IOOmM磷酸鉀緩沖液中與生物素化BSA結(jié)合，用含500mM的NaCl的pH4 (在上述pH5或pH6結(jié)合時(shí))或pH7 (在上述pH7結(jié)合時(shí))的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行洗滌后，加入PH7的磷酸鉀緩沖液，洗脫生物素化BSA。在純化前(total)、柱穿透(flowthrough)級(jí)分(FT)、洗漆級(jí)分(W)、洗脫級(jí)分(Elu)的各溶液中添加等量的2xSDS樣品緩沖液，95°C處理10分鐘后，進(jìn)行SDS-PAGE。再使用銀染色I(xiàn)I試劑盒(和光純藥公司制造)進(jìn)行蛋白質(zhì)的銀染色。發(fā)明的
具體實(shí)施例方式以下，對(duì)實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。 tamavidintamavidin是從作為食用菌的擔(dān)子菌白黃側(cè)耳(Pleurotus conucopiae)中發(fā)現(xiàn)的新的生物素結(jié)合蛋白(W002/072817)。該文獻(xiàn)中記載-tamavidin I與tamavidin 2相互之間的氨基酸同源性為65. 5%,與生物素強(qiáng)結(jié)合；-tamavidin 2在大腸桿菌中高表達(dá)在可溶性級(jí)分中；以及-用大腸桿菌表達(dá)tamavidin2時(shí),經(jīng)過(guò)4. 5小時(shí)的培養(yǎng),每50ml培養(yǎng)可以獲得約Img的高純度純化重組蛋白質(zhì)。與已知的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白相比，這是非常高的值。本說(shuō)明書(shū)中的“tamavidin 2”是指tamavidin 2 (TM2)或其變體。本發(fā)明通過(guò)對(duì)TM2或其變體的特定氨基酸殘基進(jìn)行修飾，提供可與生物素可逆性反應(yīng)的修飾型TM2。在本說(shuō)明書(shū)中，當(dāng)記作“tamavidin 2”、“TM2”時(shí)，如無(wú)特別說(shuō)明，是指野生型的TM2及其變體。但是，根據(jù)文意，有些情況下也作為包括本發(fā)明的修飾型TM2在內(nèi)的TM2的野生型、突變型和本發(fā)明的修飾型的統(tǒng)稱使用。此外，TM2顯示生物素結(jié)合性，因而在本說(shuō)明書(shū)中，有時(shí)也將TM2稱作“生物素結(jié)合蛋白”。具體地說(shuō)，TM2(野生型)典型地，可以是包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或由包含SEQ ID NO :1的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)?；蛘撸琓M2可以是包含SEQ IDNO 2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或由包含SEQID NO 1的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)的變體，該蛋白質(zhì)具有與tamavidin2等同的生物素結(jié)合活性。TM2的變體可以是包含在SEQ IDNO 2的氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。取代可以是保守取代，即將特定的氨基酸殘基替換為具有相似物理化學(xué)特征的殘基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基團(tuán)的氨基酸殘基之間的取代(例如He、Val>Leu或Ala間的相互取代)、極性殘基之間的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之間的相互取代)等。氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的變體可以通過(guò)對(duì)編碼野生型蛋白質(zhì)的DNA實(shí)施例如作為公知技術(shù)的定點(diǎn)誘變(例如參見(jiàn)Nucleic Acid Research, Vol. 10,No. 20,p. 6487-6500，1982，通過(guò)引用將其全文引入到本說(shuō)明書(shū)中)而產(chǎn)生。在本說(shuō)明書(shū)中，“一個(gè)或多個(gè)氨基酸”是指通過(guò)定點(diǎn)誘變方法能夠缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。此外，在本說(shuō)明書(shū)中，“一個(gè)或多個(gè)氨基酸”根據(jù)情況可以指一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。就定點(diǎn)誘變方法而言，例如，除希望的變異即特定的不一致之外，還可以使用與要突變的單鏈?zhǔn)删wDNA互補(bǔ)的合成寡核苷酸引物按如下方式進(jìn)行。即，使用上述合成寡核苷酸作為弓I物合成與噬菌體互補(bǔ)的鏈，用得到的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌的培養(yǎng)物鋪在瓊脂上，由含噬菌體的單個(gè)細(xì)胞形成噬菌斑。這樣，理論上有50%的新菌落含有單鏈形式的具有突變的噬菌體，其余的50%攜帶原序列。在所述探針與和帶有目的突變的DNA完全一致的噬菌斑雜交，而不與攜帶原有鏈的噬菌斑雜交的合適的溫度下，使獲得的噬菌斑與通過(guò)激酶處理而標(biāo)記的合成探針雜交 。然后，收集與該探針雜交的噬菌斑，進(jìn)行培養(yǎng)，回收DNA。而且，在保持其活性的同時(shí)對(duì)生物活性肽的氨基酸序列施加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定點(diǎn)突變外，還有用誘變物處理基因的方法，以及選擇性地?cái)嚅_(kāi)基因，然后刪除、取代、插入或添加選定的核苷酸，再進(jìn)行連接的方法。更優(yōu)選地，本發(fā)明中的TM2是由在SEQ ID NO 2中缺失、取代或添加I 10個(gè)氨基酸的氨基酸序列組成、且具有生物素活性的蛋白質(zhì)。TM2的變體還可以是包含與SEQ ID NO :2的氨基酸序列具有至少80%以上、優(yōu)選85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上、更優(yōu)選99. 3%以上的氨基酸同一性的氨基酸序列、且具有與TM2等同的生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)。兩個(gè)氨基酸序列的同一性％可通過(guò)目測(cè)和數(shù)學(xué)計(jì)算來(lái)確定?；蛘邇蓚€(gè)蛋白質(zhì)序列的同一性百分比可以通過(guò)使用以Needleman, S. B.及ffunsch, C. D. (J. Mol. Bol. ,48 443-453,1970)的算法為基礎(chǔ)的、可從威斯康星州大學(xué)遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(UWGCG)獲得的GAP計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行序列信息比較來(lái)確定。GAP程序優(yōu)選的默認(rèn)參數(shù)包括= (I)Henikoff，S.以R Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89 :10915-10919，1992)所記載的得分 / 矩陣、blosum62 ； (2) 一個(gè)空位扣12分；(3)連續(xù)空位加扣4分；以及(4)末端空位不扣分。也可使用該領(lǐng)域技術(shù)人員使用的進(jìn)行序列比較的其它程序。關(guān)于同一性百分比，例如Altschul 等(Nucl. Acids. Res.，25，p. 3389-3402，1997)中記載的可用 BLAST 程序?qū)π蛄行畔⑦M(jìn)行比較和確定。該程序可于網(wǎng)絡(luò)上在Nantional Center for BiotechnologyInformation(NCBI)或 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)網(wǎng)站使用。在相同站點(diǎn)，對(duì)利用BLAST程序進(jìn)行同一性檢索的各種條件(參數(shù))進(jìn)行了詳細(xì)記載，可對(duì)部分設(shè)定進(jìn)行適當(dāng)變更，但檢索通常使用默認(rèn)值來(lái)進(jìn)行。此外，兩個(gè)氨基酸序列的同一性％也可用遺傳信息處理軟件GENETYX Ver. 7 (GENETYX制)等程序或FASTA算法等來(lái)確定。