專(zhuān)利名稱(chēng)：：天冬酰胺和蛋白質(zhì)增強(qiáng)的玉米植物和種子的制作方法天冬酰胺和蛋白質(zhì)增強(qiáng)的玉米植物和種子
背景技術(shù)：
：1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體而言涉及增加植物和種子中的天冬酰胺和蛋白質(zhì)。2.相關(guān)技術(shù)描述農(nóng)民和消費(fèi)者希望農(nóng)作物具有改良的農(nóng)學(xué)性狀，例如增加的產(chǎn)率、增加的種子蛋白質(zhì)產(chǎn)量和改良的營(yíng)養(yǎng)組成。需要的農(nóng)作物營(yíng)養(yǎng)成分包括纖維、抗氧化劑(例如維生素E)、硒、鐵、鎂、鋅、B族維生素、木酚素類(lèi)、酚酸類(lèi)、必需氨基酸和植物雌激素類(lèi)等。盡管在植物培育方面的大量努力已經(jīng)在這些希望的性狀方面取得了一些進(jìn)步，將特異性的非宿主DNA引入到植物基因組中的能力為產(chǎn)生具有這些性狀的植物提供了進(jìn)一步的機(jī)會(huì)。特別地，雖然常規(guī)玉米的產(chǎn)量逐年穩(wěn)步提高，但是玉米作物更有效地同化氮或增加種子蛋白質(zhì)含量的能力并沒(méi)有相應(yīng)地一是高。氮的可用性對(duì)于植物的產(chǎn)量、生物量、以及農(nóng)作物產(chǎn)率(包括種子蛋白質(zhì)的生產(chǎn))具有非常重要的正面影響。在植物中，無(wú)機(jī)氮是從土壤中同化，被還原為氨，并以氮轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的形式引入到有機(jī)氮中。天冬酰胺(Asn)是優(yōu)選的酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)分子，因?yàn)槠渚哂懈叩牡?碳比(2N:4C,相對(duì)于2N:5C),以及因?yàn)樗窍鄬?duì)惰性的。Asn和其它的氨基酸也可用作蛋白質(zhì)合成的構(gòu)件。在植物中，Asn是在一個(gè)由天冬酰胺合成酶(AsnS)催化的反應(yīng)中通過(guò)谷氨酰胺、天冬氨酸和ATP合成的。谷氨酸、AMP和焦磷酸5鹽作為副產(chǎn)物形成。已經(jīng)描述了兩種形式的AsnS:谷氨酰胺依賴(lài)型和氨依賴(lài)型。谷氨酰胺依賴(lài)型AsnS可以催化谷氨酰胺依賴(lài)型和氨依賴(lài)型的反應(yīng)，盡管谷氨酰胺是優(yōu)選的氮源。高濃度的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是大多數(shù)主要農(nóng)作物(包括大豆、玉米和小麥)的重要質(zhì)量性狀。例如，高蛋白質(zhì)的玉米、小麥和大豆的品種已經(jīng)通過(guò)傳統(tǒng)培育方法鑒定出來(lái)。但是，以這種方式形成的大多數(shù)高蛋白質(zhì)品系具有低產(chǎn)率或其它的農(nóng)學(xué)缺點(diǎn)。如果農(nóng)作物(特別是玉米)的蛋白質(zhì)含量能夠增加到現(xiàn)有水平之上，那么對(duì)人們的消費(fèi)和產(chǎn)物在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用來(lái)說(shuō)都是理想的。當(dāng)農(nóng)作物作為人們的食物和動(dòng)物的飼料時(shí)，這將會(huì)極大地提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了用于開(kāi)發(fā)農(nóng)作物和植物產(chǎn)品、以增加蛋白質(zhì)和氨基酸含量的方法和組合物。該方法和組合物增加了植物組織中(特別是種子中)游離氨基酸和蛋白質(zhì)的水平。更具體而言，本發(fā)明提供了包含異源DNA組合物的轉(zhuǎn)基因植物和種子，該異源DNA組合物表達(dá)與增加的天冬酰胺和增加的蛋白合成有關(guān)的基因產(chǎn)物。該產(chǎn)物的表達(dá)提高了食物玉米和飼料玉米來(lái)源以及來(lái)自轉(zhuǎn)基因玉米種子或其部分的加工產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在一方面，本發(fā)明提供了增加玉米植物中蛋白質(zhì)含量的方法。本發(fā)明還提供了包含編碼具有天冬酰胺合成酶活性的多肽的多核苷酸序列的DNA構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用編碼此處確定的天冬酰胺合成酶的異源DNA組合物轉(zhuǎn)化的玉米才直物細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，提供了玉米AsnS4(天冬酰胺合成酶同工酶4)多核普酸分子的異源表達(dá)，例如，導(dǎo)致相對(duì)于不表達(dá)異源玉米AsnS2多核普酸分子的相同品種的植物，在轉(zhuǎn)基因植物(包括種子)中具有增多的天冬酰胺和/或蛋白質(zhì)。在特定的實(shí)施方案中，提供了一種核酸序列及其使用方法，其中，6該序列選自(a)包含序列SEQIDNO:50的核酸序列；(b)與序列SEQIDNO:50至少大約90%相同的核酸序列，其中，該核酸序列編碼具有天冬酰胺合成酶活性的多肽；(c)編碼多肽序列SEQIDNO:51的核酸序列；(d)編碼與序列SEQIDNO:51至少大約90%相同的多肽序列的核酸序列，其中，該多肽具有天冬酰胺合成酶活性；和(e)在大約0,2xSSC和65。C的高嚴(yán)格性條件下與(a)-(d)的序列雜交的核酸序列，其中，該核酸序列編碼具有天冬酰胺合成酶活性的多肽。在特定的實(shí)施方案中，提供與序列SEQIDNO:50至少90%、93%、95%、96%、97%、98%或99%序列相同的核酸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供編碼與序列SEQIDNO:51至少90%、93%、95%、96%、97%、98%或99%序列相同的多肽序列的核酸。本發(fā)明還提供了包含SEQIDNO:51的分離的多肽序列，以及與SEQIDNO:51至少90%、93%、95%、96%、97%、98%或99%序列相同的序列。本發(fā)明還涉及由本發(fā)明提供的具有增加的蛋白質(zhì)和/或氨基酸含量的種子或由該種子的加工產(chǎn)物(例如粗粉(meal))制備的食物或動(dòng)物飼料。因此，本發(fā)明還包括包含天冬酰胺合成酶的玉米種子，該酶是通過(guò)包含編碼玉米天冬酰胺合成酶的DNA分子的異源DNA構(gòu)建體表達(dá)產(chǎn)生的。這樣的種子的一個(gè)實(shí)施方案是收獲的谷粒(grain),本發(fā)明還包括由這樣的谷粒制成的粗粉、面筋(gluten)和其它玉米產(chǎn)品。本發(fā)明包括包含SEQIDNOs:52-59中的一個(gè)或多個(gè)或其互補(bǔ)序列的分離的核酸引物序列。本發(fā)明包括在轉(zhuǎn)化的植物或其后代的基因組中檢測(cè)或確定編碼植物AsnS多肽或具有本發(fā)明AsnS活性的植物多肽的異源多核苷酸分子的方法，該異源多核苷酸分子包含選自SEQIDNOs:52-59的多核苷酸分子，其中，所述多核苷酸分子在DNA擴(kuò)增方法中作為DNA引物使用。圖1示出了pMON79706的質(zhì)粒圖。7圖2示出了pMON66229的質(zhì)粒圖。圖3示出了pMON66230的質(zhì)粒圖。圖4示出了pMON66231的質(zhì)粒圖。圖5示出了pMON66239的質(zhì)粒圖。圖6為pMON79706事件中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。誤差條代表95%置信區(qū)間，轉(zhuǎn)基因事件n-5，近交對(duì)照n-10。圖7為pMON92870事件中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。誤差條代表95%置信區(qū)間，轉(zhuǎn)基因事件n〉3個(gè)植物，近交對(duì)照n-8個(gè)植物。核酸和多肽序列的說(shuō)明SEQIDNO:1為編碼玉米(Zeama，)AsnSl的多核苷酸序列。SEQIDNO:2為玉米AsnSl多肽。SEQIDNO:3為編碼玉米AsnS2的多核苷酸序列SEQIDNO:4為玉米AsnS2多肽。SEQIDNO:5為編碼玉米AsnS3的多核苷酸序列。SEQIDNO:6為玉米AsnS3多肽。SEQIDNO:7為編碼大豆(wa;c)AsnS的多核苷酸序列。SEQIDNO:8為大豆AsnS多肽。SEQIDNO:9為編碼苛養(yǎng)木桿菌(《y/e〃a/aWAa^)AsnS的多核苷酸序列。SEQIDNO:10為編碼野油菜黃單胞菌(Z"W/20mo"wcampe^r^)AsnS的多核苦酸序列。SEQIDNO:11為編碼耐鹽芽孢桿菌(/m/od訓(xùn)/w)AsnS的多核苷酸序列。SEQIDNO:12為編碼水稻(Oj^^a"va)AsnS的多核苷酸序列。SEQIDNO:13為編碼G^W^n'ara/p/mran'aAsnS的多核苦酸序列。SEQIDNO:14為編碼GaW^n'aw/p/m腦'aAsnS的多核苷酸序列。8SEQIDNO:15為編碼GWAen'asw/p/mran'aAsnS的多核苷酸序列。SEQIDNO:16為編碼Ga/Aen'asw/p/mraWaAsnS的多核苷酸序列。SEQIDNO:17為編石馬酉良酒酵母(6Vcc/^rom少c^cerev/Wae)CGPG3913AsnS的多核苷酸序列。SEQIDNO:18為正向(f)AsnSPCR引物序列。SEQIDNO:19為正向(f)AsnSPCR引物序列。SEQIDNOs20-43為在通路克隆(Gatewaycloning)過(guò)程中使用的初級(jí)和次級(jí)正向(f)和反向(r)AsnSPCR引物序列。SEQIDNO:44為正向(f)AsnSPCR引物序列。SEQIDNO:45為正向(f)AsnSPCR引物序列。SEQIDNO:46為ZmAS有義引物。SEQIDNO:47為ZmAS反義引物。SEQIDNO:48為玉米AsnS3正向引物。SEQIDNO:49為玉米AsnS3反向引物。SEQIDNO:50為編碼玉米AsnS4的多核苷酸序列。SEQIDNO:51為玉米AsnS4多肽。SEQIDNO:52為正向PCR引物，Zm-AsnSl_forl。SEQIDNO:53為反向PCR引物，Zm-AsnSl——rev1。SEQIDNO:54為正向PCR引物，Zm-AsnS3—for2。SEQIDNO:55為反向PCR引物，Zm-AsnS3_一rev2。SEQIDNO:56為正向PCR引物，Zm-AsnS4—for3。SEQIDNO:57為反向PCR引物，Zm-AsnS4—一rev3。SEQIDNO:58為正向PCR引物，Zm-AsnS2—for4。SEQIDNO:59為反向PCR引物，Zm-AsnS2—rev4。具體實(shí)施例方式以下是對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述，用于幫助本領(lǐng)域才支術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。除非在本文中另外定義，應(yīng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)使用來(lái)理解這些術(shù)語(yǔ)。分子生物學(xué)的普通術(shù)語(yǔ)的定義還可以參考Rieger等人，1991;和Lewin，1994中的描述。使用37CFR§1.822中規(guī)定的DNA堿基的命名法。氨基酸殘基使用標(biāo)準(zhǔn)的單字母或三字母命名法。此處所描述的實(shí)施方案的改變和變化是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以實(shí)現(xiàn)的，而不會(huì)背離本發(fā)明的精神或范圍。本發(fā)明提供了一種通過(guò)向玉米植物細(xì)胞的基因組中引入在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中表達(dá)AsnS多肽的異源核苷酸來(lái)提高玉米植物中蛋白質(zhì)含量的方法。本發(fā)明提供了包含(包含是指"包括但不局限于")任選地與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽可操作地連接的編碼AsnS多肽的多核苷酸分子或其片段的DNA構(gòu)建體。編碼AsnS多肽的多核苷酸分子或其類(lèi)似物或等位基因，或編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽或標(biāo)記/報(bào)道基因的多核苷酸分子是"分離的"，因?yàn)樗鼈冎辽俨糠值厥窃隗w外進(jìn)行制備的，例如從其天然狀態(tài)、從細(xì)胞中分離出來(lái)的，純化的和擴(kuò)增的，例如，它們所結(jié)合的基因元件相對(duì)于那些通常與它們的天然狀態(tài)相結(jié)合的基因元件來(lái)說(shuō)是異源的。此處所使用的被引入宿主細(xì)胞的包含編碼AsnS的多核苷酸分子的異源DNA構(gòu)建體優(yōu)選與天然未轉(zhuǎn)化狀態(tài)的細(xì)胞中存在的任何多核苷酸分子不同，并且相對(duì)于在宿主細(xì)胞基因組中存在的其它DNA分子是分離的。此處所使用的在轉(zhuǎn)化的植物、植物組織或植物細(xì)胞中的天冬酰胺的"改變或增加的"水平是指比不包含本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的相應(yīng)植物、植物組織或植物細(xì)胞中的水平更高的水平。本發(fā)明的試劑也可以是重組的。此處所使用的術(shù)語(yǔ)重組是指任何來(lái)自或間接地產(chǎn)生于多核苷酸分子人工操作的試劑(例如DNA、肽等)。正如此處的優(yōu)選方面中所使用的，種子的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的提高，例如種子蛋白質(zhì)含量的提高，是由植物產(chǎn)生比沒(méi)有蛋白質(zhì)或營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量提高的種子具有更高蛋白質(zhì)或營(yíng)養(yǎng)成分產(chǎn)率的種子的能力而確定的。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的方面，相對(duì)于與該營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)植物具有相似遺傳背景10的植物檢測(cè)其營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的提高，只是本發(fā)明的植物表達(dá)或過(guò)表達(dá)在本文關(guān)于異源DNA構(gòu)建體部分描述的蛋白質(zhì)或其片段。多核苷酸分子本發(fā)明包括和提供在其基因組中包含轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因玉米植物和種子，該轉(zhuǎn)基因包含編碼玉米天冬酰胺合成酶(Zm.AsnS4)的異源DNA分子，該DNA分子包含例如SEQIDNO:50和與具有天冬酰胺合成酶活性的這些序列至少90%、95%或99%相同的序列。本發(fā)明的另一方面提供了一種通過(guò)向玉米細(xì)胞內(nèi)引入DNA構(gòu)建體來(lái)提高玉米植物中的蛋白質(zhì)的方法，該DNA構(gòu)建體提供了編碼天冬酰胺合成酶的異源多核苷酸分子，例如SEQIDNOs:1、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17和50。