專利名稱：：對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子及其克隆方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種新的對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子及其克隆方法，以及含有上述啟動子的表達載體，可用于在宿主細胞中表達外源基因，屬于基因工程領域。
背景技術：
：在基因工程領域中，目標基因的重組表達不論在理論研究還是在實際應用上都具有重要的意義。要使目標基因在宿主細胞中表達，就要將它克隆到帶有基因表達所需要的各種元件的基因工程載體中，這種載體就稱為表達載體。對不同的表達系統(tǒng)，需要采用不同的表達載體。大腸桿菌是目前應用最廣泛的原核表達系統(tǒng)，能夠方便且高效地表達、純化重組蛋白，但是當目標基因是真核基因時，原核系統(tǒng)就表現(xiàn)出許多缺陷如沒有真核細胞翻譯后加工的功能，表達產(chǎn)生的蛋白質，不能進行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對和正確的空間構像，因而產(chǎn)生的蛋白質常缺乏良好的生物學活性；而且重組蛋白常常以包涵體形式存在，復性困難。這種情況下就需要使用真核表達系統(tǒng)來表達目標基因U、樓士林，楊盛昌，龍敏南，章軍，基因工程，北京科學出版社，2002年，第一版)。常用的真核表達系統(tǒng)有酵母、昆蟲、哺乳類細胞以及植物等表達系統(tǒng)。真核表達載體需要具備一些基本元件，包括在真核宿主細胞中表達重組基因所需要的元件真核啟動子、轉錄終止信號、poly-A加尾信號、mRNA剪接信號、篩選標志基因以及供外源基因插入的多克隆位點等。此外，還需要在大腸桿菌中起作用的復制起始序列、篩選標志等，以便能在大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目的重組DNA克隆(1、樓士林，楊盛昌，龍敏南，章軍，基因工程，北京科學出版社，2002年，第一版；2、薩姆布魯克，拉塞爾著，黃培堂譯，分子克隆實驗指南，北京科學出版社，2002年，第三版)。真核啟動子作為在真核細胞中啟動基因轉錄的必需元件，是真核表達載體中一個關鍵的組成部分，它決定了目標基因的表達效果。啟動子通常具有一定的種屬或者組織特異性，其活性還有強弱之分。目前已經(jīng)有許多不同性質的啟動子被成功地應用在基因工程領域中，它們通常來源于病毒、酵母、藻類、植物、動物的基因組。其中病毒是一類侵染性極強的微小寄生生物，它在侵入細胞之后需要利用宿主的細胞機器來表達自身的基因(3、AlanJ.Cann.PrinciplesofMolecularVirology.4thedition)。來源于病毒的啟動子，特別是來源于DNA病毒的啟動子以其強活性在動物細胞表達系統(tǒng)中占有至關重要的位置。DNA病毒的基因根據(jù)其表達的時間可劃分為極早期基因、早期基因和晚期基因。病毒入侵宿主的最初階段，在無新病毒蛋白合成的情況下，一些病毒基因的啟動子可以被宿主細胞中的轉錄調節(jié)因子識別，并利用宿主細胞RNA多聚酶II進行轉錄，這些基因稱為病毒極早期基因(4、Buisson,M.,Manet,E.，Trescol-Biemont,M.C.，Gruffat,H.,Durand,B.,andSergeant,A.(1989).TheEpstein-Barrvirus(EBV)earlyproteinEB2isaposttranscriptionalactivatorexpressedunderthecontrolofEBVtranscriptionfactorsEB1andR.>/Wra/63(12)，5276-5284)。而病毒早期基因和晚期基因的轉錄則需要利用病毒極早期基因的表達產(chǎn)物。病毒極早期基因通常編碼了控制病毒增殖的重要調控因子，不僅負責調節(jié)病毒后續(xù)的基因表達(包括早期基因和晚期基因)，而且能夠通過轉錄調控或者其他方式改變宿主細胞的生理和免疫狀態(tài)，使之有利于病毒生命周期的進行(5、Holley-Guthrie,E.A.，Quinlivan，E.B.，Mar,E.C.,andKenney,S.(1990).TheEpstein-Barrvirus(EBV)BMRF1promoterforearlyantigen(EA-D)isregplatedbytheEBVtransactivators，BRLF1andBZLFl，inacell-specificmanner.JWra/64(8)，3753-3759;6、Kenney，S.,Holley-Guthrie,E.，Mar,E.C.,andSmith,M.(1989).TheEpstein-BarrvirusBMLF1promotercontainsanenhancerelementthatisresponsivetotheBZLFlandBRLF1transactivators./Wro/63(9)，3878-3883)。