專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種提取豬血抗菌肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種提取抗菌肽的方法，特別是關(guān)于一種提取豬血抗菌肽的方法。技術(shù)背景目前，由于抗生素的大量濫用，傳統(tǒng)抗生素耐藥性的問(wèn)題越來(lái)越引起人們的關(guān)注，尋求一種無(wú)殘留、無(wú)耐藥性的新型抗菌藥物已成為當(dāng)務(wù)之急?？咕囊?yàn)槠涓咝У囊志Ч蛷V泛而穩(wěn)定的生物活性，逐漸引起人們的興趣和關(guān)注?？咕木哂袕V譜、高效的抗微生物活性，還能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，誘導(dǎo)動(dòng)物的獲得性免疫。而且其獨(dú)特的抗菌機(jī)理不會(huì)使微生物產(chǎn)生耐藥性，在機(jī)體內(nèi)無(wú)殘留，具有良好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景，抗菌肽的應(yīng)用可能會(huì)帶來(lái)一場(chǎng)抗微生物戰(zhàn)略的新革命。我國(guó)是養(yǎng)豬業(yè)大國(guó)，豬血是生豬屠宰加工的廢棄物，如何使該廢棄物產(chǎn)生高值化的利用，具有廢棄物加工利用和公共衛(wèi)生等多方面的重要意義。有關(guān)研究確認(rèn)，豬血中具有較強(qiáng)抗菌活性的多肽，因此開(kāi)發(fā)研究一種從豬血中提取、純化抗菌肽的成熟方法，可以一舉多得。而目前在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有從豬血中提取抗菌肽的技術(shù)方法和產(chǎn)品。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種提取豬血抗菌肽的方法。本發(fā)明提取豬血抗菌肽的方法，包括以下步驟1)將豬血粉溶入緩沖液中，然后在混合液中加入木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，調(diào)整酶解液的pH為3.54.5;2)將氯仿和亞硫酸氫鈉加入到所述酶解液中進(jìn)行脫色，然后調(diào)整脫色后酶解液的pH值至6.07.0，成為豬血抗菌肽的粗提物。對(duì)所述粗提物進(jìn)行以下純化步驟，可得到純化的豬血抗菌肽精制品1)冷凍干燥所述豬血抗菌肽的粗提物，并將所述粗提物過(guò)凝膠型陽(yáng)離子交換柱，對(duì)交換柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；2)對(duì)所述洗脫液進(jìn)行真空冷凍干燥，成為豬血抗菌肽。在上述過(guò)程中，緩沖液可以是pH-7.0、濃度為0.05mmol/L的磷酸氫二鈉一檸檬酸混合液。豬血粉與所述木瓜蛋白酶的重量份數(shù)之比為100:13。酶解的溫度為65—75"C，酶解的時(shí)間為810h。脫色過(guò)程中，所述氯仿與所述酶解液體積份數(shù)之比為23:5;亞硫酸氫鈉的終質(zhì)量百分濃度為0.5%1.0%。冷凍干燥豬血抗菌肽粗提物的溫度一般為-50-60°C，冷凍時(shí)間為24h48h。凝膠型陽(yáng)離子交換柱可選擇S印hadexG100凝膠柱；洗脫液可以為0.2mol/L的乙酸銨，洗脫的速度為10.0mL/cm2.h;對(duì)洗脫液進(jìn)行真空冷凍干燥的溫度一般為-50-60°C，冷凍干燥的時(shí)間為24h48h。本發(fā)明的原料豬血粉可以在市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)普通的豬血粉成品，也可以自行用以下方法進(jìn)行制備，制備的方法包括以下步驟1)對(duì)新鮮豬血進(jìn)行抗凝處理；2)對(duì)所述豬血進(jìn)行過(guò)濾，去除其中的纖維物質(zhì)；3)再對(duì)濾下物進(jìn)行反復(fù)凍融，冷凍干燥，制成豬血粉。