此時(shí)，也可用默認(rèn)值進(jìn)行檢索。兩個(gè)核酸序列的同一性％可通過(guò)目測(cè)和數(shù)學(xué)計(jì)算來(lái)確定，此外，該比較更優(yōu)選使用計(jì)算機(jī)程序?qū)π蛄行畔⑦M(jìn)行比較。具有代表性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序?yàn)檫z傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(GCG ;威斯康星州Madison)的威斯康星軟件包、10. O版“GAP”程序(Devereux等，1984,Nucl. Acids Res. ,12 :387)。使用該“GAP”程序,不僅可對(duì)兩個(gè)核酸序列進(jìn)行比較,還可比較兩個(gè)氨基酸序列，并可對(duì)核酸序列和氨基酸序列進(jìn)行比較。此處，“GAP”程序的優(yōu)選默認(rèn)參數(shù)包括(1)實(shí)行關(guān)于核苷酸的(包括相同物質(zhì)為I，不同物質(zhì)為O的值)一元(unary)比較矩陣的GCG時(shí)，如Schwartz和Dayhoff主編的”多肽序列及結(jié)構(gòu)圖譜(Atlas ofPolypeptide Sequence and Structure) ”(國(guó)立生物醫(yī)學(xué)研究財(cái)團(tuán)，353-358 頁(yè)，1979 年)所記載的Gribskov及Burgess (Nucl. Acids Res. ,14 :6745,1986)的加權(quán)氨基酸比對(duì)矩陣；或其它可比對(duì)的比對(duì)矩陣；(2)氨基酸的各空位罰分30，各空位中的各記號(hào)追加I罰分；此夕卜，核苷酸序列的各空位罰分50，各空位中的各記號(hào)追加3罰分；(3)末端空位不罰分；以及⑷長(zhǎng)空位沒(méi)有最大罰分。技術(shù)人員使用的其它序列比較程序中，可使用例如美國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書(shū)館的網(wǎng)站http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/bl2seq/bls. html 提供的版本2. 2. 7的BLASTN程序、或UW-BLAST2. O算法。關(guān)于UW-BLAST2. O標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)參數(shù)的設(shè)定，以下網(wǎng)站http://blast. wustl. edu中有記載。而且，BLAST算法使用BL0SUM62氨基酸得分矩陣，可使用的選擇參數(shù)如下(A)包含具有低組成復(fù)雜性的提問(wèn)序列區(qū)段(由Wootton及Federhen 的 SEG 程序(Computers and Chemistry, 1993)確定；參考 Wootton 及 Federhen,1996“序列數(shù)據(jù)庫(kù)中組成偏移區(qū)域的分析(Analysis of compositionally biased regionsin sequence databases) ”Methods Enzymol. , 266 :544-71),或用于掩蔽由短周期性內(nèi)部重復(fù)形成的區(qū)段(由 Claverie 及 States (Computers and Chemistry, 1993)的 XNU 程序確定)的濾器，以及(B)用于報(bào)告數(shù)據(jù)庫(kù)序列匹配的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的閾值，或根據(jù)E-得分·(Karlin和Altschul，1990)統(tǒng)計(jì)學(xué)模型得到的單純偶然發(fā)現(xiàn)匹配的期待幾率；某種匹配引起的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差值大于E-得分閾值時(shí)，不報(bào)告該匹配；優(yōu)選的E-得分閾值的數(shù)值為O. 5，此外按照優(yōu)選程度增大的順序依次為O. 25,0. 1,0. 05,0. 01,0. 001,0. 0001、le_5、Ie-10、Ie-15、le_20、le_25、le_30、le_40、le_50、le_75、Ie-IOO。此外，TM2的變體還可以是由包含在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 1的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交的堿基序列的核酸編碼的、具有與TM2等同的生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)。此處，“嚴(yán)格條件下”是指在中度或高度的嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交。具體來(lái)說(shuō)，關(guān)于中度嚴(yán)格條件，根據(jù)例如DNA長(zhǎng)度，掌握常規(guī)技術(shù)的該領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定?；緱l件如 Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 3 版，第 6 章，ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2001 所不，例如包括下述條件的使用5 X SSC、0. 5 %SDS、I. OmM EDTA (pH8. 0)的預(yù)洗滌溶液、約42°C的約50%的甲酰胺、2 X SSC 6 X SSC，優(yōu)選5 6XSSC、0. 5% SDS(或約42°C、約50%甲酰胺中的Stark氏溶液等其它類似的雜交溶液)的雜交條件，以及例如在約50°C 68°C、0. I 6XSSC、0. 1% SDS的洗滌條件。優(yōu)選的中度嚴(yán)格條件包括約50°C、6XSSC、0. 5% SDS的雜交條件(及洗滌條件)。關(guān)于高度嚴(yán)格條件，根據(jù)例如DNA長(zhǎng)度，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定。通常，這樣的條件包括較中度嚴(yán)格條件更高溫度和/或更低鹽濃度的雜交(例如含O. 5 %左右的SDS、約65 °C，6 X SSC O. 2 X SSC,優(yōu)選6 X SSC、更優(yōu)選2 X SSC、更優(yōu)選O. 2 X SSC或者O. IXSSC的雜交)和/或洗滌，例如可定義為上述雜交條件以及伴隨大約65°C -68°C>O. 2 O. 1XSSC.0. 1% SDS的洗滌。關(guān)于雜交及洗滌的緩沖液，可以使用SSPE (I X SSPE 為 O. 15M NaClUOmMNaH2PO4 以及 I. 25mM EDTA, ρΗ7· 4)代替 SSC (I X SSC 為O. 15Μ NaCl以及15mM檸檬酸鈉)，在雜交結(jié)束后進(jìn)行洗滌15分鐘 I小時(shí)左右。此外，也可使用探針中不使用放射性物質(zhì)的市售雜交試劑盒。具體可以列舉出使用 ECL direct labeling & detection system(Amersham 公司制)進(jìn)行的雜交等。嚴(yán)格雜交條件的例子為，向試劑盒的雜交緩沖液中加入5% (w/v)的封閉試劑，使NaCl達(dá)到O. 5M，在42°C進(jìn)行4小時(shí)雜交，關(guān)于洗滌，可以列舉出下述條件在O. 4% SDS、O. 5xSSC中，55°C條件下洗滌兩次，每次20分鐘，在2xSSC中，室溫條件下，洗滌一次5分鐘。TM2的變體的生物素結(jié)合活性可以采用任何公知方法來(lái)測(cè)定。例如，可以像Kada等(Biochim. Biophys. Acta. , 1427 :33-43(1999))所描述的那樣，采用使用了熒光生物素的方法來(lái)測(cè)定。該方法是利用以下性質(zhì)的測(cè)定系統(tǒng)在生物素結(jié)合蛋白的生物素結(jié)合位點(diǎn)上結(jié)合熒光生物素時(shí)，熒光生物素的熒光強(qiáng)度消失?；蛘撸梢允褂没诒砻娴入x子體共振原理的生物傳感器等能夠測(cè)定蛋白與生物素間的結(jié)合的傳感器，來(lái)評(píng)價(jià)變體蛋白的生物素結(jié)合活性。在本發(fā)明的修飾tamavidin中，希望不加以修飾的氨基酸殘基如后述。