由于病毒極早期基因的轉錄完全依賴宿主細胞來完成，因此通常情況下這類基因的啟動子是能夠作為表達載體的元件在宿主細胞中啟動下游基因表達的。例如來源于巨細胞病毒CMV的極早期啟動子以及來源于猴空泡病毒SV40的早期啟動子，是目前商業(yè)化的哺乳動物表達載體中最常用的強啟動子，例如Clontech公司以及Sigma公司的pCMV系列載體，Invitrogen公司的pcDNA系列載體；而來源于苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)極早期啟動子以及黃杉毒蛾核型多角體病毒(OpNPV)極早期啟動子，是昆蟲表達載體中常用的啟動子，例如Novagen公司pIEx系列載體，以及Invitrogen公司的pIZ/V5-His載體。由此可見，DNA病毒的極早期基因是強啟動子的良好來源。對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)是危害對蝦養(yǎng)殖業(yè)的最主要的病原體，為了能夠控制病害的發(fā)生，近年來人們針對對蝦白斑綜合癥病毒展開了逐步深入的研究。2001年，本申請人在國際上率先對對蟲下白斑綜合癥病毒全基因組進行了測定(GenBankno.AF332093)，結果表明，對蟲下白斑綜合癥病毒的基因組為環(huán)狀雙鏈DNA，大小為305kb，預測編碼約532個ORF(11、Yang,F.,He,J.,Lin,X.，Li,Q.，Pan,D.,Zhang,X.,andXu,X.(2001).Completegenomesequenceoftheshrimpwhitespotbacilliformvirus./Wra/75(23),1181卜l1820)。2005年，臺灣大學的研究者發(fā)現(xiàn)了1個對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因iel(ORF126，wsv069)，它的啟動子在昆蟲細胞Sf9中具有較強的活性(12、Liu,W.J.,Chang,Y.S.,Wang,C.H.,Kou，G.H.，andLo，C.F.(2005》MicroarrayandRT-PCRscreeningforwhitespotsyndromevirusimmediate-earlygenesincycloheximide-treatedshrimp.Pra/ogy334(2)，327-341)。這表明來源于對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因的啟動子在基因工程領域中有良好的應用前景，一方面可以作為元件對已有的表達載體(如昆蟲細胞表達載體)進行改造，用于在已有表達系統(tǒng)(如昆蟲表達系統(tǒng))中表達蛋白質；另一方面，由于它來源于對蟲下白斑綜合癥病毒，它還可以用于構建能在對蝦或其他對蝦白斑綜合癥病毒宿主(如克氏原螯蝦)的細胞中表達目標基因的表達載體。由于目前還沒有適用于包括對蝦、克氏原螯蝦在內(nèi)的水生甲殼類的表達載體和表達系統(tǒng)，因此這對相關動物的研究將有開創(chuàng)性的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一目的是提供一種對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子。本發(fā)明的第二目的是提供一種對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的克隆方法。本發(fā)明的第三目的是提供一種含有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的表達載體。本發(fā)明的第四目的是提供一種含有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子表達載體的重組的宿主細胞。本發(fā)明所述對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子，是具有下述任一特征的DNA分子1)由SEQIDNO.1堿基對1-625定義的DNA分子；2)與SEQIDNO.1堿基對1-625定義的序列具有>70%同源性，且能夠控制下游基因轉錄的DNA分子；3)是SEQIDNO.1的片段、遺傳變體或缺失體，且能夠控制下游基因轉錄的DNA分子。