多核苦酸可以與4壬4可這些例子不同，但是又不會(huì)改變其編碼的多肽。例如，能夠編碼這些保守氨基酸取代的密碼子是本領(lǐng)域已知的。此外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明還可以使用其內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸被刪除、取代或添加、而不改變天冬酰胺合成酶功能的多肽。在本發(fā)明的一方面中，本發(fā)明的多核苷酸^f皮稱(chēng)為引入的多核苷酸分子。如果(無(wú)論多么間接地)將多核苷酸分子經(jīng)過(guò)人工操作插入到細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)，則多核苷酸分子被稱(chēng)為"引入的"。引入的多核苷酸分子的例子包括但不局限于經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、注射和投射(projection)引入到細(xì)胞內(nèi)的多核苷酸，以及那些經(jīng)過(guò)接合、胞吞作用、吞噬作用等引入到有機(jī)體內(nèi)的多核苷酸。優(yōu)選地，多核苷酸插入細(xì)胞的基因組中。本發(fā)明的多核苷酸分子的一個(gè)子集是片段多核苷酸分子。片段多核苷酸分子可以由本發(fā)明的多核苷酸分子的主要部分或甚至大部分(例如具體公開(kāi)的那些)組成?？蛇x地，片段可以包含較小的寡核普酸(具有大約15至大約400個(gè)核苷酸殘基，更優(yōu)選地具有大約15至大約30個(gè)核苦酸殘基、或大約50至大約100個(gè)核苷酸殘基、或大約100至大約200個(gè)核苷酸殘基、或大約200至大約400個(gè)核苷酸殘基、或大約275至大約350個(gè)核香酸殘基)。本發(fā)明的一種或多種多核苷酸分子的片段可以是探針，特別是PCR引物分子。PCR引物是在與另一個(gè)多核苷酸形成雙鏈結(jié)構(gòu)時(shí)能夠啟動(dòng)聚合酶活性的多核苷酸分子。本領(lǐng)域中存在確定PCR探針的結(jié)構(gòu)和PCR技術(shù)的各種方法。如此處所用的，如果兩個(gè)分子能夠形成反平行的、雙鏈多核苷酸結(jié)構(gòu)，則這兩個(gè)多核苷酸分子被認(rèn)為能夠互相特異性雜交。如果兩個(gè)多核苷酸具有完全的互補(bǔ)性，則一個(gè)多核苷酸分子被認(rèn)為與另一個(gè)多核苷酸分子"互補(bǔ)"。如此處所用的，當(dāng)一個(gè)分子的每一個(gè)核香酸都與另一個(gè)分子的核苷酸互補(bǔ)時(shí)，這兩個(gè)分子被稱(chēng)為具有"完全的互補(bǔ)性"。如果在至少是常規(guī)的"低嚴(yán)格性"條件下兩個(gè)分子能夠足夠穩(wěn)定地相互雜交從而保持相互退火，那么這兩個(gè)分子被稱(chēng)為"最小互補(bǔ)的"。同樣地，如果在常規(guī)的"高嚴(yán)格性"條件下兩個(gè)分子能夠足夠穩(wěn)定地相互雜交從而保持相互退火，那么這兩個(gè)分子被稱(chēng)為"互補(bǔ)的，，。常規(guī)的嚴(yán)格性條件在Sambrook等人，(2001)和Haymes等人，(1985)中有所描述。因此，偏離完全互補(bǔ)也是允許的，只要該偏離不會(huì)完全排除分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力即可。因此，為了使多核苷酸分子可以作為引物或探針使用，僅需在序列上足夠互補(bǔ)，以在使用的特定溶劑和鹽濃度下能夠形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。促進(jìn)DNA雜交的適當(dāng)?shù)膰?yán)格性條件，例如在大約45°C下使用6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，然后在20-25°C下使用2.0XSSC進(jìn)行清洗，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或者可以參考Ausubel,等人，eds.(1989)，6.3.1-6.3.6部分。例如，清洗步驟中的鹽濃度可以選自低嚴(yán)格性的50。C大約2.0XSSC至高嚴(yán)格性的65。C大約0.2XSSC。此外，清洗步驟的溫度可以從低嚴(yán)格性條件的室溫大約22°C至高嚴(yán)格性的大約65。C。溫度和鹽都可以改變，或者溫度或鹽濃度中的任一個(gè)保持恒定，以使核酸能夠與此處所提供的一種或多種多核苷酸分子(例^口SEqiDNOsl、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18-45和50所示)及其互補(bǔ)物在中等嚴(yán)格條件(例如大約2.0XSSC和大約65°C)下特異性雜交。12在本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的任何多核苷酸序列或多肽序列或其片段都可用于檢索相關(guān)序列。此處所使用的"檢索相關(guān)序列"是指確定兩個(gè)序列間相關(guān)性的任何方法，包括但不局限于對(duì)比序列同源性的檢索，例如針對(duì)與單個(gè)多肽序列的相關(guān)性進(jìn)行的數(shù)據(jù)庫(kù)PBLAST檢索。還可以使用基于圖譜的方法進(jìn)行其它的檢索，例如由南達(dá)科他大學(xué)，SD維護(hù)的HMM(HiddenMarkov模型)META-MEME,以及由國(guó)家生物技術(shù)信息中心、國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書(shū)館和國(guó)家衛(wèi)生研究院(NCBI)維護(hù)的PSI-BLAST。多核苷酸分子可以編碼基本上相同或基本上同源的多肽分子。相同或同源性的程度可以使用計(jì)算機(jī)軟件(例如WISCONSINPACKAGEGap程序)來(lái)確定。來(lái)自GeneticsComputerGroup,Inc.的10.0-UNIX版本的WISCONSINPACKAGE中的Gap程序是基于Needleman和Wunsch,1970中的方法。使用BLAST2.2.1軟件套裝中的TBLASTN程序(Altschul等人，1997)或使用BLOSUM62矩陣(Henikoff和Henikoff,1992)。本發(fā)明的多核苷酸分子還可以編碼同系多肽。此處所使用的同系多肽分子或其片段是在第二物種中的相應(yīng)蛋白質(zhì)分子或其片段(例如玉米核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基是擬南芥核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基的同系物)。還可以通過(guò)分子進(jìn)化或DNA改組技術(shù)來(lái)產(chǎn)生同系物，從而該分子保留原多肽的至少一種功能或結(jié)構(gòu)特征(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,811,238)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的任何多核苷酸分子都可以與在植物細(xì)胞中能夠引起mRNA分子產(chǎn)生的啟動(dòng)子區(qū)可操作地連接，其中，與該啟動(dòng)子連接的多核苷酸分子相對(duì)于該啟動(dòng)子是異源的。此處所使用的"異源"DNA為在臨近的DNA中不會(huì)天然出現(xiàn)的任何DNA序列。"天然的"是指天然存在的核酸序列。"異源"序列通常起源于外來(lái)的來(lái)源或物種，或者如果來(lái)自相同來(lái)源的話，由其基因組中的原始形式和/或位置修飾而成。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"、"肽分子"或"多肽"包括包含五個(gè)或更多氨基酸的任何分子。本領(lǐng)域公知蛋白質(zhì)、肽或多肽分子可以經(jīng)過(guò)修飾，包括翻譯后修飾，例如但不局限于二硫鍵形成、糖基化、磷酸化或寡聚化。因此，此處所使用的術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"、"肽分子"或"多肽"包括通過(guò)任何生物學(xué)或非生物學(xué)方法修飾的任何蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"氨基酸"和"氨基酸類(lèi)"是指所有天然存在的L-氨基酸。這個(gè)定義意于包括正亮氨酸、正纈氨酸、鳥(niǎo)氨酸、高半胱氨酸和高絲氨酸。"蛋白質(zhì)片段"是其氨基酸序列包含該蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分的肽或多肽分子。包含另外一個(gè)或多個(gè)并非來(lái)自該蛋白質(zhì)的肽區(qū)域的蛋白質(zhì)或其片段是"融合"蛋白。這些分子可以衍生化從而包含碳水化合物或其它部分(例如匙孔蜮血藍(lán)蛋白)。本發(fā)明的融合蛋白或肽分子優(yōu)選通過(guò)重組方式產(chǎn)生。植物構(gòu)建體和植物轉(zhuǎn)化體編碼天冬酰胺合成酶的本發(fā)明的一種或多種DNA構(gòu)建體可用于植物轉(zhuǎn)化或植物轉(zhuǎn)染中。外源基因材料可被轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞中，植物細(xì)胞可再生成為完整的、能育的或不育的植物。外源基因材料可以為能夠插入任何生物體的來(lái)自任何來(lái)源的任何遺傳材料，無(wú)論是否是天然存在的。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的多核苷酸序列還編碼參與細(xì)胞內(nèi)定位、輸出或翻譯后修飾的肽，例如葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"基因"包括提供轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的核酸分子，包含在植物中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子、5，非翻譯分子(例如內(nèi)含子和前導(dǎo)序列)、轉(zhuǎn)錄核酸分子和3'轉(zhuǎn)錄終止分子。編碼本發(fā)明的多肽的多核酸分子可以與其它非天然的或異源序列通過(guò)多種方式相結(jié)合。"異源"序列是指未天然發(fā)現(xiàn)與編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列相連的任何序列，包括例如來(lái)自相同植物^旦并未天然連接在一起的核苷酸序列的組合，或者來(lái)自?xún)煞N不同物種的序列的組合。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"是指調(diào)控性和結(jié)構(gòu)性多核苷酸分子的物理和功能重排，其引起了可操作地連接的結(jié)構(gòu)性多核14苷酸分子的受調(diào)控的表達(dá)。DNA構(gòu)建體或轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是指來(lái)自本發(fā)明的多核苷酸分子的有義或反義RNA或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定的蓄積或其翻譯。"有義"RNA是指包含mRNA的RNA轉(zhuǎn)錄本，因此可以由細(xì)胞翻譯為多肽或蛋白質(zhì)。"反義RNA"是指與所有或部分目標(biāo)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本或mRNA互補(bǔ)的以及阻斷靶基因表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄本(美國(guó)專(zhuān)利5,107,065。在此引入作為參考)。反義RNA可以與特定的基因轉(zhuǎn)錄本的任何部分互補(bǔ)，即在5'非編碼序列、3，非翻譯序列、內(nèi)含子或編碼序列處。"RNA轉(zhuǎn)錄本"是指RNA聚合酶催化的DNA序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄本是DNA序列的完美互補(bǔ)拷貝時(shí)，其被稱(chēng)為初級(jí)轉(zhuǎn)錄本，或者其可以是初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)生的RNA序列，并被稱(chēng)為成熟RNA。此處所使用的術(shù)語(yǔ)植物表達(dá)盒是指包含與靶分子可操作地連接的必需DNA調(diào)節(jié)分子以提供在植物細(xì)胞中表達(dá)的構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含引起本發(fā)明的多肽過(guò)表達(dá)的啟動(dòng)子，其中，"過(guò)表達(dá)"是指正常地在宿主細(xì)胞中不存在的，或者在所述宿主細(xì)胞中的存在水平高于由編碼所述多肽的內(nèi)源基因正常表達(dá)的水平的多肽表達(dá)。能夠引起本發(fā)明的多肽過(guò)表達(dá)的啟動(dòng)子一般是本領(lǐng)域已知的，提供組成型表達(dá)模式的它們的例子包括花椰菜花葉病毒19S啟動(dòng)子和花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利5,352,605)、玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利6,051，753)、甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利5,994,123)、鴨跖草黃斑駁病毒啟動(dòng)子(Medberry等人，1992)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基啟動(dòng)子、水稻胞質(zhì)磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子、水稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利5,641,876)、玉米泛素啟動(dòng)子、甘露堿合酶啟動(dòng)子和章魚(yú)^咸合酶啟動(dòng)子。這樣的遺傳構(gòu)建體可以轉(zhuǎn)運(yùn)到單子葉或雙子葉植物中，包括但不局限于苜蓿、蘋(píng)果、擬南芥、香蕉、油菜、加拿大油菜、蓖麻子、咖啡、玉米、棉花、棉籽、菊花、海甘藍(lán)、黃瓜、石斛、山藥、桉樹(shù)、15牛毛草、亞麻、劍蘭、百合科、亞麻子、栗、香瓜、芥末、燕麥、油椰子、蕓苔、花生、多年生黑麥草、菜豆、油菜籽、水稻、高粱、大豆、棵麥、tritordeum、草皮草、小麥、紅花、芝麻、甜菜、甘蔗、蔓越莓、番木瓜、紅花和向日葵(Christou,1996)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，遺傳材料被轉(zhuǎn)運(yùn)到玉米細(xì)胞中。編碼蛋白質(zhì)的多核香酸分子的轉(zhuǎn)運(yùn)可以導(dǎo)致該多肽在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)或過(guò)表達(dá)。由本發(fā)明的多核苷酸分子編碼的達(dá)。,、/、。