專利名稱：：一種新疆姜氏放線菌及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及微生物菌種及其應用領域，具體的說，本發(fā)明涉及一種姜氏放線菌及其應用的
技術領域：
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背景技術：
：放線菌類群是十分重要的高G+C含量的革蘭陽性細菌，它們的培養(yǎng)形態(tài)與細菌有本質區(qū)別，大多數(shù)產(chǎn)生菌絲結構，包括培養(yǎng)基中的基質菌絲和培養(yǎng)基表面的氣生菌絲及孢子絲。迄今已發(fā)表145個屬，約2000個種。放線菌與人類的生產(chǎn)和生活關系極為密切，目前廣泛應用的抗生素約70%是各種放線菌所產(chǎn)生。一些種類的放線菌還能產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、和纖維素酶等各種酶制劑、維生素(B12)和有機酸等。弗蘭克菌屬(,M/h'a)為非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的內共生菌。此外，放線菌還可用于甾體轉化、烴類發(fā)酵、石油脫蠟和污水處理等方面。少數(shù)放線菌也會對人類構成危害，引起人和動植物病害。因此，放線菌與人類關系密切，在醫(yī)藥工業(yè)上有重要意義。放線菌在自然界分布廣泛，主要以孢子或菌絲狀態(tài)存在于土壤、空氣和水中，尤其是含水量低、有機物豐富、呈中性或微堿性的土壤中數(shù)量最多。土壤特有的泥腥味，主要是放線菌的代謝產(chǎn)物所致。姜氏菌屬于2005年由宋磊等人建立，到目前為止，該姜氏放線菌屬總共有2個有效種<3"<3///7力27<3和//a/7《e"3^2"5^e刀57s。姜氏菌屬的主要特征是革蘭氏陽性，基內菌絲斷裂。氣生菌絲分化較好，無孢子形成。優(yōu)勢醌為MK-9(H4),主要脂肪酸是anteiso-ds:(),anteiso-Cn:。，iso-C15:0，iso-C16:。，但未見有關應用的報道。
發(fā)明內容針對國內外有關姜氏放線菌領域的研究現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種新疆姜氏放線菌及其應用。所述的新疆姜氏放線菌產(chǎn)生可溶性色素，硝酸鹽還原陽性，能夠水解淀粉，纖維素等特點，這些特性明顯區(qū)別于已公開報道的其他姜氏放線菌有效種。本發(fā)明具體提供一種新疆姜氏菌(//a/7ge/^x//y/a/7ge/7S")。本發(fā)明通過以不同的培養(yǎng)溫度、pH值、培養(yǎng)基為富集條件，從新疆鹽湖土樣中取樣，分離篩選得到多抹菌，經(jīng)過多級篩選，確定一抹新疆姜氏放線菌(//a/^e"aXJEEM11102T)，命名為新疆姜氏菌。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101。保藏日期是2009年3月30日，保藏號是CGMCC.No2997。經(jīng)微生物學鑒定為新疆姜氏菌(//a/^W/ai//7/^/^e/Ly/"。該菌革蘭氏陽性、兼性厭氧。能夠在沒有氧而有硝酸鹽的環(huán)境中進行呼吸作用?；鶅染z生長良好，氣生菌絲不發(fā)達，基內菌絲會發(fā)生斷裂、氣生菌絲無孢子鏈。最適生長在無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基，中度生長在察氏瓊脂培養(yǎng)基、燕麥瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯浸汁瓊脂培養(yǎng)基，較弱生長在酵母膏-麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基、甘油-天門冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基?；鶅染z顏色為白色，氣生菌絲顏色為白色到黃白色，有可溶性色素產(chǎn)生。NaCl生長耐受范圍0-5%(w/v),最適生長NaCl濃度、pH和溫度分別為0-3°/、7.Q和37。C。氧化酶和過氧化氫酶陽性。不產(chǎn)生黑色素和石充化氫。曱基紅和VP測試都是陰性。牛奶凝固和胨化實驗陽性。