本發(fā)明研究了豬血中的低分子肽類(lèi)物質(zhì)的分離純化技術(shù)，并對(duì)分離純化的肽類(lèi)物質(zhì)的生物學(xué)活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明豬血中多種肽類(lèi)物質(zhì)對(duì)白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌等常見(jiàn)的致病菌有明顯的抑制作用；豬血多肽還對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、雞新城疫病毒(NDV)和雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)均有顯著的滅活作用。更有意義的是，本發(fā)明分離到的多肽可提高機(jī)體非特異性免疫功能、雞特異性免疫血清抗體水平和腸道黏膜免疫功能，并且能提高雛雞日增重、降低料重比，促進(jìn)雞胚和雛雞的生長(zhǎng)發(fā)育。研究結(jié)果表明本發(fā)明方法生產(chǎn)的豬血抗菌肽是一種新型的綠色抗微生物制劑和免疫調(diào)節(jié)劑，可廣泛用于生豬屠宰廠(chǎng)等畜牧生產(chǎn)企業(yè)、飼料生產(chǎn)或飼料添加劑生產(chǎn)企業(yè)。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了從豬血中提取具有較強(qiáng)抗菌活性的多肽物質(zhì)，為生產(chǎn)抗菌肽提供了一個(gè)新的途徑和方法。2、采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的抗菌肽，屬于天然提取物，具有天然、無(wú)毒、無(wú)污染、無(wú)殘留、無(wú)副作用、高效抗菌等特點(diǎn)，是一種新型的綠色抗微生物藥物。3、采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的抗菌肽，具有廣譜抗菌、抗病毒、不產(chǎn)生耐藥性、有免疫調(diào)節(jié)作用等功能。4、本發(fā)明方法操作方便，所需設(shè)備簡(jiǎn)單，分離提取率高。5、實(shí)施本發(fā)明方法的原料豬血來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，可以滿(mǎn)足大規(guī)模深化加工的需要，具有很強(qiáng)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用推廣價(jià)值。原料豬血屬于生豬屠宰加工的廢棄物，本發(fā)明方法可使廢棄物得到高值化的利用，因此本發(fā)明具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。圖1是豬血抗菌肽粗提物經(jīng)S印hadexG100凝膠柱的層析曲線(xiàn)圖圖2是豬血抗菌肽洗脫液對(duì)雞多殺性巴氏桿菌的抗菌實(shí)驗(yàn)效果圖具體實(shí)施方式實(shí)施例1、從豬血中提取豬血抗菌肽1、從屠宰場(chǎng)收集1L新鮮豬血，然后，按6g/L血液的用量迅速加入檸檬酸三鈉抗凝，然后用紗布過(guò)濾，去除其中的纖維物質(zhì)，對(duì)濾下物進(jìn)行反復(fù)凍融得溶血液(在-2(TC和4。C之間凍融1一3次)，冷凍干燥，制成豬血粉。此步驟的目的是破碎豬血細(xì)胞，釋放血紅蛋白。豬血粉也可以采用市售的成品豬血粉。2、將2g豬血粉溶入200ml的pH為7.0、濃度為0.05mmol/L的磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖液(呂世明，譚艾娟。木瓜蛋白酶對(duì)豬血粉蛋白的水解作用。貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，29(4):67)中，然后在混合液中加入20mg的木瓜蛋白酶(血粉酶=100:1100:3即可)，在70°C(65—75。C均可)條件下進(jìn)行酶解810h。然后用6mol/LHC1調(diào)整酶解液的pH為3.54.5，以消滅殘留的活性酶。3、向酶解液中加入2/53/5酶解液體積的氯仿和終濃度為0.5%1.0%的亞硫酸氫鈉，406(TC條件下水浴30rain，進(jìn)行脫色、分液，取上清液。將該脫色過(guò)程重復(fù)3次，至上清液脫為無(wú)色。4、滴加1raol/LNaOH，將脫色后的酶解液調(diào)整其pH值至6.07.0，成為豬血抗菌肽的粗提物。5、采用真空冷凍干燥機(jī)，將豬血抗菌肽的粗提物進(jìn)行常規(guī)真空冷凍、干燥(冷凍溫度為-50-6(TC，干燥時(shí)間為2448h)，制成豬血抗菌肽粗提物干粉。