本發(fā)明的修飾tamavidin (I型)作為本發(fā)明的修飾型TM2的I個(gè)實(shí)施方式，以在包含SEQ ID NO 2所述的氨基酸 序列、或者該序列中具有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、或者與該序列具有80%以上同一性的氨基酸序列，且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)(TM2或者TM2(變體))中，具有選自下組中的取代為特征DSEQ ID NO 2的36位的絲氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基；2) SEQ ID NO : 2的80位的色氨酸殘基取代成親水性氨基酸殘基；3) SEQ ID NO 2的116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基；4) SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基取代成蘇氨酸、絲氨酸或者酪氨酸殘基、以及78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基；5) SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基取代成蘇氨酸、絲氨酸或者酪氨酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基；以及6) SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基取代成蘇氨酸、絲氨酸或者酪氨酸殘基、78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基。在本說(shuō)明書(shū)中，“tamavidin2(TM2) ”如上述定義。在本說(shuō)明書(shū)中，“取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基”是指取代成認(rèn)為不與生物素形成氫鍵的氨基酸殘基。并非限定，作為具體的例子，可以列舉出將其他氨基酸殘基取代成作為具有非極性、即疏水性R基的氨基酸的丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、以及脯氨酸(P)等。在本說(shuō)明書(shū)中的實(shí)施例中，描述了下述修飾型TM2中將絲氨酸、蘇氨酸或天冬氨酸取代成丙氨酸(A)的修飾體。在本說(shuō)明書(shū)中，“取代成親水性氨基酸殘基”是指取代成本技術(shù)領(lǐng)域通常認(rèn)為是親水性的氨基酸殘基。并非限定，作為具體的例子，可以列舉出極性氨基酸，這其中可以列舉出取代成具有生理PH下帶正電荷的R基的賴氨酸(K)、精氨酸(R)以及組氨酸(H)，具有生理pH下帶負(fù)電荷的R基的天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)等，下述的修飾型TM2中描述了將色氨酸取代成賴氨酸(K)而得到的修飾型TM2。這樣的修飾型TM2優(yōu)選是I-a) SEQ ID NO :2的36位的絲氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 S36A)、2-a) SEQ ID NO 2的80位的色氨酸殘基被取代成賴氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 W80K)、3-a) SEQ ID NO :2的116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 D116A)、4-a) SEQ ID NO :2的46位的脯氨酸殘基被取代成蘇氨酸、且78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 P46T-T78A)、5-a) SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基被取代成蘇氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 P46T-D116A)、以及6-a) SEQ ID NO :2的46位的脯氨酸殘基被取代成蘇氨酸、78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 P46T-T78A-D116A)。這樣的修飾型TM2優(yōu)選顯示下述性質(zhì)中的一個(gè)至全部i)可以使用生物素進(jìn)行純化、ii)保持由SEQ ID NO 2的記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的四聚體結(jié)構(gòu)、iii)對(duì)蛋白酶具有耐受性、iv)在大腸桿菌的可溶性級(jí)分中顯示高表達(dá)。在本說(shuō)明書(shū)中，“可以使用生物素進(jìn)行純化”是指作為對(duì)象的蛋白質(zhì)通過(guò)具有適度的生物素結(jié)合能力從而能夠與生物素結(jié)合以及解離，因而利用與生物素的親和，使用對(duì)象蛋白質(zhì)本身和/或結(jié)合有對(duì)象蛋白質(zhì)的承載體(柱等)來(lái)純化生物素化物質(zhì)(例如生物素化蛋白質(zhì)等)是可能的。因此，與野生型TM2相比，修飾型TM2是生物素結(jié)合能力更小的低親和性tamavidin。在本說(shuō)明書(shū)中，“保持四聚體結(jié)構(gòu)”是指基本上保持天然的TM2所具有的四聚體的亞基結(jié)構(gòu)。具體地，是指具有與野生型TM2大致相同的分子量的狀態(tài)。可以通過(guò)例如，米用快速蛋白液相色譜(Fast protein liquid chromatography (FPLC))測(cè)定修飾型TM2的分子量，并與TM2的分子量進(jìn)行比較來(lái)確認(rèn)。在本說(shuō)明書(shū)中，“對(duì)蛋白酶具有耐受性”是指通過(guò)蛋白酶處理，蛋白質(zhì)不被酶分解、或基本上不分解。蛋白酶處理例如，使用蛋白酶K實(shí)施30°C、15分鐘的處理?！安槐幻阜纸狻笔侵赶褚吧偷腡M2那樣，即使在酶處理后進(jìn)行SDS-PAGE，也能夠明顯地檢測(cè)出該蛋白質(zhì)的四聚體、二聚體和/或單體的條帶。即，對(duì)蛋白酶不具有耐受性的蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白酶處理被分解直至成為小分子，在蛋白酶處理后的SDS-PAGE中無(wú)法檢測(cè)出四聚體、二聚體和單體的條帶；而對(duì)于對(duì)蛋白酶具有耐受性蛋白質(zhì)而言，會(huì)保持四聚體結(jié)構(gòu)，而不會(huì)因蛋白酶處理而完全分解。于是，在SDS-PAGE中，可以作為四聚體和/或四聚體解離而得到的二聚體、單體的條帶被檢測(cè)到。在本說(shuō)明書(shū)中，“在大腸桿菌的可溶性級(jí)分中顯示高表達(dá)”是指將希望的基因組入表達(dá)載體，導(dǎo)入大腸桿菌后，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中、適當(dāng)?shù)臏囟纫约氨磉_(dá)誘導(dǎo)條件下表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，大腸桿菌中充分地產(chǎn)生該重組蛋白質(zhì)，達(dá)到在菌體破碎后的可溶性級(jí)分中能夠確認(rèn)的程度，優(yōu)選為與野生型的TM2大致等同或在其以上。并非限定，可意指培養(yǎng)液每IL中表達(dá)Img以上、優(yōu)選5mg以上、IOmg以上、15mg以上、特別優(yōu)選20mg以上。“TM2 S36A”以及” TM2 D116A”是在TM2中將被認(rèn)為與生物素氫鍵結(jié)合的部位進(jìn)行修飾而得到的，其在大腸桿菌的可溶性級(jí)分中高表達(dá)。此外，這些修飾體TM2保持四聚體的結(jié)構(gòu)，且對(duì)蛋白酶具有高耐受性。而且，就這些修飾型TM2的生物素結(jié)合能力而言，盡管是單氨基酸修飾體，但其與生物素之間的結(jié)合能力降低到了足以發(fā)生與生物素的可逆反應(yīng)的程度，能夠非常有效率地純化生物素化蛋白質(zhì)。而且，即使在利用亞氨基生物素柱的情況下，也能夠非常有效率地純化這些修飾體TM2。因此，“TM2 S36A”以及“TM2D116A”是能夠解決目前為止的低結(jié)合能力生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的問(wèn)題的、非常良好的生物素可逆結(jié)合性蛋白質(zhì)?！癟M2 W80K”是在TM2中對(duì)被認(rèn)為與生 物素疏水結(jié)合的部位進(jìn)行修飾而得到的，其中，將野生型TM2(SEQ ID N02)的80位的色氨酸修飾成了賴氨酸。TM2 W80K在大腸桿菌的可溶性級(jí)分中高表達(dá)。此外，其保持四聚體的結(jié)構(gòu)，且對(duì)蛋白酶具有高耐受性。