明膠液化陽性，能夠夠降解淀粉、纖維素、Tweens40，60，80。但不能利用糊精、酪素、幾丁質、Tween20。脲酶陰性。硝酸鹽還原陽性。石咸性磷酸酶、酯酶(C4)、類脂酯酶(C8)、類脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、P-半乳糖戒酶、(3-糖醛酸武酶、oc-糖醛酸戒酶、(3-葡萄糖戒酶表現(xiàn)陽性。但a-半乳糖戒酶、纈氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、a-甘露糖戒酶、P-巖藻糖戒酶為陰性。能夠利用以下碳源，氮源作為唯一能源半乳糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、甜醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨醇、赤藻糖醇、甘油、淀;盼、乙酸鈉、丙酸鈉、蘇氨酸、精氨酸、絲氨酸、組氨酸。但不能利用葡萄糖、阿拉伯糖、纖維二糖、核糖、果糖、棉籽糖、木糖、海藻糖、乳糖、檸檬酸三鈉、賴氨酸、甘氨酸。全細胞水解產(chǎn)物阿拉伯糖、核糖和鼠李糖。曱基奈醌為MK-9(H4)。主要脂肪酸含iso-Ci5:。(37.3%)，anteiso-Ci5:。(34.5%)和anteiso-Ci7:。(15.9%)。DNA基因的G+C含量是71.5mol°/。。通過對該菌種新疆姜氏菌(//犯ge/"x/7U'/a/^e/^/s)CGMCC.No2997的形態(tài)觀察、培養(yǎng)特征、生理生化特性和細胞化學分析按《放線菌系統(tǒng)學——方法、原理與實踐》所用的方法進行。酶學特性-換APIZYM(BioM6rieux)試劑條根據(jù)手工操作說明進行。菌抹醌組分測定用高壓液相(HPLC)來分析醌型。脂肪酸組分分析采用美國MIDI司Sherolock全自動細菌鑒定系統(tǒng)MIDI0l//cro6/a/A/e/〃/7c"/朋5y"e范)分析。G+Cmol%觀'J定采用高壓液相(HPLC)測定。DNA同源性采用液相復性速率法(DeLeyW<3/.,1970;HuP"a/.，1983;Jahnke，1992)，參考菌抹//a/^e"a.s/h/7》力/7aDSM450791和卵/L〃e/^/sHM0027分別由德國《效生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(Cer鵬/6W/ec〃aoWcrc)0，/7/57zws/dCe//C〃〃w_re,DSMZ)和云南微生物研究所放線菌研究室獲得，用于DNA-DNA同源性雜交分析。本發(fā)明通過總DNA的提取、16SrRNA基因的PCR擴增和測序按李文均等使用的方法進行U/Wa/.,2007)。根據(jù)測序結果，用Blast搜索軟件從GenBank、EMBL等數(shù)據(jù)庫中調出相似性較高的相關放線菌菌抹的16SrRNA基因序列，用CLUSTALX進行多序列比對，并釆用Saitou和Nei的鄰接法(NeighborJoining)用MEGA4軟件進行系統(tǒng)進化樹的構建和同源性比較。經(jīng)測定，新疆姜氏菌(//a/^e/"x/"y/s/^e/^")CGMCC.No2997的16srRNA基因序列為1389bp,具體為從16srRM基因構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹上可明顯的看到菌新疆姜氏菌(//a/^e/7a7//u7a/^ew/、)CGMCC.No2997與姜氏菌屬的2個有效種聚為一支，并形成獨立的分支。與典型種//a/^e/"37^///7力27<3和//a/^e/"卵/^〃e/^"的相似性分別為98.7%,98.6%，DNA-DNA雜交值分別為45.6%和48.5%,都遠遠低于70%這個定義新種的雜交值(Wayneetal.，1987)?；诰陆暇?//a/^e/h^X/7a/^e/w2、)CGMCC.No2997的表型，生理生化，基因型比較分析表明菌XJEEM11102T的分類地位為細菌域、放線菌門、放線菌綱、姜氏菌屬(//3/^^//<3)，是姜氏菌屬的一個新菌種?