所述SEQIDNO.1為tccsg3tcttCtt3CCC33Cgctt3cstgttgtt3t3acacccttaggtcctccccsttt60sgtgccgggggtggstttsg3CCCCt333Cagggtstggccaggsgtgascccgtagcca120gstctggsccccactctgttggsg33Ctggcgttcgacggca33tttctggaagtggggg180tgsgggggg3csscttgtat3tssgcgagccggggcsggc3gtctcsigc3240gsggc3csgcC3sgc3tac3agctccagttccaigctccsgctctsgcsgccsscccgagc300ttatccaacgCtCtt3Ct3C七3Ct3Ct3Ctactsctagtgcagtgcsgtg3603Ct3tt3CC3Ct3Ct3CttCtactactacgtcsccsgtgcagtgtagtgc420aactgttgttttctggattt3cttcagtctccgctcc3334803ttattgttgttgttttttttgsttaacgtaacgttaaatattatgggct5403tttttt3t3t333a^3C3C3tC3Cttt3ttagtgtgccgggcgttgaatt3atcgtg七3600tttgttgttgtttcttCC3t625本發(fā)明所述對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的克隆方法，包括以下步驟:以對蝦白斑綜合癥病毒的基因組DNA為模板，應用一對引物SEQIDN0.2和SEQIDN0.3,通過聚合酶鏈式反應進行擴增；反應產(chǎn)物與pMDlST-vector載體鏈接，轉化大腸桿菌；以裂解菌體為模板，利用一對引物SEQIDN0.2和SEQIDN0.3，通過聚合酶鏈式反應篩選已插入目標DNA片段的大腸桿菌克隆；并通過DNA測序確證其中插入DNA片段包含與SEQIDNO.1堿基對1-625完全一致的DNA序列，獲得帶有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子序列SEQIDNO.1的大腸桿菌質粒；所述引物SEQIDN0.2為5'cgggatcctccagatcttcttacccaacg3、所述引物SEQIDN0.3為5，ggaattctgcctatggaagaaacaacaa3、本發(fā)明所述含有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的表達載體包含有本發(fā)明所述的對蟲下白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子，以及由該啟動子控制的目標蛋白基因；此外還包含下述表達載體必需元件除對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子之外的第二個啟動子，由第二個啟動子控制的抗生素抗性基因，轉錄起始位點，轉錄終止位點，多克隆位點，polyA加尾信號。本發(fā)明所述含有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子表達載體的重組的宿主細胞是通過在宿主細胞中轉染含有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的表達載體獲得的，重組的宿主細胞中包含本發(fā)明所述的含有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的表達載體，并能夠表達由對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子控制的目標蛋白基因。本發(fā)明所述宿主細胞包括(且不僅限于)昆蟲細胞和WSSV天然宿主的細胞。本發(fā)明還提供了一對引物SEQIDN0.2和SEQIDN0.3，用于克隆所述對蟲下白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子。本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點和技術效果。本發(fā)明在全面篩選對蟲下白斑綜合癥病毒極早期基因的基礎上，得到了1個新的對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子。DNA病毒極早期基因的啟動子通常具有很強的活性，被廣泛的應用于基因工程表達載體的構建。實驗結果表明，對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子可以在昆蟲細胞中高效啟動下游基因的表達，可以用于改進現(xiàn)有的昆蟲表達載體。不僅如此,由于對奸白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子來源于WSSV，因此該啟動子可以用于構建適用于WSSV天然宿主細胞(包括對蝦細胞、克氏原螯蝦細胞)的表達載體，來改變目前缺乏適用于水生甲殼動物的載體的現(xiàn)狀。圖1為RT-PCR驗證WSV083是否是對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因。通過RT-PCR的方法，檢測在加入了100ug/ml放線菌酮抑制細胞蛋白合成的情況下，感染W(wǎng)SSV的細胞中候選極早期基因WSV083，以及兩個非極早期基因DNA聚合酶基因和結構蛋白基因VP28的轉錄情況。