、3、、'在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含編碼多肽序列的多核苷酸分子，該多肽序列選自SEQIDNOsl、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17和50。本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化的玉米細(xì)胞，其中，相對(duì)于不包含這種DNA構(gòu)建體的未轉(zhuǎn)化的玉米植物而言，該細(xì)胞具有提高的天冬酰胺水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含與玉米天冬酰胺合成酶編碼序列(例如SEQIDNOs1、3、5或50)可才喿作地連接的異源DNA分子，該DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到玉米細(xì)月包中。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:50或此處所述的相關(guān)序列的本發(fā)明的DNA構(gòu)建體被提供到轉(zhuǎn)化的玉米細(xì)胞中，該DNA構(gòu)建體的表達(dá)使得相對(duì)于未用該DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的玉米植物而言，玉米^:物組織的天冬酰胺增加，或者玉米植物種子的蛋白質(zhì)增加。在一些實(shí)施方案中，AsnS的一種或多種產(chǎn)物的水平可以在整個(gè)植物中增加或者在植物的一個(gè)或多個(gè)特定的器官或組織中局部增加。并非限制本發(fā)明的范圍，有幾種啟動(dòng)子序列可用于表達(dá)上述酶的基因。例如，玉米C4型PPDK啟動(dòng)子(Glackin等人，1990)、玉米C4型PEPC啟動(dòng)子(Hudspeth和Grula,1989)、水稻核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基啟動(dòng)子(Kyozuka等人，1993)和集光葉綠素a/b結(jié)合蛋白啟動(dòng)子(Sakamoto等人，1991)、P-FDA啟動(dòng)子(美國(guó)20040216189A1,其多核苷酸序列在此引入作為參考)和P-RTBV啟16動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利5,824,857，其多核苷酸序列在此引入作為參考)。例如，天冬酰胺或蛋白質(zhì)的水平可以在植物的一個(gè)或多個(gè)組織和器官(包括但不局限于根、塊莖、莖、葉子、稈、果實(shí)、漿果、堅(jiān)果、樹(shù)皮、豆莢、種子和花)中增加。優(yōu)選的器官是種子。為了在植物的來(lái)源組織(例如葉子、種子、根或莖)中表達(dá)，優(yōu)選地，使用的啟動(dòng)子在這些特定的組織中具有相對(duì)高的表達(dá)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的組織特異性表達(dá)是特別優(yōu)選的實(shí)施方案。包含目的編碼區(qū)的DNA構(gòu)建體或載體還可以包括用來(lái)完全或部分地終止該編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄的多核香酸序列。已經(jīng)分離了一些這樣的序列，包括T-NOS3'區(qū)(Ingelbrecht等人,1989;Bevan等人,1983)。調(diào)控轉(zhuǎn)錄終止區(qū)也可以包含在本發(fā)明的植物表達(dá)構(gòu)建體中?？梢酝ㄟ^(guò)編碼目的基因的DNA序列、或來(lái)自不同基因來(lái)源的方便的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(例如，與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然相關(guān)的轉(zhuǎn)錄終止區(qū))來(lái)提供轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道能夠在植物細(xì)胞中終止轉(zhuǎn)錄的任何方便的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)都可用于本發(fā)明的構(gòu)建體中。載體或構(gòu)建體還可以包含調(diào)節(jié)元件，例如內(nèi)含子。其例子包括Adh內(nèi)含子l(Callis等人，1987)、蔗糖合酶內(nèi)含子(Vasil等人,1989)、hsp70內(nèi)含子(美國(guó)專(zhuān)利5，859,347)和TMVw元件(Gallie等人,1989)。當(dāng)適當(dāng)時(shí)，可以包括這些和其它調(diào)節(jié)元件。載體或構(gòu)建體還可以包含選擇性標(biāo)記。選^^性標(biāo)記還可以用于選擇包含外源遺傳材料的植物或植物細(xì)胞。其例子包括但不局限于基因(Potrykus等人，1985),其可以編碼卡那霉素抗性，并可使用卡那霉素、叩tll、G418、hpt等選擇；6"r基因，其編碼雙丙氨膦(bialaphos)抗性；突變EPSP合酶基因(Hinchee等人，1988;Reynaerts等人，1988;Jones等人，1987),其編碼草甘膦抗性；提供溴苯腈抗性的腈水解酶基因(Stalker等人，1988);提供咪唑啉酮或磺脲抗性的突變乙酰乳酸合酶基因(ALS)(美國(guó)專(zhuān)利4,761,373;D'Halluin等人，1992);和甲氨喋呤抗性DHFR基因(Thillet等人，1988)。植物轉(zhuǎn)化最常用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法為土壤桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化方法和生物彈道(biolistics)或微粒轟擊介導(dǎo)的方法(即基因槍)。典型地，核轉(zhuǎn)化是所需的，但是如果希望特異性地轉(zhuǎn)化質(zhì)體，例如葉綠體或造粉體，可以使用微粒介導(dǎo)的所需多核苷酸的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體。通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化向植物內(nèi)引入轉(zhuǎn)基因的方法使用了T-DNA(轉(zhuǎn)運(yùn)DNA),T-DNA引入了轉(zhuǎn)基因的基因元件并將這些基因元件轉(zhuǎn)運(yùn)到植物的基因組中。一般而言，由右邊界DNA分子(RB)和左邊界DNA分子(LB)界定的轉(zhuǎn)基因被轉(zhuǎn)運(yùn)到植物基因組的單個(gè)基因座上。"T-DNA分子"是指通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法整合到植物基因組內(nèi)的DNA分子。T-DNA分子的末端在本發(fā)明中被限定為其側(cè)翼是來(lái)自土壤桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA的邊界區(qū)域。這些邊界區(qū)域通常被稱(chēng)為右邊界(RB)和左邊界(LB)區(qū)域，并且根據(jù)它們是來(lái)自土壤桿菌的胭脂堿或章魚(yú)堿產(chǎn)生菌林，其核苷酸序列和長(zhǎng)度會(huì)所基因設(shè)計(jì)的，通常其長(zhǎng)度為幾百個(gè)多核苷酸，并包含切口位點(diǎn)，在該位點(diǎn)上內(nèi)切核酸酶消化DNA來(lái)提供用于插入植物基因組內(nèi)的位點(diǎn)。T-DNA分子通常包含一個(gè)或多個(gè)植物表達(dá)盒。關(guān)于微粒轟擊(美國(guó)專(zhuān)利5,550,318;5，538,880;和5,610,042;它們中的每一個(gè)的全部?jī)?nèi)容都被特定地引入作為參考)，顆粒由多核苷酸包裹，并通過(guò)推進(jìn)力被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。示例性的顆粒包括那些包含鎢、柏和優(yōu)選金的顆粒。通過(guò)顆粒加速來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)DNA到植物細(xì)胞內(nèi)的有用的方法是生物彈道顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(BioRad,Hercules，California)，其可用于推進(jìn)由DNA或細(xì)胞包裹的顆粒通過(guò)一個(gè)篩子(例如不銹鋼或Nytex篩子)到達(dá)由在懸浮液中培養(yǎng)的單子葉植物細(xì)胞覆蓋的濾網(wǎng)表面。微粒轟擊技術(shù)廣泛適用，并可用于轉(zhuǎn)化事實(shí)上任何植物種。通過(guò)微粒轟擊進(jìn)行轉(zhuǎn)化的種的例子包括單子葉植物種，例如玉米(PCT公布WO95/06128)、大麥、小麥(美國(guó)專(zhuān)利5,563,055，其全部在此引入作為參考)、水稻、燕麥、棵麥、甘蔗和高粱；以及一些雙子葉植物，包括煙草、大豆(美國(guó)專(zhuān)利5,322,783,其全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考)、向日葵、花生、棉花、西紅柿和豆類(lèi)(美國(guó)專(zhuān)利5,563,055，其全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考)。無(wú)論采用何種轉(zhuǎn)化方法，為了選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或給其打分，引入到細(xì)胞內(nèi)的DNA包含一個(gè)基因，該基因在可再生的植物組織中產(chǎn)生能夠使植物組織具有毒性化合物抗性的化合物。用作可選擇的、可篩選的或可打分的標(biāo)記的目的基因包括但不局限于GUS、綠色熒光蛋白(GFP)、螢光素酶(LUX)和抗生素或除草劑抗性基因。抗生素抗性基因的例子包括那些提供卡那霉素(和新霉素、G418)和博來(lái)霉素抗性的基因。由各種轉(zhuǎn)化的外植體再生、發(fā)育和培養(yǎng)植物是本領(lǐng)域已知的。這種再生和生長(zhǎng)過(guò)程通常包括選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以及通過(guò)生根小植林階段通過(guò)胚發(fā)育的普通階段培養(yǎng)那些個(gè)體化細(xì)胞的步驟。轉(zhuǎn)基因胚和種培養(yǎng)基(例如土壤)中。與選擇劑接觸后存活的細(xì)胞或在篩選分析中溫室或生長(zhǎng)室中進(jìn)行成熟之前，發(fā)育的小植抹被轉(zhuǎn)移到無(wú)土植物生長(zhǎng)混合物中4吏其受冷耐寒。本發(fā)明可與任何可轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織一起使用。此處所使用的可轉(zhuǎn)化的是指能夠進(jìn)一步繁殖以產(chǎn)生植物的細(xì)胞或組織。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道有許多植物細(xì)胞或組織是可轉(zhuǎn)化的，其中，在插入外源DNA之后，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，植物細(xì)胞或組織可以形成分化的植物。適用于這些目的的組織包括但不局限于未成熟的胚、盾片組織、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液、未成熟的花、苗分生組織、節(jié)點(diǎn)外植體、愈傷組織、胚軸組織、子葉、根和葉子?？梢允褂萌魏魏线m的植物培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基的例子包括但不局限于補(bǔ)充了附加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)(包括但不局限于生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、ABA和赤霉素)的基于MS的培養(yǎng)基(Murashige和Skoog,1962)或基于N6的培養(yǎng)基(Chu等人，18:659,1975)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉各種組織培養(yǎng)基，當(dāng)適當(dāng)補(bǔ)充時(shí)，它們可以維持植物組織生長(zhǎng)和發(fā)育并適于植物轉(zhuǎn)化和再生。這些組織培養(yǎng)基或者可以作為市售制劑購(gòu)買(mǎi)，或者可以自行配制和改造。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道轉(zhuǎn)化和再生中使用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基補(bǔ)充物(例如營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物)，以及其它的培養(yǎng)條件(例如培養(yǎng)中的光照強(qiáng)度、pH和培養(yǎng)溫度)可以根據(jù)特定的品種進(jìn)行優(yōu)化。本發(fā)明的任何多核苷酸分子可以與其它的基因元件(例如載體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)組合以永久的或暫時(shí)的方式引入到植物細(xì)胞中。此外，本發(fā)明的任何多核苷酸分子可以以允許多核苷酸分子編碼的蛋白質(zhì)或其片段表達(dá)或過(guò)表達(dá)的方式引入到植物細(xì)胞中。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的植物的部分，特別是生殖或儲(chǔ)存部分。植物部分包括但不局限于種子、胚乳、胚珠、花粉或塊莖。在本發(fā)明特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，植物部分為玉米種子。在一個(gè)實(shí)施方案中，玉米種子(或谷粒)是動(dòng)物飼料的組成成分。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，玉米飼料或玉米粗粉或來(lái)自玉米種子的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)用于家畜或人類(lèi)或二者。生產(chǎn)飼料、粗粉和蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的。例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,957,748;5,100,679;5,219,596;5，936,069;6,005,076;6,146,669;和6,156,227。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)制劑為高蛋白質(zhì)含量的制劑。這樣的高蛋白質(zhì)含量的制劑優(yōu)選具有大于大約5%(w/v)，更優(yōu)選大于10%(w/v)，再更優(yōu)選大于15%(w/v)的蛋白質(zhì)含量。關(guān)于通常用于不同的性狀和農(nóng)作物的培育方法的說(shuō)明可參考幾本參考書(shū)(例如Hayward,1993;Richards,1997;Allard，1999)。