然后取5g粗提物干粉置于S印hadexG-100凝膠離子交換柱中，用0.2mol/L的乙酸銨洗脫液對(duì)粗提物進(jìn)行洗脫分離，流速為10.0mL/cm2.h，收集約40mL洗脫液。如圖1所示，豬血提取物經(jīng)S印hadexG100凝膠柱層析后出現(xiàn)1個(gè)洗脫峰。將各收集管的組分取20uL進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。6、收集洗脫液的同時(shí)，經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀，采用瓊脂糖彌散方法對(duì)收集的洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)收集液對(duì)雞多殺性巴氏桿菌的抗菌作用。結(jié)果顯示，從第13管即有抑菌圈出現(xiàn)，至第23管抑菌圈消失，最大抑菌圈出現(xiàn)在第17—21管。(圖2所示為第l-18管的情況)。合并具有抑菌作用的洗脫液，在-2(TC進(jìn)行真空冷凍干燥，成為豬血抗菌肽。在-20。C條件下對(duì)豬血抗菌肽保存。實(shí)施例2、豬血抗菌肽抗菌、抗病毒的試驗(yàn)1、豬血抗菌肽的抗菌活性實(shí)驗(yàn)采用瓊脂糖彌散法，對(duì)實(shí)施例1從豬血中提取的豬血抗菌肽進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)。供試細(xì)菌有雞多殺性巴氏桿菌、雞致病性沙門(mén)氏菌自然分離株、大腸桿菌088、金黃色葡萄球菌ACTT25923株、綠膿桿菌ACTT27853株。豬血抗菌肽抗菌活性的測(cè)定結(jié)果表明，豬血抗菌肽對(duì)雞多殺性巴氏桿菌、雞致病性沙門(mén)氏菌、大腸桿菌088、金黃色葡萄球菌ACTT25923株、綠膿桿菌ACTT27853株均有明顯的抑制作用，具體結(jié)果如表l所示。表l豬血抗菌肽對(duì)不同菌株的抑菌效果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>"-"5ram以下。結(jié)果表明，豬血抗菌肽對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用。2、豬血抗菌肽的抗病毒活性實(shí)驗(yàn)取10日齡雞胚12枚，隨機(jī)分為3組。I組(NDV組)接種雞新城疫病毒；II組(ABP處理組)接種經(jīng)本發(fā)明豬血抗菌肽處理的NDV;III組(對(duì)照組)接種滅菌生理鹽水。每枚雞胚尿囊腔接種樣品O.1mL。尿囊腔接種后，每12h照蛋一次，觀察雞胚發(fā)育情況。到18日齡，剖殺雞胚，觀察雞胚變化，稱(chēng)重，并取其尿囊液冷凍保存，進(jìn)行NDV血凝效價(jià)的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下(1)雞胚的大體病變雞胚接種病毒液后的第4天，可見(jiàn)NDV組雞胚運(yùn)動(dòng)減弱。接種后的第8天，剖檢雞胚進(jìn)行觀察，可見(jiàn)NDV組雞胚卵黃囊收縮，囊膜易撕裂尿囊液增多；出現(xiàn)矮小胚，羊膜增厚并粘連在胚體上。而ABP處理組和對(duì)照組的雞胚發(fā)育正常。(2)各處理組雞胚重量的比較用吸水紙拭干雞胚，稱(chēng)重，ABP處理組雞胚重量與對(duì)照組差異不顯著，而病毒組雞胚重量明顯低于前兩組(如表2所示)。表2不同處理之間雞胚重量的比較(I土S，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>NDV血凝效價(jià)測(cè)定結(jié)果如表3所示。表3雞胚尿囊液中NDV的血凝效價(jià)(i±S，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3備注組間均數(shù)進(jìn)行。檢驗(yàn)，標(biāo)有不同字母者表示差異極顯著(P〈0.01)，標(biāo)有相同字母者表示差異顯著(p<0.05)。由此可以看出，經(jīng)豬血抗菌肽處理的病毒液，由于病毒與豬血抗菌肽的相互中和作用，使得病毒的致病力喪失或減弱，不能在雞胚內(nèi)大量繁殖，因而表現(xiàn)為病毒的血凝效價(jià)較低。從而說(shuō)明豬血抗菌肽對(duì)病毒有較強(qiáng)的滅活作用。