在圖1中，"WSSV"表示細胞中是否感染了WSSV，"+"為感染，"-"為未感染；"CHX":表示細胞中是否加入了放線菌酮，"+"為加100ug/ml放線菌酮，"-"為未加放線菌酮；"WSV083":表示RT-PCR檢測WSSV基因WSV083的轉錄情況；"DNApolymerase":表示RT-PCR檢測WSSV的DNA聚合酶基因的轉錄情況；"VP28":表示RT-PCR檢測WSSV結構蛋白基因VP28的轉錄情況；"Actin":表示RT-PCR檢測克氏原螯蝦細胞的一個"看家基因"一肌動蛋白基因Actin的轉錄情況。圖2為對蟲下白斑綜合征病毒極早期基因啟動子活性分析。將包含對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的表達載體pIZA-P083-EGFP轉染到昆蟲細胞High-five(Invitrogen)中，通過顯微鏡觀察(A)以及Western雜交(B)的方法，檢測下游報告基因EGFP的表達情況；"陽性對照"指細胞中轉染的是pIZ-EGFP質粒(14、TianLuo,FangLi,KaiyuLei,X皿Xu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecixlarImmunology44(2007)1516-1523)，"陰性對照"指細胞中轉染的是pIZAIE/EGFP質粒(14、TianLuo,FangLi，KaiyuLei，XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MoleqxlarImmunology44(2007)1516~1523),"WSV083"指細胞中轉染的是pIZA-P083-EGFP質粒；"GFP":表示A圖綠色熒光和B圖黑色條帶是顯示報告基因EGFP的表達情況；"DAPI":表示A圖藍色熒光是細胞核的染色；"Actin":表示圖中雜交信號顯示的是克氏原螯蝦細胞看家基因一肌動蛋白基因Actin的表達情況。具體實施例方式以下實施例將結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。實施例l對蟲下白斑綜合癥病毒極早期樣品的制備抽取經(jīng)檢測不帶病毒的克氏原鰲蝦的血淋巴:先用2ml的一次性注射器吸取抗凝劑(0.8%檸檬酸鈉，0.05%檸檬酸，1.87%葡萄糖，0.42%氯化鈉，pH5.0)，在克氏原螯蝦心臟采血，所采血淋巴的體積不能超過抗凝劑體積。取血后立刻顛倒混勻，拔掉針頭后，將針管內(nèi)的血細胞和抗凝劑的混合液注入無菌離心管中。采集適量血淋巴之后，室溫500Xg離心3min。去掉上清，用加入15%FBS，100U/mL青霉素，100ug/mL鏈霉素的L15培養(yǎng)基(pH7.2)懸勻細胞，將懸勻的細胞接種到一次性的細胞培養(yǎng)板上，27X:細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。lh后，更換培養(yǎng)基，在新的培養(yǎng)基內(nèi)加入100嗎/ml放線菌酮(CHX)，抑制細胞中新蛋白質的合成。放線菌酮處理2h后，在極早期基因篩選組中加入5X1(^的對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)粒子進行感染，陰性對照組不加病毒，病毒感染8h后，收集極早期基因篩選組和陰性對照組的細胞，用TRIREAGENT(MolecularResearchCenter公司)提取總RNA，這些RNA將用于后續(xù)的反轉錄、標記和芯片雜交工作。因為放線菌酮具有抑制蛋白合成的作用，所以在放線菌酮存在的情況對蝦白斑綜合癥病毒只能利用宿主原有的轉錄調節(jié)因子和RNA聚合酶進行自身基因的轉錄，因此極早期基因篩選組中只包含了病毒極早期基因和宿主細胞的mRNA，而陰性樣品中只包含了宿主細胞的mRNA。實施例2極早期基因的芯片篩選芯片的制備根據(jù)對蝦白斑綜合癥病毒中國株基因組的序列(GenBankno.AF332093)，委托博奧生物有限公司(CapitalBio公司)應用計算機分析設計引物，以lkb左右作為一個基本單位，利用PCR的方法擴增基因片段，得到了制備對蝦白斑綜合癥病毒全基因組芯片所需的探針。利用基因芯片點樣機將探針點到玻片上，制備得到了對蝦白斑綜合癥病毒全基因組芯片，在芯片上還包括了陽性和陰性對照基因(詳見參考文獻15、FangLi，MingyuanLi,WeiKe，YongchangJi，XiaofangBian，XiuminYan.Identificationoftheimmediate-earlygenesofwhitespotsyndromevirus.Virology.2009Mar1(385(l):267-274)。芯片雜交將極早期基因篩選組RNA樣品以及陰性對照組RNA樣品分別進行反轉錄，并用不同顏色的熒光染料Cy3和Cy5進行熒光標記，采用雙通道芯片雜交方法進行分析，并每對樣品進行一次熒光交換，以校正不同顏色熒光之間的強度差異。雜交后采用LuxScan3.0圖像分析軟件對芯片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數(shù)字信號。