其它生物體本發(fā)明的多核苷酸可以引入到任何細(xì)胞或生物體中，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物、魚(yú)細(xì)胞、魚(yú)、鳥(niǎo)細(xì)胞、鳥(niǎo)、藻類(lèi)細(xì)胞、藻類(lèi)、真菌細(xì)胞、真菌或細(xì)菌細(xì)胞。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可在適當(dāng)?shù)募?xì)胞或生物體20中產(chǎn)生。優(yōu)選的宿主和轉(zhuǎn)化體包括真菌細(xì)胞(例如曲霉屬、酵母)、哺乳動(dòng)物(特別是牛和豬)、昆蟲(chóng)、細(xì)菌和藻類(lèi)。特別優(yōu)選的細(xì)菌為根癌農(nóng)桿菌和大腸桿菌。在本發(fā)明的一方面中，本發(fā)明的一種或多種核酸分子用于確定植物(優(yōu)選為加拿大油菜、玉米、油菜、蕓苔、油菜籽、大豆、芥末、海甘藍(lán)、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花、油椰子、亞麻或向日葵)中部分或完全由本發(fā)明的一種或多種多核苷酸分子所編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(即樣品中的mRNA濃度等)或表達(dá)模式(即表達(dá)動(dòng)力學(xué)、分解速率、穩(wěn)定性能等)。可以使用許多方法比較兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或組織樣品之間的表達(dá)。這些方法包括雜交分析，例如RNA印跡法、RNA酶保護(hù)分析和原位雜交?？蛇x地，該方法包括PCR型分析。在一個(gè)優(yōu)選的方法中，表達(dá)是通過(guò)將來(lái)自?xún)蓚€(gè)或多個(gè)樣品的多核苷酸與多核苷酸陣列進(jìn)行雜交而評(píng)估的。該陣列包括多種已知存在于或懷疑存在于樣品的細(xì)胞或組織中的懷疑序列。本文包括下面的實(shí)施例來(lái)證明本發(fā)明的各個(gè)方面，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容應(yīng)該理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對(duì)公開(kāi)的具體實(shí)施方案進(jìn)行許多改變。實(shí)施例本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解本發(fā)明提供的方法和組合物的許多域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，下面的實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在實(shí)施本發(fā)明中運(yùn)用良好的技術(shù)，因此可被認(rèn)為構(gòu)成了實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容應(yīng)該理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對(duì)公開(kāi)的具體實(shí)施方案進(jìn)行許多改變，而且仍然獲得相同或類(lèi)似的結(jié)果。本文引入在此引用的全部參考文獻(xiàn)作為參考，以補(bǔ)充、解釋、提供背景或教導(dǎo)在此使用的方法、技術(shù)或組合物。實(shí)施例1玉米和大豆植物cDNA和基因組文庫(kù)的構(gòu)建該實(shí)施例描述了來(lái)自玉米和大豆4直物組織的cDNA文庫(kù)的產(chǎn)生，本發(fā)明的玉米AsnS和大豆多核苷酸序列從該玉米和大豆植物組織中分離。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)(例如Alba,2004)從玉米和大豆組織產(chǎn)生cDNA文庫(kù)。玉米cDNA文庫(kù)是由兩種不同的組織制成的。文庫(kù)是由緩慢生長(zhǎng)階段(dilatoryphase)從近交系90DDD5收獲的初期核仁制成的。第二個(gè)玉米cDNA文庫(kù)是由來(lái)自玉米近交系H99的抽絲生長(zhǎng)階段的絲組織和來(lái)自玉米近交系M017的發(fā)芽花粉制成的。為了構(gòu)建來(lái)自大豆(G(y""ew似)的cDNA文庫(kù)，從再水化的品種A3237(Asgrow)干大豆種子中切除分生組織和部分下胚軸。通過(guò)首先在28。C和每天18小時(shí)光照下在固體組織培養(yǎng)基中使表面滅菌的種子發(fā)芽6天、然后轉(zhuǎn)移發(fā)芽的種子到4°C中至少24小時(shí)來(lái)制備外植體。對(duì)于文庫(kù)制備中使用的組織而言，去除子葉以富集特定的目的組織。使用0.5至2克組織制備總RNA和polyA+RNA。對(duì)于所有的cDNA文庫(kù)而言，收集植物組織并立即置于液氮中冷凍。收集的組織儲(chǔ)存在-80°C下，直到制備總RNA。使用來(lái)自InvitrogenCorporation的Trizoli式劑(InvitrogenCorporation,Carlsbad，California,U.S.A.),基本上才艮據(jù)廠商推薦的方法純化總RNA。使用磁性oligodT珠子，基本上根據(jù)廠商(Dynabeads,DynalBiotech,Oslo,Norway)推薦的方法纟屯化polyA+RNA(mRNA)。植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建是本領(lǐng)域^^知的，并且存在許多克隆策略。有許多cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒可以商購(gòu)獲得。根據(jù)SuperscriptIIcDNA文庫(kù)合成方案所述，使用SuperscriptcDNA合成和質(zhì)粒克隆質(zhì)粒系統(tǒng)(InvitrogenCorporation)來(lái)制備cDNA文庫(kù)。才企查cDNA文庫(kù)來(lái)確定適當(dāng)?shù)牟迦胛镙d體比例。根據(jù)下述修改的基因組DNA分離方法(Dellaporta等人，1983),〃使用從玉米分離的基因組DNA來(lái)構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)。玉米秧苗在土壤中或培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)，收獲，并在液氮中冷凍保存直至提取。在用液氮使組織保持冷凍的同時(shí)，使用研缽和研扦將組織碾成細(xì)d、粉末。將粉末組織轉(zhuǎn)移到含有在臨用前加入的200mL冷(0。C)DNA提取緩沖液(350mM山梨醇；100mMTris;5mMEDTA;使用HC1調(diào)節(jié)pH至7.5;亞硫酸氫鈉，3.8mg/mL)的Waring混合器中，并高速勻漿化30-60秒。勻漿通過(guò)一層粗棉布(cheesecloth)過(guò)濾，并收集到一個(gè)離心瓶中。然后將樣品在2500xg下離心20分鐘，并棄去上清液和任何松散的綠色材料。然后將沉淀重懸浮于1.25mLDNA提取緩沖液中，并轉(zhuǎn)移到50mL聚丙烯試管中。然后加入核裂解緩沖液(1.75mL,包含200mMTris;50mMEDTA;2MNaCl;2,0%(w/v)CTAB;使用HC1調(diào)節(jié)pH至7.5),再加入0.6mL5%(w/v)肌氨酰。輕輕地混合試管，樣品在65。C下溫育20分鐘。添加等體積的氯仿異戊醇(24:1),然后再次輕輕地混合試管。然后以2500xg離心試管15分鐘，將得到的上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的試管中。將等體積的冰冷的異丙醇傾倒到樣品上，顛倒樣品幾次直至形成沉淀。使用玻璃移液管從溶液中移出沉淀，使沉淀物風(fēng)干2-5分鐘以去除殘余的醇。將沉淀物重懸浮于400mLTE緩沖液(lOmMTris-HC1,1mMEDTA,pH調(diào)節(jié)至8.0)中。實(shí)施例2通過(guò)連"l妄獨(dú)立克隆方法和63〖6*37@克隆方法的AsnS多核苷酸序列分離，以及玉米轉(zhuǎn)化。該實(shí)施例闡明了使用連接獨(dú)立和0316\￥&丫@克隆方法分離編碼AsnS的多核苦酸分子以及構(gòu)建本發(fā)明的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼從表1所述的各種植物和微生物來(lái)源分離的AsnS多肽的多核苷酸分子。用于驅(qū)動(dòng)連接的AsnS編碼多核苷酸分子的表達(dá)的啟動(dòng)子分子為水稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子P-Os.Actl(美國(guó)專(zhuān)利5,641，876,在此引入作為參考)；玉米PPDK(Matsuoka等人，1993)、P-RTBV-1(美國(guó)專(zhuān)利5，824，857,在此引入作為參考)和P-Zm.NAS(編碼來(lái)自玉米的煙胺合酶2多肽的基因組區(qū)的啟動(dòng)子分子)。23表1.AsnS編碼序列來(lái)源、啟動(dòng)子和DNA構(gòu)建體。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>連接獨(dú)立克隆(LIC)被開(kāi)發(fā)用于克隆PCR產(chǎn)物，它是基于非回文單鏈末端的退火。LIC是一種有效的克隆方法，其不受限制性位點(diǎn)的限制或受需要限制性?xún)?nèi)切酶消化或連接反應(yīng)的限制，形成無(wú)縫連接(Aslanidis和deJong,1990)。使用"切口內(nèi)切核酸酶"和限制性?xún)?nèi)切核酸酶在載體中產(chǎn)生末端單鏈DNA區(qū)段。切口內(nèi)切核酸酶是一種內(nèi)切核酸酶，其在多核苷酸雙鏈的一條鏈上形成切口，以在克隆載體上產(chǎn)生單鏈尾巴。載體首先用標(biāo)準(zhǔn)的限制性?xún)?nèi)切核酸酶線性化。然后再使用切口內(nèi)切核酸酶進(jìn)行消化。在熱處理之后，在載體中產(chǎn)生了末端單鏈DNA區(qū)段。推薦大約55%的GC含量用于下游PCR擴(kuò)增和有效退火。啟動(dòng)子、標(biāo)簽或其它序列元件可纟皮添加到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的5，和3，末端，以產(chǎn)生可用于下游應(yīng)用的線性構(gòu)建體。DNA構(gòu)建體pMON92870是由基礎(chǔ)載體pMON82060和如SEQIDNO:5所示的編碼AsnS多肽的玉米AsnS3多核苷酸分子裝配而成的。使用限制性?xún)?nèi)切核酸酶Hpal將質(zhì)粒骨架pMON82060線性化。然后使用切口內(nèi)切核酸酶N.BbvCIA(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)處理質(zhì)粒骨架。消化以后，加熱反應(yīng)體系至65。C。這使得DNA的切口^^與它們的互補(bǔ)DNA^i解離。產(chǎn)生的線性化質(zhì)粒骨架具有兩個(gè)末端單鏈DNA區(qū)段，可用于裝配。使用聚合酶鏈反應(yīng)在編碼AsnS的DNA分子中產(chǎn)生末端單鏈DNA區(qū)段。使用編碼AsnS多肽的玉米AsnS3多核苷酸序列(SEQIDNO:5)設(shè)計(jì)正向PCR引物(SEQIDNO:48)和反向PCR引物(SEQIDNO:49):SEQIDNO:48:GCAGTCGCTGTCGTTACCCGGCATCATGTGTGGCATCSEQIDNO:49:GCGAGTACCGCTGGGTTCTAACGTACTCTCGTCAGACCGCG使用高保真度熱聚合酶-KOD熱啟動(dòng)DNA聚合酶(Novagen,Madison，WI)來(lái)進(jìn)行聚合酶4連反應(yīng)擴(kuò)增。聚合酶鏈反應(yīng)在25|aL體積中進(jìn)行，其中含有IXKOD熱啟動(dòng)DNA聚合酶緩沖液、1M甜菜堿(Sigma,St.Louis,MO)、lmMMgS04、250pMdNTPs、各5pmols的每種引物和1單位的KOD熱啟動(dòng)DNA聚合酶。聚合酶鏈反應(yīng)在PTC-225DNAEngineTetradTM熱循環(huán)儀(MJResearchInc.,Waltham，MA)中進(jìn)行，使用下述循環(huán)參數(shù)1.94。C2分鐘2.94。C15秒3.70。C30秒(每個(gè)循環(huán)-1°C)4.72°C5分鐘5.回到步驟2,循環(huán)9次6.94。C15秒7.60。C30秒8.72°C5分鐘9.回到步驟6，循環(huán)24次10.72。C10分鐘11.10°C維持12.結(jié)束進(jìn)行第二輪聚合酶鏈反應(yīng)，以在產(chǎn)生末端單鏈DNA區(qū)段的區(qū)域中引入尿苷殘基。許多DNA聚合酶不能讀取DNA的模板鏈上的尿普殘基，或者不能使用尿苷殘基來(lái)聚合鏈。因此，使用能夠引入和讀取尿苦的酶(ExpandHighFidelityplusPCRSystem;Roche，Indianapolis,25的修改以及使用能夠提供預(yù)期結(jié)果的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。將裝配的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到ElectroMAXDH10B大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。來(lái)自裝配反應(yīng)的0,5|iL(微升)等分試樣與20(iLElectroMAXDH10B感受態(tài)細(xì)胞在冰上混合，并力口載至)JMicroPulser0.2mm電穿孑L容器(Bio-RadLaboratoriesInc.,HerculesCA)中進(jìn)行電穿孔。使用165-2100MicroPulser電穿孔4義(Bio-RadLaboratoriesInc.)在1.8kV下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。電穿孔的細(xì)胞在180|aLSOC培養(yǎng)基(InvitrogenInc.)中37°C培養(yǎng)1小時(shí)。然后將細(xì)胞涂布到包含壯觀霉素(75mg/L)的LB瓊脂平板上，在37。C生長(zhǎng)過(guò)夜。選擇菌落，并在LB培養(yǎng)基中在37。C生長(zhǎng)過(guò)夜。使用QIAprepSpinMiniprepi式劑盒(QIAgenSciences,Valencia,CA)來(lái)分離質(zhì)粒DNA構(gòu)建體。使用BigDye⑧終止子(AppliedBiosystems,FosterCity，CA)在ABI3730x1DNA分析4義上進(jìn)4亍DNA測(cè)序。如廠商(InvitrogenCorp.)所述使用Gateway⑧克隆方法來(lái)完成玉米AsnS2、大豆AsnS和酵母AsnSl等AsnS編碼多核苷酸序列的克隆。Gateway④克隆方法的目的在于制備表達(dá)克隆。這個(gè)兩步法包括首先克隆目的基因至一個(gè)進(jìn)入載體中，然后再將該目的基因從進(jìn)入載體亞克隆至目的載體中，以產(chǎn)生表達(dá)載體。該克隆技術(shù)是基于噬菌體人使用的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)來(lái)向大腸桿菌染色體中整合DNA。