；谠摼N革蘭氏陽性、兼性厭氧；能夠在沒有氧而有硝酸鹽的環(huán)境中進行呼吸作用；基內菌絲生長良好，氣生菌絲不發(fā)達，基內菌絲會發(fā)生斷裂、氣生菌絲無孢子鏈；最適生長在無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基，中度生長在察氏瓊脂培養(yǎng)基、燕麥瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯浸汁瓊脂培養(yǎng)基，較弱生長在酵母膏-麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基、甘油-天門冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；基內菌絲顏色為白色，氣生菌絲顏色為白色到黃白色，有可溶性色素產(chǎn)生。NaCl生長耐受范圍0-5%(w/v),最適生長NaCl濃度為0-3%(w/v)、pH為7.0和溫度37°C。氧化酶和過氧化氫酶陽性。不產(chǎn)生黑色素和硫化氬。曱基紅和VP測試都是陰性。牛奶凝固和胨化實驗陽性。明膠液化陽性，能夠夠降解淀粉、纖維素、Tweens40，60，80。但不能利用糊精、酪素、幾丁質、Tween20等特性，本發(fā)明提供的新疆姜氏菌(//a/^e7/az//u7<3/^e/^/s)CGMCC.No2997廣泛應用于淀4分酶、纖維素酶、半乳糖戒酶活性等工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領域。本發(fā)明進一步將種子液以2.5%的接種量接種于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，180r/min，37。C培養(yǎng)32h,10000r/min離心10min，去除菌體，以65%的飽和度向上清液中加入硫酸銨，待辟^酸銨充分溶解后于4。C下鹽析2h，然后再以12000r/min離心20min，用25mM的Tris-HC1將沉淀溶解，在含有5mMCa2+、25mM的Tris-HC1溶液中4。C下透析8h,中間換一次透析液，結束后以10000r/min離心10min，除去雜質，所得上清液即為淀粉酶。同時，本發(fā)明將新疆姜氏菌(//a，/7sf勿7鄉(xiāng)譜/s)CGMCC,No2997的種子液按2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，180r/min,37°C,培養(yǎng)24h;將培養(yǎng)好的發(fā)酵液10000r/min，離心10min,取上清液，加入65%硫酸銨，靜置2h后，10000r/min離心25min,用適量25mM，pH為7.0的Tris-HCL緩沖液溶解沉淀，然后4。C透析12h,再經(jīng)過DEAE-sepharoseFlatFlow和S印hacrylS-200方法得到纖維素酶。通過實施本發(fā)明具體的技術指標，可以達到以下有益效果。本發(fā)明的新疆姜氏菌(//a/^e/"x2X/7a/^e/^/s)CGMCC.No2997有效地產(chǎn)生可溶性色素，硝酸鹽還原陽性，能夠水解淀粉，纖維素，廣泛應用于淀粉酶、纖維素酶、酯酶、半乳糖戒酶活性等工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領域。圖1所示為新疆姜氏菌(//3攀/7ax/zu7a/,^)CGMCC.No2997及其相關屬種構建的16srRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹狀關系。下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。具體實施例方式實施例一新疆姜氏放線菌的篩選、分離1.分離本發(fā)明所述的新疆姜氏放線菌是從新疆鹽湖土樣中，用纖維素酪素復合鹽培養(yǎng)基10g微晶纖維素，0.3g酪素，0.2gKN03,0.5gK2HP04,0.02gCaC03,O.OlgFeS04,50gNaCl，30gMgCl26H20，20gKC1and15gagar,采用平4反稀釋涂布法，分離到一抹放線菌XJEEM11102T。分離步驟為取新疆鹽湖土樣2g、放入20ml已滅菌的含5%NaCl溶液，37°C振蕩(100r.p.m)30分鐘，取0.2ml10-2溶液、涂布于纖維素酪素復合鹽平板培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)3周，挑單菌落于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)、純化2次，確認為純菌抹后，用于科研和保藏。