數(shù)據(jù)處理中，在極早期基因篩選組樣品以及陰性對照組樣品中熒光信號值都在400以下的認為是無表達或者低表達的點，為無效點，不予采用。采用有效的信號值，采用看家基因對信號進行片內(nèi)歸一化。計算極早期基因篩選組樣品與陰性對照組樣品熒光強度的比值，該比值表示該點所對應的探針在兩個樣品中的mRNA量的差異(詳見參考文獻15、FangLi,MingyuanLi，WeiKe,YongchangJi,XiaofangBian,XiuminYan.Identificationoftheimmediate-earlygenesofwhitespotsyndromevirus.Virology.2009Marl;385(l):267-274)。通過一次芯片分析發(fā)現(xiàn)seq041、seq042、seq043幾個探針的"極早期樣品/陰性樣品"的熒光信號強度比值很大，都在50倍以上，目.在陰性對照組中的信號值較低(參見表l)，說明這3個探針中所包含的基因在極早期樣品中有特異的表達。這3個探針在對蝦白斑綜合癥病毒中國株基因組中的位置以及長度參見表2。經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)，3個探針中都包含wsv083基因的閱讀框，該閱讀框的位置在對蟲下白斑綜合癥病毒中國株基因組中堿基對40718-38976。因此wsv083基因很可能是對蟲下白斑綜合癥病毒極早期基因。表1用WSSV基因組芯片進行WSSV極早期基因篩選的結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>wssv極早期基因篩選組樣品(標注為"極早")以及陰性對照組(標注為"陰性")分別標記不同熒光Cy3或者Cy5，與同一張芯片雜交。然后將樣品的熒光標記交換，再進行一次雜交實驗。數(shù)據(jù)線性均一化之后計算兩種樣品在某個探針上的熒光比值(標注為"極早/陰性")。表2.目標探針在對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)基因組上的位置和開放閱讀框<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例3RT-PCR驗證WSV083是否是對奸白斑綜合癥病毒極早期基因為了進一步檢驗wsv083是否是對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因，制備4組樣品1、放線菌酮處理的陰性樣品克氏原螯蝦細胞用放線菌酮處理，未感染W(wǎng)SSV;2、放線菌酮處理的感染樣品克氏原螯蝦細胞用放線菌酮處理，之后在放線菌酮存在的條件下加入WSSV感染的克氏原螯蝦細胞；3、正常細胞樣品未加放線菌酮且未感染W(wǎng)SSV的克氏原螯蝦細胞；4、正常感染細胞樣品未加放線菌酮的條件下加入WSSV感染的克氏原螯蝦細胞。其中放線菌酮處理濃度為100嗎/ml，病毒感染量為1X1(^拷貝/L(細胞培養(yǎng)的標準6孔板)。細胞準備如實施例l所述。在感染8h后，將RNA分離出來，以oligodT(w為引物，用逆轉錄酶SuperscriptIII(invitrogen公司)在42。C反轉錄lh。再應用wsv083的特異性引物，wsv83F5'ccgtcctcccagattatg3'與wsv83R5，gtctcccagggacagatga3'。通過聚合酶鏈式反應對該基因進行擴增，同時還擴增了克氏原螯蝦看家基因-肌動蛋白基因，對蝦白斑綜合癥病毒非極早期基因vp28基因和DNA聚合酶基因作為對照?？耸显r看家基因-肌動蛋白基因引物為CrayActin-F5'gacatggagaagatctgg3'，CrayActin-R5'gggaagctcgtaggactt3，；對蟲下白斑綜合癥病毒vp28基因的引物為vp28F5'ctgctgtgattgctgtattt3'，vp28R5'cagtgccagagtaggtgac3';對蟲下白斑綜合癥病毒DNA聚合酶基因的引物為dnapolF5,tgggaagaaagatgcgagag3,，dnapolR5'ccctccgaacaacatctcag3'。結果如圖1所示，wsv083的mRNA能在放線菌酮處理的感染樣品中以及正常感染細胞樣品中被檢測到，而對蝦白斑綜合癥病毒非極早期基因結構蛋白基因vp28和DNA聚合酶基因只能在正常感染細胞樣品中才能檢測到表達。說明wsv083確實是對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因。實施例4對奸白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的克隆首先根據(jù)對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)中國株的基因組序列(GenBankno.AF332093)(3、AlanJ.Cann.PrinciplesofMolecularVirology.4thedition),設計一對引物，用PCR的方法擴增WSV083閱讀框上游625bp個堿基對的DNA片段，預測該片段包含了WSV083基因的啟動子，即權利要求書所述的"對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子"。