將在后續(xù)的重組克隆中使用的DNA構(gòu)建體、兩個(gè)attB或attR重組序列克隆到一個(gè)重組載體中，側(cè)翼為壯觀霉素/鏈霉素抗性基因(SPC/STR)和編碼AsnS的多核苦酸序列。編碼AsnS的多核苷酸序列是〗吏用初級(jí)和次級(jí)引物序列(SEQIDNOs20-43),人由它們相應(yīng)的物種制備的cDNA或基因組文庫(kù)中分離出來(lái)的。鄰接的attBl/Rl、SPC/STR基因、AsnS基因和attB2/R2序列作為單個(gè)多核苷酸分子被移動(dòng)到重組構(gòu)建體中用于在植物細(xì)胞中表達(dá)，這些雙鏈DNA質(zhì)粒一皮命名為pMON79706(玉米AsnS2)、pMON79700(大豆AsnS)或pMON79653(酉良酒酵母AsnS)。這些DNA構(gòu)建體包含土;裏桿菌右邊5，322，938)、attBl/Rl遺傳元件(O-Lam.attBl/Rl)、SPC/STR基因、相應(yīng)的AsnS編碼區(qū)(CR)、attB2/R2遺傳元件(0-Lam.attB2/R2)、馬鈴薯蛋白酶抑制劑II終止子(St.Pis)、土壤桿菌NOS啟動(dòng)子(P畫(huà)AGRtu.扁，F(xiàn)raley等人，1983)、土壤桿菌左邊界(O-OTH,LB)、卡那霉素抗性基因(CR-OTH,Kan，美國(guó)專(zhuān)利6,255,560)和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)(Ec.ori.ColE)。在對(duì)pMON79706、pMON79700或pMON79653的氯霉素選擇(25pg/mL)和卡那霉素選擇(50|ig/mL)下，DNA構(gòu)建體在LibraryEfficiencyDB3.:T細(xì)胞(InvitrogenCorporation)中進(jìn)行擴(kuò)增。使用QIAGENPlasmid試劑盒(QIAGENInc.)從細(xì)菌培養(yǎng)物中純化載體DNA。使用放電顆粒加速基因轉(zhuǎn)運(yùn)裝置，如美國(guó)專(zhuān)利5，015，580中所述，^j尋pMON79700、pMON79706和pMON79653的DNA引入到玉米胚中。對(duì)于LH59預(yù)培養(yǎng)的未成熟胚的微粒轟擊而言，優(yōu)選使用35%至45%的最大電壓。微粒轟擊之后，玉米組織在黑暗中在27°C下培養(yǎng)。用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化方法和材料，例如，各種培養(yǎng)基和受體耙點(diǎn)細(xì)胞，未成熟胚的轉(zhuǎn)化和后續(xù)的可育的轉(zhuǎn)基因植物的再生，公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利6,194,636和6,232,526、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布20040216189中，在此引入作為參考。育和小植林的形成，由轉(zhuǎn)化的玉米細(xì)胞產(chǎn)生可育的轉(zhuǎn)基因玉米植物。當(dāng)它們長(zhǎng)到大約3英寸高并且生根的時(shí)候(轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基后大約4至6周)，將小植抹轉(zhuǎn)移到土壤中。植物在26。C的生長(zhǎng)室中放置2周，然后在溫室的噴霧臺(tái)(mistbench)上放置2周。然后將植物移植到5加侖的罐中，并在溫室中生長(zhǎng)成熟。使用玉米LH59近交系進(jìn)行交互授粉。收集玉米植物的種子，并用于蛋白質(zhì)分析和進(jìn)一步的培育活動(dòng)。實(shí)施例3使用AsnS多核苷酸序列的載體構(gòu)建和玉米轉(zhuǎn)化使用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增玉米AsnS2(SEQIDNO:3,pMON79706，圖1)。PCR的反應(yīng)條件依照廠商(PEAppliedBiosystems,FosterCity,CA)的方案進(jìn)行。在IXLAPCR緩沖液II(TakaraBioINC，Shiga,Japan)中使用各30nmol的正向(f)引物(SEQIDNO:32)和反向(r)引物(SEQIDNO:33)、各10微摩爾的dATP、dCTP、dGTP和TTP、2.5單位的TaKaRaLATaq擴(kuò)增根據(jù)上述制備的大約100ng玉米DNA。在94。C初始溫育1分鐘以后，以94。C45秒，然后60°C退火45秒，72。C1分15秒進(jìn)行35個(gè)PCR循環(huán)，然后是72°C7分鐘的1個(gè)循環(huán)。制備了5個(gè)AsnS2DNA構(gòu)建體。第一個(gè)玉米AsnS2構(gòu)建體的制備過(guò)程是如上所述通過(guò)PCR從pMON79706中分離1821個(gè)堿基對(duì)的AsnS2片段，然后使用XbaI和EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行限制性消化。將產(chǎn)生的AsnS2基因連接到也經(jīng)過(guò)Xbal和EcoRI消化的pMON61560中。使用Notl消化產(chǎn)生的穿梭載體(pMON66246),將與PPDK啟動(dòng)子和RGLUT1終止子可沖喿作地連接的包含AsnS2基因的插入物連接到也經(jīng)過(guò)Notl消化的pMON30167中。包含EPSPS基因的pMON30167質(zhì)粒允許用草甘膦選擇。產(chǎn)生的最終質(zhì)粒命名為pMON66230(圖3)。第二個(gè)AsnS2構(gòu)建體使用上述AsnS2(pMON79706)基因制備。該構(gòu)建體的制備過(guò)程是將Xbal/EcoRI消化的AsnS2基因插入到也經(jīng)過(guò)Xbal和EcoRI消化的pMON61562中，產(chǎn)生與NAS啟動(dòng)子和RGLUT1終止子可操作地連接的AsnS2基因。使用Notl消化產(chǎn)生的質(zhì)粒，并連4妄到經(jīng)Notl消化的pMON30167中。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pMON66229(圖2)。第三個(gè)AsnS2構(gòu)建體使用上述AsnS2基因(pMON79706)制備。通過(guò)使用Notl和Xbal限制性?xún)?nèi)切酶消化pMON78810分離得到在該28構(gòu)建體中使用的P-FDA啟動(dòng)子。然后將P-FDA啟動(dòng)子連接到預(yù)先經(jīng)過(guò)Notl和Xbal消化以去除其PPDK啟動(dòng)子的pMON66246中。使用Notl消化產(chǎn)生的質(zhì)粒，并連接到經(jīng)Notl消化的pMON30167中。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pMON66231(圖4)。第四個(gè)AsnS2構(gòu)建體使用上述AsnS2基因(pMON79706)制備。通過(guò)PCR從pMON74576產(chǎn)生在這個(gè)構(gòu)建體中使用的P-RTBV啟動(dòng)子。使用Notl和Xbal消化721bp的片段，并連接到預(yù)先經(jīng)過(guò)Notl和Xbal消化的pMON66246中。使用Notl消化產(chǎn)生的含有與P-RTBV啟動(dòng)子和RGLUT1終止子可操作地連接的AsnS2基因的質(zhì)粒，并連接到經(jīng)Notl消化的pMON30167中。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pMON66239(圖5)。第五個(gè)AsnS2構(gòu)建體使用上述AsnS2基因(pMON79706)制備。使得引物對(duì)ZmAS有義，5'TCCTAGACATGTCCGGCATACTTGCTG3'(SEQIDNO:46),和ZmAS反義，5TGCAGAATTCTATCCCTCGATGG;(SEQIDNO:47),從pMON66240中擴(kuò)增玉米AsnS2。PCR設(shè)置如下在總體積50|il的PCR反應(yīng)體系中，各1(il10mM的ZmAS有義和ZmAS反義引物，0.2-0.5|ag()pMON66240質(zhì)粒DNA,5(il10XAccuPrimeTmPfx反應(yīng)混合液，l^ilACCuPrimeTmPfxDNA聚合酶(Invitrogen)和41|il蒸餾水。使用下述循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)94°C1分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94°C15秒變性；58°C15秒退火和68°C4分鐘；然后進(jìn)行68°C10分鐘延伸。使用QIAGEN(QIAGENInc.)的PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。使用Ncol和EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶消化玉米AsnS2的PCR產(chǎn)物的等分試樣，使用AflIII和Ncol消化PCR產(chǎn)物的另一等分試樣。然后將Ncol和EcoRI片4史克隆到pMON94901的Ncol和EcoRI位點(diǎn)。將玉米AsnS2的AflIII和Ncol5，末端片段克隆到玉米AsnS2片段的Ncol和EcoRI的Ncol位點(diǎn)處。使用Notl消化得到的包含與e35S啟動(dòng)子和Hspl7終止子可操作地連接的玉米AsnS2的質(zhì)29粒(pMON74940),并連接到經(jīng)Notl消化的pMON53616中以構(gòu)建pMON74946。上述每種構(gòu)建體都包含一個(gè)用于表達(dá)草甘膦不敏感的II型EPSPS的表達(dá)盒，作為選擇轉(zhuǎn)基因事件的設(shè)置(美國(guó)專(zhuān)利5,633,435)。使用PEAppliedBiosystemsBigDyeterminatorv.3.0(PEAppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定每種構(gòu)建體的核酸序列，并確定克隆連接的完整性。pMON66229、pMON66230、pMON66231、pMON66239和pMON74946用于后續(xù)的玉米細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和從這些細(xì)胞再生成為完整的玉米植物。通過(guò)土^t裏桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將目的構(gòu)建體引入來(lái)自玉米系LH244的未成熟胚中，例如如美國(guó)7>布專(zhuān)利申請(qǐng)20050048624中所描述的那樣。實(shí)施例4玉米種子樣品的蛋白質(zhì)和氨基酸分析。該實(shí)施例描述了一種使用HPLC和近紅外線測(cè)量的蛋白質(zhì)和氨基酸分析方法，以選擇具有增加的天冬酰胺和蛋白質(zhì)的本發(fā)明的種子。對(duì)于種子蛋白質(zhì)分析而言，使用近紅外線透射光譜(Infratec1221型，Tecator，HoganasSweden);險(xiǎn)測(cè)每種處理由50-100個(gè)種子組成的小批量樣品。這種方法是基于觀察近紅外線輻射的吸收與典型的種子樣品中包含的化學(xué)組分的含量之間存在的線性關(guān)系。在分析未知樣品之前，收集校準(zhǔn)樣品的光譜數(shù)據(jù)，該校準(zhǔn)樣品隨后使用初步分析技術(shù)進(jìn)行分析。使用的初步分析:技術(shù)為氮?dú)馊紵?Murray和Williams,1987)。使用來(lái)自分光計(jì)的光讒數(shù)據(jù)和原始數(shù)據(jù)來(lái)建立多變量模型。在這個(gè)例子中，使用152個(gè)校準(zhǔn)樣品來(lái)構(gòu)建PLS-1(I型偏最小二乘法回歸)多變量模型。每種未知的樣品在分光計(jì)上掃描至少5次，每次掃描預(yù)測(cè)一次蛋白質(zhì)含量。每次掃描樣品后，都加回到樣品比色杯中，以準(zhǔn)確地表示測(cè)試樣品。對(duì)多次掃描預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)值取平均值，然后報(bào)告每種樣品的值。使用HPLC對(duì)玉米組織進(jìn)行游離氨基酸分析。對(duì)于每種樣品，使用1.5mL10%三氯乙酸在2mL微量離心管中提取20-50mg凍干的組織。通過(guò)輕輕地?fù)u動(dòng)在室溫下過(guò)夜提取樣品。通過(guò)離心澄清提取的樣品，移出上清液用于進(jìn)一步分析。在帶有熒光檢測(cè)器和裝備有ZorbaxEclipseAAAC18斗主(4.6x75mm,3.5孩i米，AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)和ZorbaxEclipseAAA分析保護(hù)柱(4.6x12.5mm,5微米)的96孔板自動(dòng)進(jìn)樣器的AgilentSeries1100HPLC上，通過(guò)HPLC進(jìn)行游離氨基酸分析。在臨分離之前，使用鄰苯二醛預(yù)衍生化樣品。使用40mM磷酸緩沖液pH7.6/曱醇/乙腈梯度解析游離氨基酸，然后在340nm/450nm(激發(fā)/發(fā)射)進(jìn)行熒光檢測(cè)。基于外部氨基酸標(biāo)準(zhǔn)來(lái)定量游離的氨基酸，使用ChemStation軟件(Agilent)進(jìn)行峰的積分。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差通常小于8%。實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因玉米植物中的天冬酰胺水平和谷粒蛋白質(zhì)含量的田間評(píng)估。該實(shí)施例描述了玉米AsnS構(gòu)建體(pMON79706和pMON92870)對(duì)轉(zhuǎn)化的玉米植物和種子中的天冬酰胺和蛋白質(zhì)水平的影響以及玉米AsnS構(gòu)建體(pMON79700和pMON79653)對(duì)谷粒蛋白質(zhì)含量的影響的田間評(píng)估結(jié)果。玉米組織中的游離天冬酰胺的相對(duì)濃度從由pMON79706或pMON92870轉(zhuǎn)化的R。玉米植物產(chǎn)生的近交系獲得。對(duì)于pMON79706，R。轉(zhuǎn)化體與親本近交體LH59回交，產(chǎn)生BC!種子。將轉(zhuǎn)基因分離的Bd種子種植在田間苗圃中，對(duì)每個(gè)植物是否存在NPTII標(biāo)記基因進(jìn)行打分。從轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性和轉(zhuǎn)基因陰性植物收集葉子組織用于游離氨基酸分析，對(duì)每種轉(zhuǎn)基因事件都進(jìn)行游離氨基酸分析。對(duì)于每種事件，將pMON79706轉(zhuǎn)基因植物葉子中的游離氨基酸與陰性等值線植物進(jìn)行比較，并使用JMP5.1軟件(SASInstitute,Cary,NC)通過(guò)Student'sT4全驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于pMON92870,R0轉(zhuǎn)化體與親本近交體LH244進(jìn)行回交以產(chǎn)生Bd種子。