菌種采用凍干物安瓿管保藏、甘油管保藏和液氮保藏等保藏方式。2.培養(yǎng)條件培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏5，0g,蒸餾水1000mL，pH7.4。NaCl生長耐受范圍0-5%,最適生長NaCl0-3%。最適生長pH:7.0。最適生長溫度37。C。好氧。3.繁殖用接種針取少量菌絲于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)3天后，基內菌絲生長，氣生菌絲還未發(fā)育，可溶性色素產(chǎn)生(黃褐色)；培養(yǎng)12天后，氣生菌絲發(fā)育生長、為白色。4.菌種描述本發(fā)明所述的新疆姜氏》丈線菌(//a/^e/hz/zu'/a/^e/^/sXJEEM11102T)革蘭氏陽性、兼性厭氧。能夠在沒有氧而有硝酸鹽的環(huán)境中進行呼吸作用。基內菌絲生長良好，氣生菌絲不發(fā)達，基內菌絲會發(fā)生斷裂、氣生菌絲無孢子鏈。在甘油天門冬酰胺、酵母膏-麥芽膏、察氏和無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，但在馬鈴薯培養(yǎng)基上不生長，只在燕麥片和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基產(chǎn)生可溶性色素?；鶅染z顏色為白色，氣生菌絲顏色為白色到黃白色，有可溶性色素產(chǎn)生。NaCl生長耐受范圍0-5%(w/v),最適生長NaCl濃度、pH和溫度分別為0-3°/。、7.0和37°C。氧化酶和過氧化氫酶陽性。不產(chǎn)生黑色素和硫化氬。曱基紅和VP測試都是陰性。牛奶凝固和胨化實驗陽性。明膠液化陽性，能夠夠降解淀粉、纖維素、Tweens40,60,80。但不能利用糊4青、酪素、幾丁質、Tween20。脲酶陰性。硝酸鹽還原陽性。堿性磷酸酶、酯酶(C4)、類脂酯酶(C8)、類脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、p-半乳糖甙酶、P-糖醛酸甙酶、oc-糖醛酸甙酶、p-葡萄糖甙酶表現(xiàn)陽性。但oc-半乳糖甙酶、纈氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、a-甘露糖甙酶、P-巖藻糖戒酶為陰性。能夠利用以下碳源，氮源作為唯一能源半乳糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、甜醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨醇、赤藻糖醇、甘油、淀粉、乙酸鈉、丙酸鈉、蘇氨酸、精氨酸、絲氨酸、組氨酸。但不能利用葡萄糖、阿拉伯糖、纖維二糖、核糖、果糖、棉籽糖、木糖、海藻糖、乳糖、檸檬酸三鈉、賴氨酸、甘氨酸。全細胞水解產(chǎn)物阿拉伯糖、核糖和鼠李糖。甲基萘醌為MK-9(H4)。主要脂肪酸含iso-d5:o(37.3%)，anteiso-C15:o(34.5%)和anteiso-C17:o(15.9%)。DNA基因的G+C含量是71.5mol%。實施例二新疆姜氏菌(//a/2ge//ai/'/u'/a/zge/^")CGMCC.No2997的多相分類鑒定1.表型特征和化學分類特征形態(tài)觀察、培養(yǎng)特征、生理生化特性和細胞化學分析按《放線菌系統(tǒng)學——方法、原理與實踐》所用的方法進行。酶學特性按APIZYM(BioM6rieux)試劑條根據(jù)手工操作說明進行。菌抹醌組分測定用高壓液相(HPLC)來分析醌型。脂肪酸組分分析釆用美國MIDI/>司Sherolock全自動細菌鑒定系統(tǒng)MIDI(MicrobialIdentificationSystem)分析。G+Cmol。/。測定采用高壓液相(HPLC)測定。DNA同源性采用液相復性速率法(DeLeyWa/.,1970;歸etal.,1983;Jahnke,1992),參考菌抹/Z^^e"aa/h^W/aDSM45079T^/L^e/^/sYIM002T分別由德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(GermanCollectionofMicroorganismsandCelICulture，DSMZ)和云南微生物研究所放線菌研究室獲得，用于DNA-DNA同源性雜交分析。