引物序列如SEQIDNO.2與SEQIDNO.3所示。(1)PCR擴增使用50^1的PrimeSTAR(TAKARA公司)的擴增體系5xbuffer(Mg2+plus)10pldNTP(各2.5mM)4^1引物1(xl/eachWSSV基因組DNA10ngprimeSTAR0.5(al加水至PCR程序:循環(huán)29次(2)將PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，并將大小約為625bp左右的電泳條帶切下，用博大泰克公司的膠回收試劑盒進行回收。(3)用Taq酶(TAKARA公司)為回收的DNA片段進行末端加堿基A的反應。(4)用NEB公司的T4鏈接酶將處理后的載體與PMD18T-vector載體鏈接片段8.2^1T41igase(NEB)0.5^1T-vector0.3|il10xbufferlul于16。C中放置16h以上。(5)將鏈接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌中，并測序驗證目標片段是否被成功克隆。通過上述實驗獲得了含有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的pMD18T質粒。實施例5對蟲下白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子活性檢測為了檢測所得對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子是否具有活性，在下面實驗中將該啟動子克隆到缺乏真核啟動子的昆蟲表達載體pIZAIE/EGFP(參見文獻14、TianLuo,FangLi,KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.Molec(xlarImmunology44(2007)1516-1523.)中報告基因EGFP的上游，檢驗對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子是否能啟動下游報告基因EGFP的表達。(1)提取含有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的PMD18T-vector質粒根據(jù)設計的引物5'端加上的酶切位點，用EcoRI+BamHI對含有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的PMD18T-vector質粒進行雙酶切。用博大泰克的膠回收試劑盒進行切膠回收，回收對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的片段，625bp。(2)將pIZAIE/EGFP載體也進行EcoRI+BamHI雙酶切。(3)用NEB公司的T4鏈接酶，將雙酶切好的載體和啟動子片段進行連接，得到含對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的表達載體pIZA-P083-EGFP。(4)連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌37'C培養(yǎng)過夜。(5)應用QIAGENplasmidMidikit(QIAGEN公司)大量提取pIZA-P083-EGFP質粒。通過EcoRI+BamHI雙酶切再次驗證其中插入了目標片段。(6)轉染細胞在12孔板的每一孔板中加入蓋玻片，之后接種high-five(Invitrogen公司)細胞，培養(yǎng)基為Hyclone公司的SFX-insect，27。C培養(yǎng)過夜。第二天轉染之前，更換新鮮培養(yǎng)基。轉染的質粒有pIZA-P083-EGFP，陽性對照質粒pIZ-EGFP(14、TianLuo，F(xiàn)angLi,KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecularImmunology44(2007)1516~1523),陰性對照質粒pIZAIE/EGFP(14、TianLuo,FangLi，KaiyuLei，XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecjAlarImmunology44(2007)1516—1523)。轉染步驟質粒DNA(500ng/孔)和50111Opti-Mem(Invkrogen公司)混勻，室溫下靜置5min;轉染試齊!jCellfectin(Invitrogen公司)2til/孔，和50plOpti-Mem混勻，室溫下靜置5min。將二者混勻，室溫下靜置25min。加入到細胞內(nèi)，混勻，細胞在27'C培養(yǎng)48h。而后進行顯微鏡觀察及Westem雜交實驗，檢驗報告基因EGFP是否表達。