將Bd種子種植在田間苗圃中，并進(jìn)行自花授粉來(lái)產(chǎn)生BdSi種子，該BdSi種31子隨后種植在第二近交苗圃中。對(duì)NPTII標(biāo)記基因的存在進(jìn)行打分以后，確定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植物的每種轉(zhuǎn)基因事件。從轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的BdSi植物中收集葉子組織，在苗圃中以規(guī)律的間隔種植親本近交地。通過(guò)使用SAS9.1軟件進(jìn)行Student'sT檢驗(yàn)以進(jìn)行方差分析以及對(duì)比轉(zhuǎn)基因項(xiàng)和親本對(duì)照，來(lái)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析pMON92870葉子中的游離氨基酸。對(duì)于兩種構(gòu)建體的游離氨基酸分析，通過(guò)在開(kāi)花期取上端完全展開(kāi)的葉子、隨后在干冰上冷凍來(lái)收集葉子組織。葉子樣品進(jìn)行磨碎冷凍、凍干并通過(guò)HPLC測(cè)定其游離氨基酸含量。觀察到pMON79706和pMON92870的多轉(zhuǎn)基因事件，顯示其葉子中的天冬酰胺含量顯著增加(表2)。如根據(jù)0.05或更小的p值所示，；險(xiǎn)測(cè)的pMON79706的七種事件中的四種事件顯示葉子中的天冬酰胺含量顯著增加。在表達(dá)第二玉米天冬酰胺合成酶基因的pMON92870的轉(zhuǎn)基因事件中，五種事件中的四種事件顯示葉子中的天冬酰胺含量顯著增加(表2)。這些數(shù)據(jù)顯示，分別在pMON79706和pMON92870中在水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子下，玉米AsnS2和玉米AsnS3的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以導(dǎo)致游離天冬酰胺的特定增加，這與活性天冬酰胺合成酶的過(guò)表達(dá)是一致的。玉米種子中的蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度是從來(lái)自pMON79706或pMON92870轉(zhuǎn)化的RQ玉米植物的近交系獲得的。pMON79706的BC!轉(zhuǎn)基因植物(上述)自花授粉，產(chǎn)生的BdS!谷粒生長(zhǎng)至成熟，并通過(guò)單穗(singleears)測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。測(cè)定的蛋白質(zhì)表示為在0%濕度時(shí)干重量的百分比。對(duì)于每種事件，將pMON79706轉(zhuǎn)基因植物的谷粒蛋白質(zhì)與陰性等值線植物進(jìn)行對(duì)比，并使用SAS9.1軟件通過(guò)Student'sT檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于pMON98270,BdS^直物自花授粉，并生長(zhǎng)至成熟，通過(guò)單穗測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。通過(guò)進(jìn)行旁位置分析(by-locationanalysis)使用定制開(kāi)發(fā)的空間方法來(lái)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析pMON92870的谷粒蛋白質(zhì)。旁位置分析是一種兩步方法。該分析的第一步包括通過(guò)使用被系統(tǒng)地置于田間(每第六塊樣地)的所有的空間對(duì)照樣地來(lái)擬合各向異性球形半變量圖模型，來(lái)估計(jì)田間的空間自32相關(guān)。該分析的第二階段包括使用在分析的第一階段估計(jì)的空間自相關(guān)結(jié)構(gòu)，來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因項(xiàng)的空間變異性值。調(diào)節(jié)空間自相關(guān)之后，進(jìn)行平均值比較，其中，轉(zhuǎn)基因項(xiàng)的平均值與親本對(duì)照進(jìn)行比較，以檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因與對(duì)照平均值之間的差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。pMON79706和pMON92870的多種事件顯示近交谷粒蛋白質(zhì)含量的顯著增加(表3)。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的pMON79706的五種事件中的三種顯示谷粒蛋白質(zhì)含量顯著增加(p<0.05)，另兩種事件顯示傾向于顯著增加的趨勢(shì)(p<0.15)。兩種事件并沒(méi)有帶回統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所需的足夠數(shù)量的穗。pMON92870的四種轉(zhuǎn)基因事件中的三種顯示谷粒蛋白質(zhì)含量顯著增加(p<0.1),—種事件由于分析所需的穗的數(shù)目不足而沒(méi)有進(jìn)行檢測(cè)。這些數(shù)據(jù)確認(rèn)了pMON79706和pMON92870產(chǎn)生了除增加葉子的天冬酰胺含量以外還能夠提高玉米中的谷粒蛋白質(zhì)含量的轉(zhuǎn)基因事件。表2.用玉米AsnS2基因(pMON79706)或玉米AsnS3基因(pMON92870)轉(zhuǎn)化的近交玉米中的相對(duì)葉子天冬酰胺濃度。構(gòu)建體a事件代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植物的平均值b轉(zhuǎn)基因陰性植物的平均值差p值pMON79706ZMM50965BC,16.310.75.60.319ZMM50973BC,32.07.324.30.025ZMM50974BC,25.05.319.80.014ZMM50980BC,18.05.312.50細(xì)ZMM50984BC29.310.319.10.002ZMM50985BC,15.76.39.50.278ZMM51011BC,15.07.37.70.191ZMM10225222.50.022.5O.001ZMM103304BC,S,18.80.018.8O.00133<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>a在兩個(gè)分開(kāi)的實(shí)驗(yàn)中確定pMON79706和pMON92870的葉子天冬酰胺。b測(cè)定的相對(duì)游離天冬酰胺表示為葉子組織中總游離氨基酸的百分比。表3.用玉米AsnS2基因(pMON79706)或玉米AsnS3基因(pMON92870)轉(zhuǎn)化的近交玉米中的谷粒蛋白質(zhì)含量。_<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>a在兩個(gè)分開(kāi)的實(shí)驗(yàn)中確定pMON79706和pMON92870的谷粒蛋白質(zhì)。測(cè)定的谷粒蛋白質(zhì)表示為基于0%濕度的總谷粒組合物的百分比。cnd;未測(cè)定。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，高天冬酰胺和谷粒蛋白質(zhì)表型pMON79706在多個(gè)組織中得到證實(shí)。Bd代之后，pMON79706的五種事件在后續(xù)的兩個(gè)苗圃中自花授粉，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因純合的BdS3種子。通過(guò)對(duì)比純合BdS3植物和LH59玉米品種對(duì)照(表4)，在玉米V8生長(zhǎng)階段的研究中確定了pMON79706構(gòu)建體表達(dá)產(chǎn)生的天冬酰胺的相對(duì)濃度。以隨機(jī)化的完全區(qū)組設(shè)計(jì)種植轉(zhuǎn)基因項(xiàng)和對(duì)照，在田間樣地中具有5個(gè)重復(fù)的區(qū)域。將兩種植物的上部完全展開(kāi)的葉子和莖部分采樣、集中、置于干冰上、碾碎、凍干，并通過(guò)HPLC測(cè)定其游離氨基酸含量。后面標(biāo)有"*"的數(shù)值表示與LH59對(duì)照有顯著性差異(Dunnett's單尾檢驗(yàn)；(SAS9.1，Cary,NC))。在V8生長(zhǎng)階段和R！代進(jìn)行的天冬酰胺測(cè)定顯示五種pMON79706事件產(chǎn)生的植物的游離天冬酰胺顯著增加。與LH59品種對(duì)照的3.4%相比，V8葉子組織中的相對(duì)游離天冬酰胺水平增長(zhǎng)至可達(dá)13.9%;與對(duì)照的9.6相比，莖的天冬酰胺增長(zhǎng)至可達(dá)39%(表4)。對(duì)于谷粒蛋白質(zhì)分析，每塊地采樣IO個(gè)穗、去殼，并分析谷粒蛋白質(zhì)濃度。在pMON79706的五種事件中，谷粒蛋白質(zhì)也顯著增加(表4)。結(jié)果顯示作為總體趨勢(shì)，導(dǎo)致天冬酰胺顯著增加的事件也導(dǎo)致核仁蛋白質(zhì)的顯著增加(表2-4)。表4,用玉米AsnS2基因(pMON79706)轉(zhuǎn)化的BdS3玉米植物中，V8生長(zhǎng)階段的相對(duì)天冬酰胺濃度和成熟期的谷粒蛋白質(zhì)濃度。葉子莖谷粒Asn%Asn(ppm)Asn%Asn(ppm)蛋白質(zhì)％事件平均值平均值平均值平均值平均值LH59對(duì)照3.543899.6225412.3ZMM5097412.31*1312*32.20*9179*14.8*ZMM5098010.20*1058*38.68*12844*15"ZMM509849.18*997*28.20*8062*14.4*ZMM509855.86*69715.12*340414.5*ZMM5101113.89*1740*37.05*11820*15.0**p<0.05時(shí)具有顯著性對(duì)于在水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子下表達(dá)天冬酰胺合成酶基因的三種不同的構(gòu)建體，觀察到雜種谷粒蛋白質(zhì)的顯著增加。純合的近交玉米系是由pMON79706(玉米AsnS2)、pMON79700(大豆AsnS)和pMON79653(酵母AsnSl)的R。轉(zhuǎn)基因事件如下產(chǎn)生的首先將R0事件與回歸親本LH59進(jìn)行回交，然后在兩個(gè)后續(xù)的近交苗圃中對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性選擇進(jìn)行自花授粉，使用NPTII選擇性標(biāo)記來(lái)對(duì)接合性進(jìn)行打分。然后使用每種構(gòu)建體的純合事件作為雄性花粉供體與雌性近交系進(jìn)行雜交，以產(chǎn)生F!雜種。在多地點(diǎn)試驗(yàn)中種植F!雜種種子，分析每種構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因事件的最終谷粒蛋白質(zhì)，并在基于在田間以規(guī)律的間隔種植的對(duì)照雜種中谷粒蛋白質(zhì)的空間校正分析之后，與回歸親本雜種對(duì)照進(jìn)行對(duì)比。從每塊地中收獲谷粒、去殼，并分析其蛋白質(zhì)含量。通過(guò)進(jìn)行旁位置和交叉位置分析，使用定制開(kāi)發(fā)的空間方法來(lái)分析數(shù)據(jù)。旁位置分析為一種兩步方法。該分析的第一步包括通過(guò)使用被系統(tǒng)地置于田間(每第三塊樣地)的所有的空間對(duì)照樣地來(lái)擬合各向異性球形間半變量圖模型，來(lái)估計(jì)田間的空間自相關(guān)。該分析的第二階段包括使用在分析的第一階段估計(jì)的空間自相關(guān)結(jié)構(gòu)，來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因項(xiàng)的空間變異性值。在每個(gè)位置分別調(diào)節(jié)空間自相關(guān)之后，進(jìn)行交叉位置分析，其中，轉(zhuǎn)基因項(xiàng)的平均值與親本對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，以檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因與對(duì)照平均值之間的差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P=0.20)。pMON79706的所有五種事件在雜種試驗(yàn)中都顯示谷粒蛋白質(zhì)顯著增加，這與觀察到在這種構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因事件的近交系中谷粒蛋白質(zhì)顯著增加相一致(表5)。另外兩種天冬酰胺合成酶構(gòu)建體pMON79700(大豆AsnS)和pMON79653(酵母AsnS)也顯示出分別在五種事件中的兩種事件和兩種事件中的兩種事件中谷粒蛋白質(zhì)水平顯著增36加。表5.用來(lái)自玉米(Zea)、大豆(G7j;c/"e附"jc)和酵母(酉良酒酵母)的天冬酰胺合成酶基因轉(zhuǎn)化的雜種玉米中谷粒蛋白質(zhì)的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>a測(cè)定的谷粒蛋白質(zhì)顯示為基于0%濕度的總谷粒組合物的百分比。實(shí)施例6合成酶活性的田間評(píng)估證實(shí)了pMON79706和pMON92870的轉(zhuǎn)基因事件中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。對(duì)于pMON79706，用于在對(duì)BdS;純合近交系的田間試一驗(yàn)中確定葉子天冬酰胺含量的組織也同樣用于基于確定來(lái)自開(kāi)花期的pMON79706的3'終止子序列(St.Pis4)的表達(dá)確定轉(zhuǎn)基因表達(dá)。從五個(gè)重復(fù)塊地(近交對(duì)照為10個(gè))的每一個(gè)中收集兩種葉子樣品，集中，并在干冰上冷凍。然后冷凍研磨葉樣品用于表達(dá)分析。對(duì)于RNA提取，將50mg冷凍組織等分到96孔板中。使用包含ABI核酸裂解溶液(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)與IXPBSpH7.4(不含MgCl或CaCl)的1:1溶液的500pi裂解緩沖液提取每種樣品。使用濾板從粗裂解物中捕獲核酸，以從新鮮冷凍的組織中提取RNA,并使用50|ilABI洗脫緩沖液洗脫結(jié)合的RNA。使用5^RNA模板和5piABI—步RT-PCR試劑來(lái)進(jìn)行定量PCR。反應(yīng)在ABITaqman7900PCR儀器上進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為48°C30分鐘，95°CIO分鐘，95°C10秒，60°Cl分鐘。在40個(gè)循環(huán)中的每個(gè)循環(huán)中，對(duì)每個(gè)孔中的來(lái)自馬鈴薯蛋白酶抑制劑II(St.Pis4)的終止子序列和內(nèi)源對(duì)照(泛素)進(jìn)行熒光測(cè)量。在不存在反轉(zhuǎn)錄酶的情況下運(yùn)行一部分樣品，來(lái)監(jiān)測(cè)DNA的污染。