表l.菌抹XJEEM11102與標準菌抹//a/^e/厶a/h/7》力/7sDSM45079T和//a/^e/hga/wwe/Ly/sYIM002T生理4爭;f正差異。特征X正EM11102TDSM45079TYIM002T碳源利用阿拉伯糖—++纖維二糖—++檸檬酸——+甜醇+—-赤藻糖醇+--果糖—++半乳糖+-+葡萄糖—++肌醇+-+甘露醇+-—海藻糖-+生長條件5%NaCl+-+pH10.0++45°C+--降解利用淀粉+—尿素—-+次黃嘌呤++-黃嘌呤+—-硝酸鹽降解+--G+C含量71.5%71.5%70%表2.菌XJEEM11102T與標準菌4朱//^ge7hDSM45079T和^3/卯e/^/sYIM002T細胞脂肪酸差異。FattyXJEEM111021DSM45079JYIM002T飽和脂肪酸Ci2:0—1.41.4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.16SrRNA基因序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析總DNA的提取、16SrRNA基因的PCR擴增和測序按李文均等使用的方法進行(LiW，2007)。根據(jù)測序結果，用Blast搜索軟件從GenBank、EMBL等數(shù)據(jù)庫中調出相似性較高的相關放線菌菌林的16SrRNA基因序列，用CLUSTALX進行多序列比對，并采用Saitou和Nei的鄰接法(NeighborJoining)用MEGA4軟件進行系統(tǒng)進化樹的構建和同源性比較。3.建議成為新種的理由姜氏菌屬于2005年由宋磊等人建立，到目前為止，該屬總共有2個有效種，//a/ge//<3a7As7/p力27s和J7s/7ge/7a^3;5"i/e/Ly/61。姜氏菌屬的主要凈爭4正是革蘭氏陽性，基內菌絲斷裂。氣生菌絲分化較好，無孢子形成。優(yōu)勢醌為MK-9(H4)，主要月旨肪酸是anteiso-C15:o，anteiso-Ci7:0,iso-Ci5:o,iso-Ci6:0。菌XJEEM11102T符合這些主要特征。菌XJEEM11102T產(chǎn)生可溶性色素，硝酸鹽還原陽性，能夠水解淀粉，纖維素這些特性明顯區(qū)別于其他2個有效種。同時碳源利用也有很大不同，具體結果總結在表1中。支鏈脂肪酸iso-C15:Q(37.3%)含量明顯高于典型種//a/^e/"a/h/y^A/h(5.3%)和77s/^e/7s^/^〃e"Ws(5.3%)，但iso-(:16:(3含量明顯低于另外2個有效種，其他成分變化總結在表2中。從附圖1所示16srRNA基因構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹上可明顯的看到菌XJEEM11102T與姜氏菌屬的2個有效種聚為一支，并形成獨立的分支。與典型種//a/7ge7/a<3/1"<3//'/7力7/<3和^3775^e/LS"/i"的相似性分另'J為98.7%，98.6%,DNA-DNA雜交值分別為45.6%和48.5%，都遠遠低于70°/。這個定義新種的雜交值(Wayneetal.,1987)?；诰鶻JEEM111027的表型，生理生化，基因型比較分析表明菌XJEEM11102T是姜氏菌屬的一個新菌種。實施例三細菌基因組的提取與16srRM基因的測序l.基因組總MA的小量提取A.稱取凍存的濕菌體或新鮮菌體3-5g，充分研磨至菌體團變?yōu)楹隣?。B.轉入50mL螺口管中，按10mL/g菌體的量加入lxTEBuffer,按5mg/g菌體加溶菌酶，蝸旋lmin,置37。C溫箱保溫約(2-24h)至液體變粘。C.按0.5mg/g菌體加入蛋白酶K,同時加入lmL20y。的SDS，37。C保溫lh或更長時間；D.加入2mL5mol/LNaCl,充分混勻，再加入約2mLCTAB溶液，混勻，65。C溫育10min或更長時間；E.冷卻至室溫后再加入等體積的苯酚氯仿異戊醇=25:24:1的溶液，混勻；F.10000r/min,4。C離心10min,收集水相；G.重復步驟(E)與(F),直到蛋白等雜質除盡為止；H.加入1/10體積的3mol/LNaAc和等體積的-20。C異丙醇，用玻璃棒攪絲，70%乙醇，100%無水乙醇依次洗滌。