權(quán)利要求1、一種提取豬血抗菌肽的方法，包括以下步驟1)將豬血粉溶入緩沖液中，然后在混合液中加入木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，調(diào)整酶解液的pH為3.5～4.5；2)將氯仿和亞硫酸氫鈉加入到所述酶解液中進(jìn)行脫色，然后調(diào)整脫色后酶解液的pH值至6.0～7.0，成為豬血抗菌肽的粗提物。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于對(duì)所述粗提物進(jìn)行以下純化步驟:1)冷凍干燥所述豬血抗菌肽的粗提物，并將所述粗提物過(guò)凝膠型陽(yáng)離子交換柱，對(duì)交換柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；2)對(duì)所述洗脫液進(jìn)行真空冷凍干燥，成為豬血抗菌肽。3、如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述緩沖液是pH習(xí).O、濃度為0.05raraol/L的磷酸氫二鈉一檸檬酸混合液。4、如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述豬血粉與所述木瓜蛋白酶的重量份數(shù)之比為100:13。5、如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述酶解的溫度為65—75。C，酶解的時(shí)間為810h。6、如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述氯仿與所述酶解液體積份數(shù)之比為23:5;亞硫酸氫鈉的終質(zhì)量百分濃度為0.5%1.0%。7、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述冷凍干燥豬血抗菌肽粗提物的溫度為-50-60°C，冷凍時(shí)間為24h48h。8、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述凝膠型陽(yáng)離子交換柱為S印hadexG100凝膠柱；所述洗脫液為0.2mol/L的乙酸銨，洗脫的速度為10.0mL/cra2.h;對(duì)所述洗脫液進(jìn)行真空冷凍干燥的溫度為-50-60°C，冷凍干燥的時(shí)間為24h48h。9、如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述豬血粉的制備包括以下步驟1)對(duì)新鮮豬血進(jìn)行抗凝處理；2)對(duì)所述豬血進(jìn)行過(guò)濾，去除其中的纖維物質(zhì)；3)再對(duì)濾下物進(jìn)行反復(fù)凍融，冷凍干燥，制成豬血粉。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種提取豬血抗菌肽的方法，該方法包括以下步驟1)將豬血粉溶入緩沖液中，然后在混合液中加入木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，調(diào)整酶解液的pH為3.5～4.5；2)將氯仿和亞硫酸氫鈉加入到所述酶解液中進(jìn)行脫色，然后調(diào)整脫色后酶解液的pH值至6.0～7.0，成為豬血抗菌肽的粗提物。為了得到豬血抗菌肽的精制品，對(duì)所述粗提物進(jìn)行以下純化步驟1)冷凍干燥所述豬血抗菌肽的粗提物，并將所述粗提物過(guò)凝膠型陽(yáng)離子交換柱，對(duì)交換柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；2)對(duì)所述洗脫液進(jìn)行真空冷凍干燥，成為豬血抗菌肽。本發(fā)明為生產(chǎn)抗菌肽提供了一個(gè)新的途徑和方法。本發(fā)明方法具有操作簡(jiǎn)單、分離提取率高、成本低的特點(diǎn)，適用于較大量的從豬血中分離純化抗菌肽。文檔編號(hào)C12P21/00GK101250572SQ20071017647公開(kāi)日2008年8月27日申請(qǐng)日期2007年10月29日優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日發(fā)明者葉丁,佘銳萍,劉天龍,包匯慧,張艷梅,李文貴,王德成,羅冬梅,胡艷欣申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)