通過(guò)從內(nèi)源對(duì)照的循環(huán)閾值中減去St.Pis4的循環(huán)閾值來(lái)對(duì)樣品的相對(duì)表達(dá)進(jìn)行打分。確定循環(huán)閾值(Ct),通過(guò)St.Pis4減去內(nèi)源對(duì)照值計(jì)算得到5Ct。通過(guò)計(jì)算內(nèi)源對(duì)照信號(hào)的平均值和設(shè)定St.Pis4信號(hào)值為40來(lái)產(chǎn)生原位野生型。從原位野生型的SCt減去未知樣品的SCt。最終數(shù)據(jù)報(bào)告為相對(duì)于野生型的pinll(St.Pis4)表達(dá)。定量RT-PCR分析證實(shí)了來(lái)自pMON79706的六種事件中的六種事件的轉(zhuǎn)基因的過(guò)表達(dá)(表6)。還在包含pMON92870的近交事件中證實(shí)了轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。確定處于開(kāi)花期的生長(zhǎng)在田間苗圃中的近交植物的葉子組織中的RNA表達(dá)，這是通過(guò)首先收集每個(gè)植物(每種事件4-8個(gè)植物)的上部展開(kāi)的葉子、并在干冰上冷凍實(shí)現(xiàn)的。預(yù)先基于NPTII標(biāo)記基因的存在確定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植物。在冷凍的同時(shí)碾碎葉子組織，并分析其來(lái)自pMON92870的3，終止子序列(St.Pis4)的表達(dá)。定量RT-PCR分析顯示與近交對(duì)照相比，包含pMON92870的六種事件中的五種事件顯示出增加的轉(zhuǎn)基因表達(dá)(圖7)。pMON92870事件ZM—M103316中的低RNA表達(dá)與該事件中的低的葉子天冬酰胺含量和谷粒蛋白質(zhì)含量一致。在pMON79706和pMON92870的轉(zhuǎn)基因事件中檢測(cè)天冬酰胺合成酶基因的表達(dá)對(duì)天冬酰胺合成酶活性的影響。將冷凍、碾碎的葉子38組織等分(200-400mg)到預(yù)冷卻的96深孔板的孔中。使用緩沖液A(100mMHepes誦OH,pH8.0,0.1mMEDTA，10mMMgCl2，2mM天冬氨酸，0.5mMDTT,67mM巰基乙醇，20%(v/v)甘油，0.1mMATP,1%(v/v)P9599(SigmaCompany),25mMKC1)提取蛋白質(zhì)。向每個(gè)孔中添加少量沙子。然后以4:l(緩沖液組織)向孔中的葉子組織添加緩沖液A。然后在振動(dòng)器中震蕩板2分鐘來(lái)混合樣品，然后在5000xg下離心10分鐘。在由緩沖液A平衡的96孔大旋板(SNSS025L，TheNestGroupInc.,Southboro,MA)中對(duì)上清液(100-200|al)進(jìn)行脫鹽處理。然后或者立即分析上清液，或者在液氮中冷凍上清液并保存在-80°C下直至使用。為了分析天冬酰胺合成酶的活性，將脫鹽的蛋白質(zhì)提取物(10-50pi)添加到包含100[il分析溶液(100mMHepes,pH8,0,10mMMgCl2，2mM天冬氨酸，5mMDTT,10mMATP,1mM氨基(氧)乙酸(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶抑制劑)，1mM天冬氨酸半醛(天冬酰胺酶抑制劑))的孔中。為了開(kāi)始反應(yīng)，向溶液中添加谷氨酰胺(標(biāo)準(zhǔn)分析的終濃度為2mM)，然后進(jìn)行混合。然后溫育分析混合液1至2小時(shí)。通過(guò)添加等體積的20%(w/v)三氯乙酸來(lái)終止反應(yīng)。然后過(guò)濾混合液來(lái)去除沉淀，并使用HPLC來(lái)測(cè)定天冬酰胺。用于HPLC的樣品的體積從0.5jil增加到2.5pi,激發(fā)波長(zhǎng)從340nm降低到235nm，熒光計(jì)的增益從10增加到13。這導(dǎo)致能夠檢測(cè)0.5至100(iM天冬酰胺的靈敏度，并允許以100s的微單位測(cè)定活性水平。對(duì)于pMON79706,用于確定葉子中天冬酰胺合成酶活性的組織來(lái)自使用在V7生長(zhǎng)階段收獲的BdS3純合近交系的田間試驗(yàn)。pMON79706的事件顯示出葉子中的天冬酰胺合成酶活性增加(表6)。相對(duì)于近交品種對(duì)照，天冬酰胺合成酶活性提高了最多5倍。還確定了在近交田間苗圃中處于開(kāi)花期的pMON92870的轉(zhuǎn)基因事件的天冬酰胺合成酶活性。五種pMON92870事件中的四種也顯示出增加的酶活性(表6)。在水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子下表達(dá)玉米AsnS2(pMON79706)或玉米AsnS3(pMON92870)的玉米植物中增加的天冬酰胺合成酶活性與這些構(gòu)建體中觀察到的基因表達(dá)的提高和葉子中天冬酰胺的增39加是一致的。表6.pMON79706和pMON92870的轉(zhuǎn)基因事件的近交系中的天冬酰胺合成酶活性a。構(gòu)建體事件AsnS活性(p單位/mg蛋白質(zhì))對(duì)照LH59276pMON79706ZMM50973519ZMM509741179ZMM509841592ZMM50985450ZMM510111031對(duì)照LH24498pMON92870ZMMl02252160ZMM103304209ZMM103315243ZMM10331611ZMM103319192ZMMl03320240apMON79706和pMON92870的酶活性通過(guò)兩種不同的田間實(shí)驗(yàn)確定。實(shí)施例7pMON66231、pMON66239和pMON74946對(duì)天冬酰胺和谷粒蛋白質(zhì)含量的影響的田間評(píng)估玉米組織中游離天冬酰胺的相對(duì)含量是從來(lái)自用pMON66231轉(zhuǎn)化的Ro玉米植物(LH244背景)的雜種系獲得的(圖4)，其中，玉米AsnS2由玉米FDA啟動(dòng)子控制。雜種是通過(guò)雜交R。植物與雄性近交系LH59得到的，這產(chǎn)生了分離的(1:1)Fi種群。將產(chǎn)生的Fi種子種植在中西部的三個(gè)位置中，每個(gè)位置重復(fù)兩次。在V3生長(zhǎng)階段使用草甘膦噴灑樣地以去除無(wú)效的分離體。雜種對(duì)照種植在周邊，與雜種對(duì)照進(jìn)行比較。在開(kāi)花期，在日落兩小時(shí)后，從所有的三個(gè)位置，從每塊樣地內(nèi)的三種植物上收集和集中上端葉子。葉子立即置于干冰中，然后在-80。C下儲(chǔ)存直至加工。冷凍研磨葉子，凍干一部分用于通過(guò)HPLC進(jìn)行游離氨基酸分析。首先使用Bonferroni調(diào)節(jié)的p值通過(guò)用于刪除的學(xué)生化(studentized)殘差的兩通方法(two-passmethod)對(duì)離群值(outlier)篩選數(shù)據(jù)。在開(kāi)始方差計(jì)算的分析之前，確定離群值，并從數(shù)據(jù)組中去除。根據(jù)交叉位置隨機(jī)化的完全區(qū)組設(shè)計(jì)來(lái)分析數(shù)據(jù)。構(gòu)建體-事件的組合用固定效果建模，位置和位置內(nèi)的重復(fù)(reps)用隨機(jī)效果建模。通過(guò)對(duì)構(gòu)建體-事件的組合的最小均方進(jìn)行比較，進(jìn)行處理對(duì)比。在pMON66231的12種事件中的11種中，相對(duì)葉子天冬酰胺顯著增加，與對(duì)照的3%相比，天冬酰胺水平高達(dá)16%(表7)。每塊樣地收獲10個(gè)穗，然后去殼和集中每塊樣地的種子，然后在測(cè)定谷粒蛋白質(zhì)的含量，從而測(cè)定了成熟的谷粒蛋白質(zhì)。相對(duì)于LH244/LH59雜種對(duì)照，發(fā)現(xiàn)在成熟的谷粒中12種事件中的九種事件顯著增加了蛋白質(zhì)含量。表7.pMON66231轉(zhuǎn)基因事件中的相對(duì)葉子天冬酰胺和成熟谷粒蛋白質(zhì)含量。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>ZMSI2229116.25<扁9.830據(jù)ZMSI223036.440.1268.530.71a測(cè)定的相對(duì)游離天冬酰胺表示為葉子組織中總游離氨基酸的百分比。b與雜種對(duì)照相比玉米組織中的相對(duì)游離天冬酰胺含量是從來(lái)自用pMON66239和pMON74946轉(zhuǎn)化的RQ玉米植物(LH244背景)的雜交系得到的，其中，玉米AsnS2分別在RTBV或e35S啟動(dòng)子的控制下。雜種是通過(guò)雜交Ro植物與雄性近交系LH59得到的，這產(chǎn)生了分離的(l:1)F!種群。將產(chǎn)生的Fi種子種植在夏威夷的一個(gè)位置，每種轉(zhuǎn)基因事件重復(fù)三次。在V3生長(zhǎng)階段使用草甘膦噴灑樣地以去除無(wú)效的分離體。包括缺乏玉米AsnS2基因的雜種對(duì)照用于比較。在開(kāi)花期，在日落兩小時(shí)后，從每塊樣地內(nèi)的三種植物中收集和集中上端葉子。葉子立即置于干冰上，然后在-80。C下儲(chǔ)存直至加工。冷凍研磨葉子，凍干一部分用于通過(guò)HPLC進(jìn)行游離氨基酸分析。首先使用Bonferroni調(diào)節(jié)的p值通過(guò)用于刪除的學(xué)生化(studentized)殘差的兩通方法(two-passmethod)對(duì)離群值(outlier)篩選數(shù)據(jù)。在開(kāi)始方差計(jì)算的分析之前，確定離群值，并從數(shù)據(jù)組中去除。根據(jù)交叉位置隨機(jī)化的完全區(qū)組設(shè)計(jì)來(lái)分析數(shù)據(jù)。構(gòu)建體-事件的組合用固定效果建模，重復(fù)(reps)用隨機(jī)效果建模。通過(guò)對(duì)構(gòu)建體-事件的組合的最小均方進(jìn)行比較，進(jìn)行處理對(duì)比。在pMON74946的13種事件中的10種中，相對(duì)葉子天冬酰胺顯著增加，與對(duì)照的2%相比，天冬酰胺水平高達(dá)16%(表8)。每塊樣地收獲所有穗，然后去殼和集中每塊樣地的種子，然后在測(cè)定谷粒蛋白質(zhì)的含量并對(duì)葉子天冬酰胺性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從而測(cè)定了成熟的谷粒蛋白質(zhì)。相對(duì)于雜種對(duì)照，發(fā)現(xiàn)13種事件中的10種事件在成熟的谷粒中具有顯著增加的蛋白質(zhì)含量，葉子天冬酰胺增加的這10種事件還顯示在雜交試驗(yàn)中蛋白質(zhì)也增加。對(duì)于pMON66239的轉(zhuǎn)基因事件，在0.05a水平時(shí)，15種事件中的4211種顯示葉子天冬酰胺含量增加，15種事件中的3種顯示谷粒蛋白質(zhì)顯著增加，盡管另外的五種轉(zhuǎn)基因事件在p<0.15時(shí)顯示蛋白質(zhì)增加，提示在RTBV啟動(dòng)子(pMON66239)下玉米AsnS2的表達(dá)能夠增加葉子天冬酰胺含量和核仁蛋白質(zhì)含量，但是增加的程度低于在e35S啟動(dòng)子(pMON74946)下的表達(dá)(表8)。表8.pMON74946和pMON66239轉(zhuǎn)基因事件中的相對(duì)葉子天冬<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>a測(cè)定的相對(duì)游離天冬酰胺表示為葉子組織中總游離氨基酸的百分比b與雜種對(duì)照相比實(shí)施例8AsnSl、AsnS2、AsnS3和AsnS4同工型的細(xì)菌表達(dá)載體、純化以及動(dòng)力學(xué)該實(shí)施例描述了將AsnSl(SEQIDNO:1)、AsnS2(SEQIDNO:3)、AsnS3(SEQIDNO:5)和AsnS4(SEQIDNO:50)的核苷酸序列克隆到大腸桿菌表達(dá)載體中，以及這四種AsnS同工型的重組形式的表達(dá)、純化和動(dòng)力學(xué)。使用公開(kāi)的玉米基因序列(Chevalier等人,1996;gi984262))進(jìn)行生物信息學(xué)才企索，在專(zhuān)有內(nèi)部cDNA集合中確定了四種全長(zhǎng)cDNA序列，確定它們與公開(kāi)的AsnS基因具有顯著的序列相似性。與公開(kāi)的AsnS序列具有序列同一性的兩種全長(zhǎng)cDNA命名為Zm-y^"57和Zw^^"S丄其它兩種基因分別命名為和Zm^s"5V(SEQIDNO:50)。Zm-AwW、Zm-A^S2和Zm-A^S3序列向植物表達(dá)載體中的克隆已在上述實(shí)施例2和3中有所描述。如下所述將這三種基因和Z/77^^"^W克隆到細(xì)菌表達(dá)載體中Zm-AwW、Zm-JwS3和的全長(zhǎng)編碼序列分別從專(zhuān)有內(nèi)部cDNA集合中的cDNA克隆700151670—FLI、LIB5399-001-A2和LibLIB3732-039-F9—FLI通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增得到。編碼Zm-Aw67的PCR擴(kuò)增片^I殳的正向和反向引物序列為Zm-AsnSl一forl5，畫(huà)ggaattccatATGTGTGGCATCTTAGC曙3，(SEQIDNO:52)和Zm-AsnSl—revl5'-ataagaatgcggccgcGACCGCGATCGCGACTGCGACA曙3，(SEQIDNO:53)用于Zm-y^"5"3PCR擴(kuò)增的正向和反向引物序列為Zm-AsnS3—for25，-ctagctagctagATGTGCGGCATCCTC-3，(SEQIDNO:54)和Zm-AsnS3—rev25，-ccgctcgagGACAGCTGTGGCTGAAGCAACG-3'(SEQIDNO:55)編碼全長(zhǎng)AmW的PCR擴(kuò)增片段(SEQIDNO:50)是通過(guò)下述引物對(duì)得到的Zm-AsnS4for35，-gggaattccatATGTGTGGCATCTTAGC-3'(SEQIDNO:56)和Zm-AsnS4—rev35'-ataagaatgcggccgcCACCGCGATCGCGACAGCGA-3'(SEQIDNO:57)Zw-AwS2的全長(zhǎng)編碼序列是從pMON79706(圖1;SEQIDNO:3)通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增的。用于Zm-A^S7PCR擴(kuò)增的引物序列為Zm-AsnS2for45'-tatgtgcggcatacttgctgtgctcgggt-3'(SEQIDNO:58)和Zm-AsnS2—rev45'-gctatccctcgatggcaacgccagat-3'(SEQIDNO:59)PCR在總體積50pi中進(jìn)行，使用ExpancT高保真度PCR試劑盒(BoehringerMannheim，德國(guó))。使用PTC-200Peltier熱循環(huán)儀(MJResearchInc.,Watertown,Massachusetts)在下述條件下進(jìn)行反應(yīng)起始溫育95°C5分鐘27個(gè)下述循環(huán)4595°C1分鐘56。C退火1分鐘然后進(jìn)行72°C延伸2分鐘72。C溫育10分鐘。將產(chǎn)生的PCR片段亞克隆到pET30a(+)或pET21d(+)(Novagen,SanDiego，CA)之一中，得到質(zhì)粒pET30a-Zw畫(huà)^5"67、pET30a-Zm^s"57、pET30a-Zm-^s"S3和pET21d-Zm-^s"S4。通過(guò)DNA序列分析確定質(zhì)粒序列。