而且，就這些變體的生物素結(jié)合能力而言，盡管是單氨基酸修飾體，但降低到了足以發(fā)生與生物素的可逆反應(yīng)的程度，若使用乙酸，則能夠非常有效率地純化生物素化蛋白質(zhì)。而且，即使在利用亞氨基生物素柱的情況下，也能夠非常有效率地純化。因此，W80K是能夠解決目前為止的低結(jié)合能力生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的問(wèn)題的、非常良好的具有生物素可逆性結(jié)合的性質(zhì)的蛋白質(zhì)?！癟M2 P46T-T78A”與“TM2 P46T-D116A”是對(duì)認(rèn)為參與 tamavidin 的亞基間的結(jié)合的部位、且被認(rèn)為與生物素氫鍵結(jié)合的部位進(jìn)行修飾而得到的。利用TM2與鏈霉抗生物素蛋白之間的氨基酸同源性(兩者的氨基酸同源性整體為48%)進(jìn)行研究的結(jié)果，認(rèn)為鏈霉抗生物素蛋白中的55位的纈氨酸(Val)、76位的蘇氨酸(Thr)、109位的亮氨酸(Leu)以及125位的纈氨酸(Val)分別是TM2中的46位的脯氨酸(Pro)、66位的丙氨酸(Ala)、97位的亮氨酸(Leu)、113位的纈氨酸(Val)。S卩，認(rèn)為T(mén)M2中這些氨基酸存在于亞基結(jié)合部位。于是，對(duì)氨基酸實(shí)際引入突變，測(cè)定生物素結(jié)合活性，結(jié)果是雖與生物素可逆性結(jié)合，但大約半數(shù)的修飾體成為二聚體、單體的混合物。將被認(rèn)為參與TM2的亞基間結(jié)合的46位的脯氨酸修飾成蘇氨酸的“TM2 P46T”是意圖減弱亞基間結(jié)合的變體，但其卻保持四聚體。于是，生物素結(jié)合能力與預(yù)想相反非常之高，即使加入過(guò)量的生物素，也不能使生物素化物質(zhì)洗脫。但是，將該TM2 P46T的被認(rèn)為與生物素氫鍵結(jié)合的部位——78位的蘇氨酸或116位的天冬氨酸修飾成丙氨酸而得到的變體，其生物素結(jié)合能力變?yōu)檫m度水平，能夠充分地純化生物素化物質(zhì)。而且，組合了所有這些突變的“TM2 P46T-T78A-D116A”也能夠充分地純化生物素化物質(zhì)。此外，這些變體保持四聚體，且具有蛋白酶耐受性。而且，通過(guò)像這樣組合氫鍵的突變與亞基間結(jié)合的突變而成功地獲取了適宜生物素結(jié)合能力的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)，目前為止尚無(wú)實(shí)例。本發(fā)明的修飾tamavidin(II型)此外。作為本發(fā)明的修飾型TM2的I個(gè)實(shí)施方式，以在包含SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列、或者該序列中具有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、或者與該序列具有80%以上同一性的氨基酸序列，且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)(TM2或者TM2 (變體))中，具有6) SEQ ID NO 2的78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基為特征。這樣的修飾型TM2優(yōu)選是
6-a) SEQ ID NO :2的78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸殘基的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 T78A) ο在本說(shuō)明書(shū)中，“tamavidin2(TM2) ”如上述定義。在本說(shuō)明書(shū)中，“取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基”如上述定義。這樣的修飾型TM2優(yōu)選顯示下述性質(zhì)中的一個(gè)至全部；i)可以使用生物素進(jìn)行純化、ii)保持由SEQ ID NO 2的記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的四聚體結(jié)構(gòu)、
·
iii)對(duì)蛋白酶具有耐受性、V)與由SEQ ID NO :2的記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)相比，具有更高的耐熱性。在本說(shuō)明書(shū)中，“可以使用生物素進(jìn)行純化”、“保持四聚體結(jié)構(gòu)”以及“對(duì)蛋白酶具有耐受性”如上述定義。在本說(shuō)明書(shū)中，“具有高耐熱性”是指具有與野生型同等程度或者其以上的耐熱性。非限定地，是指例如，在SDS存在下進(jìn)行20分鐘加熱處理時(shí)的Tr值(單體與四聚體的量之比成為I : I時(shí)的溫度)與天然的TM2相比，在不存在生物素的條件下，優(yōu)選為同等程度、更優(yōu)選高5°C以上、更優(yōu)選高10°C以上。對(duì)于“TM2 T78A”而言，利用亞氨基生物素-瓊脂糖從大腸桿菌可溶性級(jí)分的回收率低，而利用生物素-瓊脂糖的回收率高(95%左右)，其保持四聚體，且具有蛋白酶耐受性。而且，TM2 T78A與TM2 S36A、TM2 D116A—樣是單氨基酸變體，盡管如此，生物素結(jié)合能力降低至適度，能夠純化生物素化蛋白質(zhì)(回收率40% 50%左右)。而且，TM2 T78A在不存在生物素的條件下的Tr值為88°C，比TM2的Tr值(78°C )高10°C，此外，生物素結(jié)合時(shí)的Tm值也為100°C以上，是熱穩(wěn)定性非常高的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的修飾tamavidin(III型)此外，作為本發(fā)明的修飾型TM2的I個(gè)實(shí)施方式，以在包含SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列、或者該序列中具有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、或者與該序列具有80%以上同一性的氨基酸序列，且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)(TM2或者TM2(變體))中，具有選自下組的取代為特征7) SEQ ID NO 2的36位的絲氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基；以及8) SEQ ID NO :2的36位的絲氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵
的氨基酸殘基。在本說(shuō)明書(shū)中，“tamavidin2(TM2) ”如上述定義。在本說(shuō)明書(shū)中，“取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基”如上述定義。這樣的修飾型TM2優(yōu)選選自下組7-a) SEQ ID NO 2的36位的絲氨酸殘基被取代成丙氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2S36A-D116A);以及8-a) SEQ ID NO 2的36位的絲氨酸殘基被取代成丙氨酸、78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2S36A-T78A-D116A)。這樣的修飾型TM2顯示下述性質(zhì)中的一個(gè)至全部；i)可以使用生物素進(jìn)行純化；iii)對(duì)蛋白酶具有耐受性；vi)在弱酸性條件下與生物素結(jié)合、且在中性條件下不與生物素結(jié)合。在本說(shuō)明書(shū)中，“可以使用生物素進(jìn)行純化”以及”對(duì)蛋白酶具有耐受性”如上述定義。本實(shí)施方式的修飾型tamavidin顯示特殊的pH依賴性。在本說(shuō)明書(shū)中弱酸性”是指pH4 pH6的范圍內(nèi)的氫離子指數(shù)?！爸行浴笔侵竝H7 pH8的范圍內(nèi)的氫離子指數(shù)。 “TM2 S36A-D116A”從大腸桿菌可溶性級(jí)分的回收率是95%、純化度95% (pH4結(jié)合、PH7解離的情況下)，保持四聚體，且具有蛋白酶耐受性。而且，在生物素結(jié)合方面，顯示極特異性的PH依賴性。目前為止，在中性附近(pH7附近)不結(jié)合生物素的生物素結(jié)合蛋白尚屬未知。該“TM2S36A-D116A”在弱酸性條件(pH4 6左右)下與生物素非常高效率地結(jié)合，與此相對(duì)，在中性條件以及堿性條件(pH7、pH12)下完全不與生物素結(jié)合，這是與目前為止的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)全然不同的特征。因此，如果使用該修飾體，不會(huì)將對(duì)象物質(zhì)暴露于強(qiáng)堿性條件而使之變性，而能夠在溫和的條件下進(jìn)行純化。