4。C下溶于適量1xTE中；I.加入10mg/mL的RNA酶(RNase，上海華舜生物工程有限/>司)至終濃度100ug/mL，37。C溫育30min或更長時間；J.冷卻至室溫后用等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:l，v/v)抽提一至兩次。重復步驟(4)與(5);K.加入1/1Q體積的3mo1/LNaAc溶液，混勻后用等體積的異丙醇沉淀DNA，用璃棒攪絲。用70。/。乙醇洗滌DNA。4。C下溶于適量TE溶液中備用。2.16SrRNA基因擴增列為PA:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(與16SrDNA5'端8-27位點堿基相同)；PB:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'(與16SrDNA3'端1523-1504位點石咸基互補)。PCR擴增條件95。C預變性5min;95。C變性lmin,54。C退火lmin，72°C延伸2min,35個循環(huán),72。C延伸10min。3PCR結果檢測分別取5ja1PCR產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，如果在1500bp的DNA分子標記處有一亮帶則表明有目的片段擴增。4.測序將PCR產(chǎn)物送上海生工技術公司進行測序。5.系統(tǒng)發(fā)育分析將所得到序列利用Blast軟件在GenBank，EMBL及DDBJ等數(shù)據(jù)庫中進行相似性搜索，選取同源性比較高的典型菌抹的16SrRNA基因序列作為參比對象，然后用CLUSTALX軟件，進行多序列比對并計算供試菌抹與參比菌抹之間的序列相似性，采用鄰接法(Neighbor-Joining)，用MEGA4構建供試菌與參比菌之間的系統(tǒng)進化樹。實施例四新疆姜氏菌(//'a/^e/7a"'i力'a/^e/^/s)CGMCC.No2997的應用用接種針取少量菌絲于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)一周后，觀察培養(yǎng)基顏色變化。與對照相比，菌XJEEM11102T分泌出茶褐色可溶性色素在培養(yǎng)基內。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏5.0g，蒸餾水1000mL,pH7.4。實施例五新疆姜氏菌(//a/^ey/a)CGMCC.No2997的應用將菌抹分別接種于淀粉瓊脂平板上，待菌生長良好時，在菌落周圍滴加碘液，菌落周圍形成白色透明圈為陽性。菌XJEEM11102T產(chǎn)生白色透明圈表明有水解淀粉的能力。淀粉水解培養(yǎng)基可溶性淀粉10g,K2HP040.3g,MgC031.Og,瓊脂20g,蒸餾水lQOOml,pH自然。碘液的制備碘片lg，碘化鉀2g，蒸餾水300ml。實施例六新疆姜氏菌(//a/2ge//a,//力'a"ge/^2、)CGMCC.No2997的應用新疆姜氏放線菌(Jiangellaxinjiangensis)CGMCC.No2997生產(chǎn)制備淀粉酶的步驟如下1、將種子液以2.5%的接種量，接種于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，180r/min,37。C培養(yǎng)32h，lOOOOr/min離心10min,去除菌體，以65%的飽和度向上清液中加入碌^酸銨，待石克酸銨充分溶解后于4。C下鹽析2h,然后再以12000r/min離心20min,用25mM的Tris-HCl將沉淀溶解，在含有5mMCa2,25mM的Tris-HCl溶液中4。C下透析8h,中間換一次透析液，結束后以10000r/min離心lOmin,除去雜質，所得上清液即為粗酶液。2、淀粉酶活測定。(1)淀粉酶活測定方法將10ul酶液加入到190ul的1%可溶性淀粉Tris-HCl緩沖液(50mM，pH8.0)中，在3(TC水浴中反應15min,用DNS測定還原糖量。(2)酶活力單位定義在30。C、pH8.0的條件下每分鐘水解淀粉產(chǎn)生lug葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。