這些載體預(yù)期能夠產(chǎn)生帶有C末端組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白質(zhì)。使用上一段中描述的大腸桿菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Rosetta0￡5'"大腸桿菌細(xì)胞(Novagen)。從固體LB培養(yǎng)基平板中轉(zhuǎn)移出轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并在包含標(biāo)準(zhǔn)濃度的卡那霉素(50pM)和氯霉素(25(iM)的液體LB培養(yǎng)基中在37°C下生長(zhǎng)。過(guò)夜培養(yǎng)液用于接種25mL培養(yǎng)液，其在37。C下生長(zhǎng)直到對(duì)數(shù)中期(OD,-0.4-0.6)。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到20°C30分鐘，之后添加IPTG至終濃度為0.5mM。然后細(xì)胞在20。C下生長(zhǎng)12小時(shí)，通過(guò)離心收集細(xì)月包沉淀物。蛋白質(zhì)從不溶性的部分中回收，同時(shí)與鎳柱結(jié)合。用于純化重組AsnS的緩沖液為緩沖液A:100mMHepes-OH,pH=7.6,0.1mMEDTA,10mMMgCl2,2mM天冬氨酸，0.5mMDTT,20%(v/v)甘油，0.1mMATP,1%(v/v)蛋白酶抑制劑混合物(Sigma產(chǎn)品號(hào)P9599),25mMKC1。緩沖液B:(緩沖液A+6M鹽酸胍)緩沖液C:(緩沖液A十6M尿素)緩沖液D:(緩沖液A+4M尿素)緩沖液E:(緩沖液A+2M尿素)緩沖液F:(緩沖液八+1M尿素)緩沖液G:(緩沖液A+500mM咪唑)除非特別說(shuō)明，所有的純化步驟都在4。C下進(jìn)行。將大腸桿菌沉淀物溶于緩沖液A，以16,000PSI通過(guò)弗氏細(xì)胞壓碎器3次。然后在75,000xg下離心樣品至少l小時(shí)。在液氮中冷凍沉淀物(包涵體)，然后在-80。C下儲(chǔ)存直到使用。對(duì)純化過(guò)程中已經(jīng)在鎳柱上重折疊的含有his標(biāo)簽的植物AsnS形式進(jìn)行植物AsnS酶的所有常規(guī)動(dòng)力學(xué)測(cè)量。如上所述在200mLLB培養(yǎng)基中表達(dá)AsnS形式之一的細(xì)菌產(chǎn)生的大腸桿菌沉淀物作為起始物使用。使用PiercePro-MatrixTM蛋白質(zhì)重折疊指導(dǎo)(ThermoFisherScientific,Rockford,IL,產(chǎn)品號(hào)89867;附錄A)中描述的方法分離包涵體，然后使用PiercePro-MatrixTM蛋白質(zhì)重折疊指導(dǎo)(產(chǎn)品號(hào)89867;附錄B)方案進(jìn)行溶解，唯一不同的是使用緩沖液B代替6-8MGdnHCl:50mMTris。然后將溶解的樣品以1mL/min的流速加樣到使用緩沖液B預(yù)平衡的3-5mL鎳NTA瓊脂糖(Qiagen)柱上。然后以1mL/min的流速使用至少兩倍柱床體積的緩沖液B、C、D和E和F連續(xù)洗滌柱子。然后使用緩沖液A洗滌柱子直到柱子洗脫液的OD28Q小于0.05。整個(gè)洗滌過(guò)程在1-2小時(shí)內(nèi)完成。然后使用緩沖液G以1mL/min的流速洗脫蛋白質(zhì)。收集2mL組分，并合并具有最高蛋白質(zhì)量的三個(gè)組分，在液氮中冷凍并儲(chǔ)存在-80。C下直到如實(shí)施例6所述進(jìn)行分析為止。滴定每種底物(ATP、谷氨酰胺、NH/和天冬氨酸)的水平來(lái)確定各自的KmandV咖x值。對(duì)于每種底物和一些酶，測(cè)量的動(dòng)力學(xué)參數(shù)為Km(Asp)、Km(Gln)、Km(NH/)和Vmax。結(jié)果報(bào)告于表9中。所有四種基因都編碼能夠產(chǎn)生具有AsnS活性的多肽的序列。AsnSl、AsnS2和AsnS3看起來(lái)在動(dòng)力學(xué)上是顯著不同的，因?yàn)锳snS2的Km(Gin)比其它酶低幾倍；AsnSl的V腸x比其它酶低幾倍。表9.玉米天冬酰胺合成酶的動(dòng)力學(xué)對(duì)比K，(Gln)Km(Asp)KATP)Km(NH/)Hu/mg47ZmAsnSl1705439801109900ZmAsnS2850110910125750ZmAsnS33504231200978400ZmAsnS43102339301289000jj^jjc所有的出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖艘胱鳛閰⒖?，就好像每個(gè)出版物或?qū)＠暾?qǐng)都被特定地和單獨(dú)地引入作為參考。參考文獻(xiàn)本文特別引入以下文獻(xiàn)作為參考，其提供補(bǔ)充本文所述信息的示例性的程序上的或其它方面的細(xì)節(jié)美國(guó)專(zhuān)利4，761,373美國(guó)專(zhuān)利4,957,748美國(guó)專(zhuān)利5,100，679美國(guó)專(zhuān)利5,219,596美國(guó)專(zhuān)利5,322,783美國(guó)專(zhuān)利5,322,938美國(guó)專(zhuān)利5,538，880美國(guó)專(zhuān)利5,550,318美國(guó)專(zhuān)利5,563,055美國(guó)專(zhuān)利5,610,042美國(guó)專(zhuān)利5,633,435美國(guó)專(zhuān)利5,936,069美國(guó)專(zhuān)利6,005，076美國(guó)專(zhuān)利6,146,669美國(guó)專(zhuān)利6,156,227美國(guó)專(zhuān)利6,194,636美國(guó)專(zhuān)利6,232，526美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布20040216189A148美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布20050048624A1Alba,尸/a"http://.,39(5):681-808,2004.Allard,/"../V/""》/ao/尸/a"JSree在"g,2ndEd.,JohnWiley&Sons,ISBN:0471023094,1999.Altschul等人，M^/ez'c爿c^feie&，25:3389-3402,1997.Aslanidis和deJong,臉由c爿c^L,18(20):6069-6074,1990.Ausubel等入,eds.Cwrrew/Prc^oco/sMo/ecw/arS/o/og"少，JohnWiley&Sons,NewYork,1989.Bevan,油c/dc爿c油紐，12:8711-8721,1984.Chu等人，6Vm'ca,18:659，1975.Dellaporta等人,戶(hù)/aw^Mo/ecw/ariepoWer，1:19-21，1983.D'Halluin等人，所o/rec/mo/og乂10:309-314,1992.Fraley等人.，尸亂淑/.Jem/.Sc/.,,80:4803-4807,1983.Haymes等人，M/c/e/cJczW//3^n,(i/za"ow,j/Vac"'ca/^4萍raac/，IRLPress,Washington,DC，1985.Hayward,P/冊(cè)/Breed/wgv尸n'wc^o/es朋dPms"/ec&,Vol.1,Chapman&Hall，ISBN:0412433907，1993.Henikoff和Henikoff,尸亂淑/.爿c^/.aSJ,89:10915-10919,1992.Herrera-Estrella等人，淑訓(xùn),303:209,1983.Hinchee等人，所o/rec/mo/ogy,6:915-922，1988.Jones和Shenk，Cell,13:181-188,1978.Jones等人，A/o/.Ge".210(1):1-4,1987.Klee等人，B/o-rec/mo/ogj，3(7):637-642,1985.Lewin,In:GenesV,OxfordUniversityPress,NY,1994.Matsuoka等人，Proc.Wa"JcaJ.Sc/.90:9586-9590，1993.Murashige和Skoog,尸一o/尸/<15:473-497,1962.Murray和Williams,CAem/ca/尸r/"一/wo//"/rarec//"t/i/Wn'M，WilliamsandK.Norris(Eds")，1987.PCT申請(qǐng)WO95/06128Reynaerts等人，5^/ec勵(lì)/e5"cree""Z/eM"nters,GelvinandSchilperoort(Eds.),PlantMolecularBiologyManual,Kluwer，Dordrecht,1988.Richards,尸/a^5ree&"g5ys^ems,StanleyThornesPubLtd;2ndEd"ISBN:0412574500，1997.Rieger等人，G7o^"7q/"C7a，'ca/aw<iMo/ecw/ar,5thedition,Springer-Verlag:NewYork,1991.Sambrook等人,Mo/ecw/arC7o打f打g,ALaboratoryManual,2ndEd.,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor，NewYork,2001.Stalker等人，J.肌o/CAe肌，263:6310-6314，1988.Thillet等人，/.腸/.C&m.,263:12500-12508,1988.50權(quán)利要求1.一種分離的核酸序列，選自(a)包含序列SEQIDNO50的核酸序列；(b)與序列SEQIDNO50至少大約90％序列相同的核酸序列，其中，該核酸序列編碼具有天冬酰胺合成酶活性的多肽；(c)編碼多肽序列SEQIDNO51的核酸序列；(d)編碼與多肽序列SEQIDNO51至少大約90％序列相同的多肽的核酸序列，其中，該多肽具有天冬酰胺合成酶活性；和(e)在大約0.2xSSC和65℃的高嚴(yán)格性條件下與(a)-(d)的序列雜交的核酸序列，其中，該核酸序列編碼具有天冬酰胺合成酶活性的多肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，進(jìn)一步限定為與異源調(diào)節(jié)元件可操作地連接。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，進(jìn)一步限定為與在植物中具有功能性的異源啟動(dòng)子可操作地連接。4.一種用權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。5.—種用權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或其部分。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)一步限定為一種玉米植7.—種包含權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列的轉(zhuǎn)基因種子。8.—種具有增加的天冬酰胺和/或蛋白質(zhì)含量的轉(zhuǎn)基因玉米種子，在其基因組中包含DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼與異源啟動(dòng)子可操作地連接的AsnS4天冬酰胺合成酶多肽的多核苷酸，其中，相對(duì)于與轉(zhuǎn)基因玉米種子品種相同、但其基因組中不含所述DNA構(gòu)建體的種子的蛋白質(zhì)水平而言，所述種子具有增加的天冬酰胺和/或蛋白質(zhì)含量。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因玉米種子，其中所述編碼天冬酰胺合成酶多肽的多核苷酸包含權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因玉米種子，其中，所述天冬酰胺合成酶多肽包含SEQIDNO:51。11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因玉米種子，其中，所述多核苷酸包含核酸序列SEQIDNO:50。12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因玉米種子，其中，所述啟動(dòng)子是水稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子。13.—種產(chǎn)生具有增加的天冬酰胺的轉(zhuǎn)基因玉米植物的方法，包括(a)向玉米植物中引入異源DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含與編碼天冬酰胺合成酶多肽的DNA分子可操作地連接的、在玉米細(xì)胞中具有功能性的啟動(dòng)子分子；(b)使該植物生長(zhǎng)至成熟；和(c)從該植物中收獲種子。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述編碼異源天冬酰胺合成酶的多核苷酸包含權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述天冬酰胺合成酶多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:51。16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述DNA分子包含核酸序列SEQIDNO:50。17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，進(jìn)一步包括步驟(f)選擇具有增加的蛋白質(zhì)的種子。18.用權(quán)利要求6所述的植物制成的玉米粉，其中，該玉米粉包含權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的玉米粉，其中，所述核酸序列包含序列SEQIDNO:50。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的玉米粉，其中，所述核酸序列編碼多肽SEQIDNO:51。21.—種生產(chǎn)食物或飼料的方法，包括獲得權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因植物以及用該植物或其部分生產(chǎn)食物或飼料。22.通過(guò)權(quán)利要求21所述的方法生產(chǎn)的食物或飼料，其中，該食物或飼料包含權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列。全文摘要本發(fā)明涉及具有提高的蛋白質(zhì)和氨基酸水平的玉米植物和種子。本發(fā)明還涉及提供在轉(zhuǎn)基因玉米細(xì)胞中表達(dá)天冬酰胺合成酶的DNA構(gòu)建體。該DNA構(gòu)建體在一種方法中使用，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米植物和種子，以及選擇具有提高的蛋白質(zhì)和氨基酸水平的植物和種子。文檔編號(hào)C12N9/00GK101663393SQ200880012489公開(kāi)日2010年3月3日申請(qǐng)日期2008年4月18日優(yōu)先權(quán)日2007年4月19日發(fā)明者B·J·法布里,J·克勞利,S·M·達(dá)夫,S·安德森,S·斯克瑞恩,邱伯行,齊群剛申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)公司