在本說(shuō)明書(shū)中，“堿性條件”是指pH9 pH13的范圍內(nèi)的氫離子指數(shù)?！癟M2 S36A-T78A-D116A”在大腸桿菌的可溶性級(jí)分中高表達(dá)。此外，保持二聚體的結(jié)構(gòu)，且對(duì)蛋白酶具有高耐受性?！癟M2 S36A-T78A-D116A”與“TM2 S36A-D116A” 一樣具有如下所述的與現(xiàn)有的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)完全不同的特征在弱酸性條件(PH4 6左右)下與生物素高效率地結(jié)合，在中性條件(PH7)下完全不與生物素結(jié)合。但是，其在堿性條件下與“TM2S36A-D116A”不同，和弱酸性條件下一樣同生物素高效率地結(jié)合。此外，“TM2 S36A-T78A-D116A”還具有完全不與亞氨基生物素結(jié)合、不能用亞氨基生物素進(jìn)行純化的特征。這一點(diǎn)與后述的IV型的性質(zhì)Vii)是相同的。“不能用亞氨基生物素進(jìn)行純化”的含義在IV型的說(shuō)明中詳述。本發(fā)明的修飾tamavidin(IV型)此外，作為本發(fā)明的修飾型TM2的I個(gè)實(shí)施方式，以在包含SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列、或者該序列中具有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、或者與該序列具有80%以上同一性的氨基酸序列，且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)(TM2或者TM2(變體))中，具有9) SEQ ID NO 2的78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基為特征。在本說(shuō)明書(shū)中，“tamavidin2(TM2) ”如上述定義。在本說(shuō)明書(shū)中，“取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基”如上述定義。這樣的修飾型TM2優(yōu)選是9-a) SEQ ID NO 2的78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2T78A-D116A)。這樣的修飾型TM2顯示下述性質(zhì)中的一個(gè)至全部；i)可以使用生物素進(jìn)行純化、
ii)保持由SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的四聚體結(jié)構(gòu)、iii)對(duì)蛋白酶具有耐受性、iv)在大腸桿菌的可溶性級(jí)分中顯示高表達(dá)、vii)不能用亞氨基生物素進(jìn)行純化。在本說(shuō)明書(shū)中，“可以使用生物素進(jìn)行純化”、“保持四聚體結(jié)構(gòu)”、“具有蛋白酶耐受性”以及“在大腸桿菌的可溶性級(jí)分中顯示高表達(dá)”如上述定義。在本說(shuō)明書(shū)中，“不能用亞氨基生物素進(jìn)行純化”是指因目的蛋白質(zhì)不與亞氨基生物素結(jié)合、或者與亞氨基生物素結(jié)合了的目的蛋白質(zhì)無(wú)法洗脫，從而使用亞氨基生物素的純化是不可能的。 “TM2 T78A-D116A”在大腸桿菌的可溶性級(jí)分中高表達(dá)。此外，保持四聚體的結(jié)構(gòu)，且對(duì)蛋白酶具有高耐受性。該修飾體具有如下所述的到目前為止全然不知的特異性質(zhì)用亞氨基生物素完全無(wú)法純化，但能夠用生物素極良好地純化。該修飾體可以用于例如諸如以下的用途。例如，在希望對(duì)某細(xì)胞以存在于該細(xì)胞表層的抗原為目標(biāo)進(jìn)行特異性標(biāo)記的情況下，首先將這些修飾體注射入被檢物，使之結(jié)合被檢物的血液中的內(nèi)生生物素。然后，將對(duì)該抗原特異性的抗體亞氨基生物素化，導(dǎo)入被檢物，從而將該細(xì)胞用亞氨基生物素標(biāo)記。最后，通過(guò)將放射性同位元素標(biāo)記或者熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、或者tamavidin這樣的與生物素強(qiáng)結(jié)合的蛋白質(zhì)注入被檢物，能夠特異性地標(biāo)記細(xì)胞。該系統(tǒng)中，預(yù)先降低了這些修飾體中內(nèi)生的生物素水平，因而背景低；而且，這些修飾體與生物素結(jié)合但不與亞氨基生物素結(jié)合，因而不與該細(xì)胞結(jié)合。通常，生物素結(jié)合蛋白與亞氨基生物素和生物素這兩者結(jié)合，因而若不使用這些修飾體，則上述系統(tǒng)不能成立。氨基酸的修飾方法用于對(duì)TM2的氨基酸進(jìn)行修飾來(lái)獲得本發(fā)明的修飾TM2的方法可以采用公知的對(duì)氨基酸序列實(shí)施突變的方法，對(duì)其沒(méi)有特殊限制。優(yōu)選對(duì)編碼本發(fā)明的修飾蛋白質(zhì)的核酸的堿基序列實(shí)施修飾來(lái)進(jìn)行修飾。例如，為了對(duì)氨基酸序列的特定位置的氨基酸進(jìn)行修飾，可以列舉出例如利用PCR的方法(Higuchi et al (1988) Nucleic Acid Res 16 :7351-7367, Ho et al. (1989) Gene77 :51-59) 0即，通過(guò)利用包含目標(biāo)突變的錯(cuò)配密碼子的引物進(jìn)行PCR，制作編碼目的變體的DNA并使之表達(dá)，能夠得到目的變體。另外，氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的修飾體可以通過(guò)對(duì)編碼野生型蛋白質(zhì)的DNA實(shí)施前述的作為公知技術(shù)的定點(diǎn)誘變等方法來(lái)制作。本發(fā)明的修飾型TM2中希望不加以修飾的氨基酸殘基本發(fā)明的修飾TM2中的氨基酸殘基的修飾是能夠使修飾型TM2通過(guò)具有適當(dāng)?shù)纳锼赜H和性而能夠進(jìn)行純化的修飾。另一方面，作為生物素結(jié)合蛋白之一的鏈霉抗生物素蛋白的生物素口袋已經(jīng)闡明。該鏈霉抗生物素蛋白與TM2之間的氨基酸序列同源性僅為50 %左右，但發(fā)明人等為了獲得關(guān)于TM2的生物素口袋的認(rèn)識(shí)，將TM2與鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列比對(duì)進(jìn)行了比較。于是發(fā)現(xiàn)在形成鏈霉抗生物素蛋白的生物素口袋的氨基酸中，與生物素直接相互作用的殘基 N23、S27、Y43、S45、N49、W79、S88、T90、W92、W108、W120、D128 (Weber etal. (1989) Science 243 :85-88)，在 TM2 中分別相當(dāng)于 N14、S18、Y34、S36、D40、W69、S76、T78、W80、W96、W108、D116，是非常保守的?？梢哉J(rèn)為，TM2與鏈霉抗生物素蛋白的生物素結(jié)合口袋具有非常相似的結(jié)構(gòu)，這些氨基酸殘基在很大程度上參與生物素結(jié)合。唯一的例外是，鏈霉抗生物素蛋白的49位的N(天冬酰胺)在TM2中是40位的D (天冬氨酸)。而且，關(guān)于49位的天冬酰胺，本發(fā) 明人等獲得了下述認(rèn)識(shí)在將其修飾成與鏈霉抗生物素蛋白一樣的天冬酰胺的TM2 D40NTM2中，生物素結(jié)合能力提高。因此，將40位的天冬氨酸取代成天冬酰胺而得到的修飾體的生物素結(jié)合能力過(guò)強(qiáng)，所以，上述的TM2D40N TM2不優(yōu)選在本發(fā)明中使用。特別是，4個(gè)色氨酸殘基(W69、W80、W96、W108)被認(rèn)為對(duì)生物素口袋的結(jié)構(gòu)起著重要的作用，因而，除了進(jìn)行在目前為止的修飾體的描述中限定的取代之外，優(yōu)選不進(jìn)行修飾。或者，在對(duì)它們進(jìn)行修飾時(shí)，希望修飾成性質(zhì)或者結(jié)構(gòu)類似的氨基酸，以便能夠保持與生物素的結(jié)合，例如希望修飾成苯丙氨酸(F)。另一方面，被認(rèn)為參與與生物素的結(jié)合的其它氨基酸，即被認(rèn)為在TM2中與生物素直接相互作用的氨基酸殘基(N14、S18、Y34、S36、S76、T78、D116)，除了進(jìn)行前文的描述中限定的取代的情形之外，希望不進(jìn)行修飾?；蛘?，在對(duì)這些氨基酸進(jìn)行修飾時(shí)，希望修飾成性質(zhì)或者結(jié)構(gòu)類似的氨基酸，以能夠維持與生物素的結(jié)合。