實施例七新疆姜氏菌(//a/^e//an'/7力'a/^e/7《/s)CGMCC.No2997的應用將菌株分別接種于含1%羧曱基纖維素鈉的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，待菌生長良好時，在菌落周圍滴加剛果紅染液數(shù)分鐘后，用1%的鹽水沖去多余的剛果紅^r測透明圈。如產(chǎn)生纖維素酶，則菌落周圍形成透明圈。菌XJEEM11102T產(chǎn)生透明圈表明有水解纖維素的能力。實施例八新疆姜氏菌(/2'^^e/7aj/X/7a/^e刀s/i1)CGMCC.No2997的應用新疆姜氏放線菌(//Mge/"x2X/7^^/^/s)CGMCC.No2997生產(chǎn)制備纖維素酶的步驟如下1、將新疆姜氏放線菌(/h/^e7"uX/7a/^e/^/s)CGMCC.No2997種子液按2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，180r/rain，37°C,培養(yǎng)24h;2、將培養(yǎng)好的發(fā)酵液10000r/rain,離心10min，取上清液，加入65%硫酸銨，靜置2h后，10000r/min離心25min,用適量25mM,pH為7.0的Tris-HCL緩沖液溶解沉淀，然后4。C透析12h，再經(jīng)過DEAE-sepharoseFlatFlow和SephacrylS-200方法得到纖維素酶。3、纖維素酶活測定。(l)纖維素酶活測定方法纖維素酶活性采用CMC為底物測定。(2)酶活力單位定義在3(TC、pH7.0的條件下每分鐘水解纖維素產(chǎn)生lug葡萄糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位(U)。實施例九新疆姜氏菌(,//7力'a/7^3/^/s)CGMCC.No2997的應用將菌抹分別接種于含1%的Tween40、60、80的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，待菌生長良好時，觀察是否有暈圈產(chǎn)生，實驗結果表明菌XJEEM11102T能夠水解Tween40、60、80,產(chǎn)生酯酶。實施例十新疆姜氏菌(//ai7ge//aj/o力's/^e"s/s)CGMCC.No2997的應用將菌抹分別接種于終濃度為2ml/LX-gal的ISP2培養(yǎng)基平板上，待菌生長良好，培養(yǎng)一至兩周，每天觀察。在生長菌苔的周圍有藍色者為陽性；沒有藍色者為陰性。菌XJEEM11102T產(chǎn)生藍色圈表明有半乳糖苷酶產(chǎn)生。權利要求1、一種新疆姜氏菌(Jiangellaxinjiangensis)CGMCC.No2997。2、如權利要求1所述的新疆姜氏菌(x/zu'/a/^e/^/s)CGMCC.No2997,其特征在于，所述的菌適合生長NaCl濃度、pH和溫度分別為0-3%、7.0和37°C;氧化酶和過氧化氫酶陽性；不產(chǎn)生黑色素和硫化氬；曱基紅和VP測試都是陰性；牛奶凝固和胨化實驗陽性；明膠液化陽性，能夠夠降解淀^^分、纖維素、Tweens40，60,80，但不能利用糊精、酪素、幾丁質、Tween20;脲酶陰性，硝酸鹽還原陽性，其DNA基因的G+C含量是71.5mol%。全文摘要本發(fā)明公開了一種新疆姜氏菌(Jiangellaxinjiangensis)CGMCC.No2997。通過從新疆鹽湖土樣中取樣，分離、篩選、生理生化鑒定，確定該菌種NaCl生長耐受范圍0-5％(w/v)，最適生長NaCl濃度、pH和溫度分別為0-3％、7.0和37℃。氧化酶和過氧化氫酶陽性，不產(chǎn)生黑色素和硫化氫。本發(fā)明的新疆姜氏菌(Jiangellaxinjiangensis)CGMCC.No2997有效地產(chǎn)生可溶性色素，硝酸鹽還原陽性，能夠水解淀粉、纖維素，廣泛應用于淀粉酶、纖維素酶、酯酶、半乳糖甙酶等工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領域。文檔編號C12N1/20GK101624577SQ200910113350公開日2010年1月13日申請日期2009年6月4日優(yōu)先權日2009年6月4日發(fā)明者史應武,愷婁,敏楚,蕓王申請人:新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所