(8)顯微鏡樣品制備和觀察將蓋玻片取出，用PBS洗一次，加入500nl4%多聚甲醛，室溫固定細胞10min，用500pl0.5%Trizon-X-100處理lmin，用500plPBS洗滌1次，加入500plDAPI染色液進行核染色，室溫靜置lmin，用500nlPBS洗滌兩次，用封片劑封片，干燥20min以上，于熒光顯微鏡下觀察細胞中是否有綠色熒光。結果如圖2A所示，轉染pIZA-P083-EGFP質粒的細胞中有綠色熒光。13(9)Western驗證表達結果1)樣品的處理細胞用0.5mLPBS洗一次，再加入0.5mLPBS，刮下細胞于EP管中，4'C，2000rpm，離心3min，在沉淀加入50plCoIPLysisbuffer(1%NP40'500mMNaCl，50mMH印es-KOHpH7.8，5mMEDTA，3mMDTT，0.5mMPMSF)冰浴30min，4'C，13000rpm，離心8min，取上清加入等體積2xSDSloadingbuffer,沸煮1Omin后作為電泳的樣品。2)SDS-PAGE電泳用12e/。的SDS-PAGE凝膠進行在150V電壓下進行蛋白電泳。3)轉膜電泳后凝膠在100V進行電轉移lh，將凝膠上的蛋白樣品轉移到硝酸纖維素膜上。4)雜交反應用20mL封閉液(TBST+5。/。脫脂奶粉)室溫封閉lh以上，硝酸纖維素膜封閉后加入Goatanti-GFP抗體(sigma公司)室溫溫育2h;再用TBST洗膜2次；加入二抗Dongkey-anti-goat-HRP抗體(sigma公司)，常溫下溫育lh;用TBST洗膜3次；再用水洗膜2次5)顯色反應用ECL顯色液(Pierce公司)顯色液對膜上的信號進行顯色反應，之后用X-光膠片曝光。結果如圖2B所示。實驗結果說明對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子可以在昆蟲細胞中啟動下游報告基因EGFP表達，具有啟動子活性。上述實施例所采用的實驗技術與方法主要根據(jù)上述參考文獻[2]、[ll]、[14]和以下參考文獻13、章靜波等《細胞生物學實驗技術》，化學工業(yè)出版社；15、FangLi,MingyuanLi,WeiKe,YongchangJi，XiaofangBian，XiuminYan.Identificationoftheimmediate-earlygenesofwhitespotsyndromevirus.Virology.2009Marl;385(l):267-74.)。序列表SEQIDNO.1為tccagstcttCtt3CCC33Cgcttsc3tgttgttataacacccttaggtcCtCCCC3ttt60sgtgccgggggtggstttsg3cccct33aicsgggt3tggccccgtagcca120gstctggacccc3ctctgttggagsactggcgttcgacggcaaatttctggsagtggggg180tgsggggggacaacttgtatat3agcgagccggggcsggccagssgcstcagtctcagca240gsggcscsgcagctccagttccsgctccsgctct3gcagccascccgsgc300ttatccascgCtctt3Ct3Cactactagtgcsgtgcsgtg3C33tsgtgg3603C七3tt3CC3Ct3Ct3CttCtsctsctscgtcaccagtgcsgtgtsgtgc420aactgttgttttctggatttacttcagtctccgctccaaaCCC3tC3333■3tt3ttgttgttgttttttttgattascgtsttstgggct5403tttttt3t33tC3Cttt3ttsgtgtgccgggcgttgsstt33tcgtgta600tttgttgttgtttcttccstaggca625SEQIDN0.2為5，cgggatcctccagatcttcttacccaacg3'SEQIDN0.3為5，ggaattctgcctatggaagaaacaacaa31權利要求1.對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子，其特征在于所述對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子是具有下述任一特征的DNA分子1)由SEQIDNO.1堿基對1-625定義的DNA分子；2)與SEQIDNO.1堿基對1-625定義的序列具有>70％同源性，且能夠控制下游基因轉錄的DNA分子；3)是SEQIDNO.1的片段、遺傳變體或缺失體，且能夠控制下游基因轉錄的DNA分子。