例如，對(duì)于天冬酰胺(N14)，希望將其修飾成谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)，優(yōu)選谷氨酰胺；對(duì)于天冬氨酸(D40)，希望將其修飾成天冬酰胺(N)以外的氨基酸；對(duì)于絲氨酸(S18、S36、S76)，希望將其修飾成蘇氨酸(T)或者酪氨酸(Y)，優(yōu)選蘇氨酸；對(duì)于酪氨酸(Y34)，希望將其修飾成絲氨酸(S)或者蘇氨酸(T)，優(yōu)選蘇氨酸；對(duì)于蘇氨酸(T78)，希望將其修飾成絲氨酸(S)、酪氨酸(Y)，優(yōu)選絲氨酸；對(duì)于天冬氨酸(Dl 16)，希望將其修飾成谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)，優(yōu)選谷氨酸。而且，P46、A66、L97、V113也是亞基結(jié)合部位，因此，對(duì)于這些殘基，除了進(jìn)行前文的描述中限定的取代的情形之外，也希望不進(jìn)行修飾?；蛘撸趯?duì)這些氨基酸進(jìn)行修飾時(shí)，希望修飾成性質(zhì)或者結(jié)構(gòu)類似的氨基酸，以能夠維持與生物素的結(jié)合。例如，對(duì)于亮氨酸(L97)，希望將其修飾成異亮氨酸。然而，對(duì)任何一個(gè)而言，上述I)-9)中限定的氨基酸殘基像I) 9)中分別限定的那樣被取代。編碼修飾型TM2蛋白質(zhì)的核酸本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的修飾型TM2蛋白質(zhì)的核酸。這樣的核酸的堿基序列是將TM2的堿基序列(SEQ ID NO 1)修飾成編碼修飾型TM2蛋白質(zhì)的修飾氨基酸的堿基序列者。被修飾的堿基序列只要是編碼修飾后氨基酸的堿基序列即可，對(duì)其沒(méi)有限制。例如包括由SEQ ID N01的堿基序列組成的核酸(以下稱作“TM2基因”)，或與其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼能夠與生物素結(jié)合和解離、具有合適的生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的核酸，且該核酸是為了實(shí)施本發(fā)明的修飾而對(duì)堿基序列進(jìn)行修飾而得到的。本發(fā)明的核酸優(yōu)選編碼SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14、16、18以及20中的任何一個(gè)氨基酸序列。本發(fā)明的核酸更優(yōu)選由3、5、7、9、11、13、15、17和19中的任何一個(gè)核酸序列組成。包含本發(fā)明的核酸的載體此外，本發(fā)明提供包含編碼修飾型TM2蛋白質(zhì)的核酸的載體。優(yōu)選用于表達(dá)修飾TM2蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。編碼本發(fā)明的修飾型TM2蛋白質(zhì)的核酸如上述“編碼修飾型TM2蛋白質(zhì)的核酸”中所述，沒(méi)有特殊限制。編碼修飾型TM2蛋白質(zhì)的核酸的上游可配置有在希望的宿主中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子，或者其下游可配置有終止子。本發(fā)明的載體優(yōu)選是表達(dá)載體。表達(dá)載體除了如上述的表達(dá)單元(啟動(dòng)子+修飾型TM2編碼區(qū)域+終止子)之外，還可以具有能夠在希望的宿主中復(fù)制的單元、例如復(fù)制起點(diǎn)，此外，還可以具有用于選擇希望的宿主細(xì)胞的藥物抗性標(biāo)記基因。對(duì)于宿主沒(méi)有特殊限制，優(yōu)選是大腸桿菌。此外，該表達(dá)載體中還可以組入例如大腸桿菌中的乳糖阻遏物系統(tǒng)這樣的合適的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。固定化有修飾型TM2的承載體本發(fā)明提供固定化有本發(fā)明的修飾型TM2蛋白質(zhì)的承載體。 構(gòu)成的承載體的材料可以使用公知材料。包括例如纖維素、特氟隆、硝酸纖維素、瓊脂糖、高橋連瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉬、銀、銅、鐵、不銹鋼、鐵氧體、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹(shù)脂、多糖類、蛋白質(zhì)(白蛋白等)、碳或它們的組合，但不限于此。此外，優(yōu)選具有一定強(qiáng)度、組成穩(wěn)定、且非特異性結(jié)合少的承載體。固體承載體的形狀包括但不限于珠子、磁珠、薄膜、微細(xì)管、濾膜、平板、微量板、碳納米管、傳感器芯片等。正如本技術(shù)領(lǐng)域公知的那樣，薄膜或平板等平坦的固體承載體上可以設(shè)置凹坑、溝槽、濾膜底部等。在本發(fā)明的一類實(shí)施方式中，珠子可以具有約25nm 約Imm范圍的球體直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，珠子具有約50nm 約ΙΟμπι范圍的直徑。珠子的尺寸可以根據(jù)特定的用途來(lái)進(jìn)行選擇。對(duì)于蛋白質(zhì)針對(duì)承載體的結(jié)合沒(méi)有特殊限制，可以使用使蛋白質(zhì)結(jié)合于承載體的公知方法。具體的結(jié)合方法本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)承載體的種類等適宜選擇。
實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明，但這些并不是對(duì)本發(fā)明的技術(shù)范圍的限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于本說(shuō)明書(shū)的記載容易地對(duì)本發(fā)明加以修飾、變更，這些也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。實(shí)施{列I {氐親矛口十生(Low Affinity) tamavidin2 (LATM2)的構(gòu)建與分析1-1. {氐親矛口十生tamavidin2 (以下稱LATM2)的設(shè)計(jì)本發(fā)明人等基于對(duì)鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)晶結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，對(duì)鏈霉抗生物素蛋白與TM2的氨基酸序列進(jìn)行了比較研究，推定了 TM2中與生物素相互作用的氨基酸殘基，并認(rèn)識(shí)到這些氨基酸的配置與鏈霉抗生物素蛋白與生物素相互作用的氨基酸的配置相似。由此，推定TM2的氨基酸序列的69位、80位、96位、108位的色氨酸是與生物素疏水結(jié)合的氨基酸，而且，推定TM2的氨基酸序列的14位的天冬酰胺、18位的絲氨酸、34位的酪氨酸、36位的絲氨酸、76位的絲氨酸、78位的蘇氨酸和116位的天冬氨酸是與生物素氫鍵結(jié)合的氨基酸。此外，研究的結(jié)果，認(rèn)為46位的脯氨酸、66位的丙氨酸、97位的亮氨酸、113位的纈氨酸對(duì)TM2中的亞基間結(jié)合是重要的。
基于以上認(rèn)識(shí)，以降低TM2與生物素之間的親和性為目的，在TM2中導(dǎo)入氨基酸突變。首先，針對(duì)認(rèn)為對(duì)與生物素的疏水結(jié)合發(fā)揮重要作用的色氨酸(69位、80位、96位、108位的色氨酸)、認(rèn)為參與氫鍵的氨基酸(14位的天冬酰胺、18位的絲氨酸、34位的酪氨酸、36位的絲氨酸、116位的天冬氨酸、76位的絲氨酸、78位的蘇氨酸)進(jìn)行了突變導(dǎo)入。而且，針對(duì)認(rèn)為對(duì)亞基間的結(jié)合而言重要的氨基酸殘基(46位的脯氨酸、66位的丙氨酸、97位的亮氨酸、113位的纈氨酸)也進(jìn)行了突變導(dǎo)入。S卩，為了構(gòu)建LATM2，構(gòu)建了以下的30個(gè)TM2修飾體。(I) 108位的色氨酸取代成賴氨酸而得到的TM2(以下也稱“TM2 W108K”)；(2)69位的色氨酸取代成賴氨酸而得到的TM2(以下也稱“TM2 W69K”)；(3) 80位的色氨酸取代成賴氨酸而得到的TM2(以下也稱“TM2 W80K”、堿基序列如 SEQ ID NO 3所示、氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示);(4) 36位的絲氨酸突變成丙氨酸而得到的TM2 (以下也稱“TM2 S36A”、堿基序列如SEQ ID NO 5所示、氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示);(5)具有36位的絲氨酸到丙氨酸的取代、78位的蘇氨酸到丙氨酸的取代、以及116位的天冬氨酸到丙氨酸的取代的TM2(以下也稱“TM2S36A-T78A-D116A”、堿基序列如SEQID NO 7所示、氨基酸序列如SEQ IDNO 8所示);(6) 14位的天冬酰胺突變成丙氨酸而得到的TM2 (以下也稱“TM2 N14A” )；(7) 78位的蘇氨酸突變成丙氨酸而得到的TM2 (以下也稱“TM2 T78A”、堿基序列如SEQ ID NO :9所示、氨基酸序列如SEQ ID N0:10所示)；(8) 116位的天冬氨酸突變成丙氨酸而得到的TM2(以下也稱“TM2 D116A”、堿基序列如SEQ ID NO :11所示、氨基酸序列如SEQ ID N0:12所示)；(9)66位的丙氨酸突變成精氨酸而得到的TM2(以下也稱“TM2 A66R”)；(10)具有46位的脯氨酸到蘇氨酸的取代和66位的丙氨酸到精氨酸的取代的TM2(以下也稱 “TM2 P46T-A66R”)；(11) 113位的纈氨酸突變成精氨酸而得到的TM2(以下也稱“TM2 V113R”)；(12)具有46位的脯氨酸到蘇氨酸的取代和113位的纈氨酸到精氨酸的取代的TM2(以下也稱 “TM2 P46T-V113R”)。(13)具有46位的脯氨酸到蘇氨酸的取代和78位的蘇氨酸到丙氨酸的取代的TM2(以下也稱“TM2 P46T-T78A”、堿基序列如SEQ ID NO : 13所示、氨基酸序列如SEQ IDNO 14 所示)。(14)具有46位的脯氨酸到蘇氨酸的取代和116位的天冬氨酸到丙氨酸的取代的TM2(以下也稱“TM2 P46T-D116A”、堿基序列如SEQ ID NO :15所示、氨基酸序列如SEQ IDNO 16 所示)ο(15)具有46位的脯氨酸到蘇氨酸的取代和78位的蘇氨酸到丙氨酸的取代和116位的天冬氨酸到丙氨酸的突變的TM2(以下稱“TM2 P46T-T78A-D116A”、堿基序列如SEQ IDNO 17所示、氨基酸序列如SEQ ID NO 18所示)。(16)具有46位的脯氨酸到蘇氨酸的取代和66位的丙氨酸到精氨酸的取代和97位的亮氨酸到蘇氨酸的突變的TM2(以下稱“TM2 P46T-A66R-L97T”)。(17)具有108位的色氨酸到谷氨酸的突變的TM2 (以下稱“TM2 W108E” )。
(18)具有108位的色氨酸到精氨酸的突變的TM2 (以下也稱“TM2 W108R”)。(19)具有96位的色氨酸到賴氨酸的突變的TM2 (以下也稱“TM2 W96K”)。(20)具有36位的絲氨酸到丙氨酸的取代和116位的天冬氨酸到丙氨酸的取代的TM2(以下也稱“TM2 S36A-D116A”、堿基序列如SEQ ID NO :19所示、氨基酸序列如SEQ IDNO 20 所示)。(21)具有18位的絲氨酸到丙氨酸的突變的TM2(以下也稱“TM2 S18A”)。(22)具有78位的蘇氨酸到丙氨酸的取代和116位的天冬氨酸到丙氨酸的取代的TM2(以下也稱“TM2 T78A-D116A”、堿基序列如SEQ ID NO :21所示、氨基酸序列如SEQ IDNO 22 所示)。(23)具有34位的酪氨酸到丙氨酸的突變的TM2 (以下也稱“TM2 Y34A”)。
·
(24)具有46位的脯氨酸到蘇氨酸的突變的TM2 (以下也稱“TM2 P46T”)。(25)具有46位的脯氨酸到蘇氨酸的取代和97位的亮氨酸到蘇氨酸的取代的TM2(以下也稱“TM2 P46T-L97T”)。(26)具有46位的脯氨酸到蘇氨酸的取代和66位的丙氨酸到精氨酸的取代和97位的亮氨酸到蘇氨酸的突變和113位的纈氨酸到精氨酸的取代的TM2(以下也稱“TM2P46T-A66R-L97T-V113R”)。(27)具有66位的丙氨酸到精氨酸的取代和113位的纈氨酸到精氨酸的取代的TM2(以下也稱 “TM2 A66R-V113R”)。(28)具有66位的丙氨酸到精氨酸的取代和97位的亮氨酸到蘇氨酸的取代和113位的纈氨酸到精氨酸的取代的TM2(以下也稱112八661 -1^71';1131 ”)。(29)具有97位的亮氨酸到蘇氨酸的突變的TM2 (以下也稱“TM2 L97T”)。(30)具有97位的亮氨酸到蘇氨酸的突變和113位的纈氨酸到精氨酸的取代的TM2(以下也稱“TM2 L97T-V113R”)。首先，設(shè)計(jì)了為了進(jìn)行用于構(gòu)建LATM2的突變導(dǎo)入而使用的PCR用引物。設(shè)計(jì)了 由TM2基因的5’部分的區(qū)域的序列和在其上游配置限制酶PciI切割位點(diǎn)(ACATGT)而得到的序列構(gòu)成的引物Tm2 5’ Pci，由TM2基因的3’部分的區(qū)域和在其下游配置限制酶BamHI切割位點(diǎn)(GGATCC)而得到的序列構(gòu)成的引物Tm2 3’Bam。包含針對(duì)各修飾tamavidin2的錯(cuò)配密碼子的一系列有義引物和反義引物分別如表I所示。而且，表I中，限制酶識(shí)別位點(diǎn)用下劃線表示，突變導(dǎo)入部位用點(diǎn)線表示。[表I]低親和性tamavidin構(gòu)建用引物
名稱_序列5，-3，__
TM2W108KFw CGTGGGGACGTAAAAGAATCCACACTT27-mer (SEQ ID NO: 63)
權(quán)利要求
1.一種修飾型生物素結(jié)合蛋白，其是包含SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列，或在該序列中具有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列，或與該序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，且其具有選自下組的取代 DSEQ ID NO 2的36位的絲氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基； 2)SEQ ID NO 2的80位的色氨酸殘基取代成親水性氨基酸殘基； 3)SEQ ID NO 2的116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基； 4)SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基取代成蘇氨酸、絲氨酸或者酪氨酸殘基、以及78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基； 5)SEQ ID NO :2的46位的脯氨酸殘基取代成蘇氨酸、絲氨酸或者酪氨酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基以及 6)SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基取代成蘇氨酸、絲氨酸或者酪氨酸殘基、78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其選自下組 1-a)SEQ ID NO :2的36位的絲氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 S36A)； 2-a)SEQ ID NO :2的80位的色氨酸殘基被取代成賴氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 W80K)； 3-a)SEQ ID NO :2的116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 D116A)； 4-a)SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基被取代成蘇氨酸、且78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 P46T-T78A)； 5-a)SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基被取代成蘇氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2P46T-D116A);以及 6-a)SEQ ID NO :2的46位的脯氨酸殘基被取代成蘇氨酸、78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2P46T-T78A-D116A)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其滿足以下性質(zhì)中的一個(gè)至全部 i)可以使用生物素進(jìn)行純化； ii)保持由SEQID NO 2的記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的四聚體結(jié)構(gòu)； iii)對(duì)蛋白酶具有耐受性；以及 iv)在大腸桿菌的可溶性級(jí)分中顯示高表達(dá)。