所述SEQIDNO.1為tccagatcttcttacccaacgcttacatgttgttataacacccttaggtcctccccattt60agtgccgggggtggatttagacccctaaacagggtatggccaggagtgaacccgtagcca120gatctggaccccactctgttggagaactggcgttcgacggcaaatttctggaagtggggg180tgaggggggacaacttgtatataagcgagccggggcaggccagaagcatcagtctcagca240gaggcacagccaagcatacaagctccagttccagctccagctctagcagccaacccgagc300ttatccaacgctcttactactactactactactactagtgcagtgcagtgacaatagtgg360actattaccactactacttctactactacgtcaccagtgcagtgtagtgcccaacagtaa420aactgttgttttctggatttacttcagtctccgctccaaacccatcaaaagtaagtacca480ataatatactattattgttgttgttttttttgattaacgtaacgttaaatattatgggct540attttttatataaaaaacacatcactttattagtgtgccgggcgttgaattaatcgtgta600tttgttgttgtttcttccataggca625。2.如權利要求1所述的對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的克隆方法，其特征在于其具體步驟為以對蝦白斑綜合癥病毒的基因組DNA為模板，應用一對引物SEQIDN0.2和SEQIDN0.3，通過聚合酶鏈式反應進行擴增；反應產(chǎn)物與pMD18T-vector載體鏈接，轉化大腸桿菌；以裂解菌體為模板，利用一對引物SEQIDN0.2和SEQIDN0.3，通過聚合酶鏈式反應篩選已插入目標DNA片段的大腸桿菌克??；并通過DNA測序確證其中插入DNA片段包含與SEQIDNO.1堿基對1-625完全一致的DNA序列，獲得帶有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子序列SEQIDNO.1的大腸桿菌質粒；所述引物SEQIDN0.2為5，cgggatcctccagatcttcttacccaacg3，；所述引物SEQIDNO.3為5,ggaattctgcctatggaagaaacaacaa3'。3.含有如權利要求l所述對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的表達載體，其特征在于包含有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子，以及由該啟動子控制的目標蛋白基因；此外還包含下述表達載體必需元件除對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子之外的第二個啟動子，由第二個啟動子控制的抗生素抗性基因，轉錄起始位點，轉錄終止位點，多克隆位點，polyA加尾信號。4.如權利要求3所述表達載體的重組的宿主細胞，其特征在于是通過在宿主細胞中轉染含有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的表達載體獲得的，重組的宿主細胞中包含本發(fā)明所述的含有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的表達載體，并能夠表達由對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子控制的目標蛋白基因。5.如權利要求4所述表達載體的重組的宿主細胞，其特征在于所述宿主細胞包括且不僅限于昆蟲細胞或WSSV天然宿主的細胞。全文摘要對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子及其克隆方法與應用，涉及一種新的對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子及其克隆方法，以及含有上述啟動子的表達載體，可用于在宿主細胞中表達外源基因。提供一種對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子及其克隆方法，以及含有對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子的表達載體和重組的宿主細胞。在全面篩選對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因的基礎上，得對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子，該啟動子可在昆蟲細胞中高效啟動下游基因的表達，可用于改進現(xiàn)有的昆蟲表達載體。由于對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因啟動子來源于WSSV，因此該啟動子可用于構建適用于WSSV天然宿主細胞的表達載體。文檔編號C12N15/63GK101544977SQ20091011164公開日2009年9月30日申請日期2009年5月4日優(yōu)先權日2009年5月4日發(fā)明者鈁李,李明圓,韡柯,鄢秀敏申請人:國家海洋局第三海洋研究所