4.一種修飾型生物素結(jié)合蛋白，其是包含SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列，或在該序列中具有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列，或與該序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，且其具有下述取代 6)SEQ ID NO 2的78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其是 6-a) SEQ ID NO :2的78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸殘基的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2 T78A)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其滿足下述性質(zhì)中的一個(gè)至全部 i)可以使用生物素進(jìn)行純化； ii)保持由SEQID NO 2的記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的四聚體結(jié)構(gòu)； iii)對(duì)蛋白酶具有耐受性；以及 V)與由SEQ ID NO :2的記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)相比，具有更高的耐熱性。
7.一種修飾型生物素結(jié)合蛋白，其是包含SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列，或在該序列中具有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列，或與該序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，且其具有選在下組的取代 7)SEQ ID NO :2的36位的絲氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基；以及 8)SEQ ID NO :2的36位的絲氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其選自下組 7-a)SEQ ID NO 2的36位的絲氨酸殘基被取代成丙氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2S36A-D116A);以及 8-a)SEQ ID NO :2的36位的絲氨酸殘基被取代成丙氨酸、78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2S36A-T78A-D116A)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其滿足下述性質(zhì)中的一個(gè)至全部 i)可以使用生物素進(jìn)行純化； iii)對(duì)蛋白酶具有耐受性；以及 vi)在弱酸性條件下與生物素結(jié)合、且在中性條件下不與生物素結(jié)合。
10.一種修飾型生物素結(jié)合蛋白，其是包含SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列，或在該序列中具有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列，或與該序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，且其具有下述取代 9)SEQ ID NO 2的78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其是 9-a)SEQ ID NO 2的78位的蘇氨酸殘基被取代成丙氨酸、且116位的天冬氨酸殘基被取代成丙氨酸的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2T78A-D116A)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11中任一項(xiàng)所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其滿足下述性質(zhì)中的一個(gè)至全部 i)可以使用生物素進(jìn)行純化； ii)保持由SEQID NO 2的記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的四聚體結(jié)構(gòu)； iii)對(duì)蛋白酶具有耐受性；iv)在大腸桿菌的可溶性級(jí)分中顯示高表達(dá)；以及 vii)不能用亞氨基生物素進(jìn)行純化。
13.根據(jù)權(quán)利要求I 12中任一項(xiàng)所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其與由SEQID NO 2所述的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)相比，顯示更低的生物素結(jié)合性。
14.根據(jù)權(quán)利要求I 13中任一項(xiàng)所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其滿足以下的a)-I)中的一個(gè)至全部a)SEQ ID NO :2的14位的天冬酰胺殘基未被修飾，或者被取代成谷氨酰胺或天冬氨酸；b)SEQID NO 2的18位的絲氨酸殘基未被修飾，或者被取代成蘇氨酸或酪氨酸；c)SEQID NO :2的34位的酪氨酸殘基未被修飾，或者被取代成絲氨酸或蘇氨酸；d)SEQ ID NO 2的36位的絲氨酸殘基未被修飾，或者被取代成蘇氨酸或酪氨酸；e)SEQID NO 2的40位的天冬氨酸殘基未被修飾，或者被取代成天冬酰胺以外的殘基; f)SEQ ID NO 2的69位的色氨酸殘基未被修飾；g)SEQ ID NO 2的76位的絲氨酸殘基未被修飾，或者被取代成蘇氨酸或酪氨酸；h)SEQ ID NO 2的78位的蘇氨酸殘基未被修飾，或者被取代成絲氨酸或酪氨酸； i)SEQID NO 2的80位的色氨酸殘基未被修飾； j) SEQ ID NO 2的96位的色氨酸殘基未被修飾； k) SEQ ID NO 2的108位的色氨酸殘基未被修飾； 1)SEQ ID NO 2的116位的天冬氨酸殘基未被修飾，或者被取代成谷氨酸或天冬酰胺； m) SEQ ID NO 2的46位的脯氨酸殘基未被修飾； n) SEQ ID NO 2的66位的丙氨酸殘基未被修飾； o)SEQ ID NO 2的97位的亮氨酸殘基未被修飾、或者被修飾成異亮氨酸；以及 p)SEQ ID NO 2的113位的纈氨酸殘基未被修飾； 但是，這其中，I) 9)中限定的氨基酸殘基如I) 9)中分別限定的那樣被取代。
15.權(quán)利要求I 14中任一項(xiàng)所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其包含與SEQID NO 2所述的氨基酸序列具有90%以上的同一性氨基酸序列。
16.固定化有權(quán)利要求I 15中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的承載體。
17.編碼權(quán)利要求I 15中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的核酸。
18.包含權(quán)利要求17所述的核酸的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供下述修飾型生物素結(jié)合蛋白在包含SEQ ID NO2所述的氨基酸序列或者其突變序列、且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)中，具有選自下組中的取代1)SEQ ID NO2的36位的絲氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基；2)SEQ ID NO2的80位的色氨酸殘基取代成親水性氨基酸殘基；3)SEQ ID NO2的116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基；4)SEQ ID NO2的46位的脯氨酸殘基取代成蘇氨酸、絲氨酸或者酪氨酸殘基、以及78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基；5)SEQID NO2的46位的脯氨酸殘基取代成蘇氨酸、絲氨酸或者酪氨酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基；以及6)SEQ IDNO2的46位的脯氨酸殘基取代成蘇氨酸、絲氨酸或者酪氨酸殘基、78位的蘇氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基、以及116位的天冬氨酸殘基取代成不形成氫鍵的氨基酸殘基。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102803485SQ20098016010
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日
發(fā)明者高倉(cāng)由光, 綱島雅子, 惣福梢 申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社