專利名稱：一種誘導甘草產(chǎn)生毛狀根的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種誘導甘草產(chǎn)生毛狀根的方法。
技術(shù)背景甘草是我國重要的傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、潤肺祛痰、緩急止痛、補氣益脾胃、 調(diào)和諸藥等功效，被譽為"百草之王"，其藥用價值是任何其他資源不能替代的。甘 草的主要藥效成分包括甘草酸和甘草黃酮，其中甘草酸是非常珍貴的解毒劑，可防治 病毒性肝炎、高血脂、癌癥和艾滋病等疾病；甘草黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、 抗?jié)?、抗衰老、保肝等藥理作用。甘草不僅是重要藥材，還廣泛應(yīng)用于日用化工品 及食品領(lǐng)域，其中甘草酸是一種天然甜味劑，而甘草黃酮是一類天然抗菌劑和防腐劑。隨著甘草的不斷開發(fā)利用，國內(nèi)國際兩個市場2006年 2008年的需求總量為9 萬 10萬噸，但全國甘草總產(chǎn)量只有2.5萬 3萬噸，市場缺口高達6.5萬 7萬噸。 需求告急，短缺已趨白熱化，嚴重地影響了企業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)院用藥。2001年9月我國為 了保護日益匱乏的甘草資源，限制了對野生甘草的采挖，甘草原料缺乏加劇。目前， 人工栽培還是甘草生產(chǎn)的主要途徑，然而人工栽培周期長，并受地域限制，不能滿足 市場需求，品質(zhì)方面也存在一些問題，特別是在有效成分量上，人工甘草與野生甘草 存在相當?shù)木嚯x。因此甘草資源匱乏及其質(zhì)量的嚴重下降成為限制甘草深度開發(fā)利用 的瓶頸，迫切需要尋找新的解決再生甘草資源的有效途徑。隨著生物工程技術(shù)的不斷提高，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導藥用植物產(chǎn)生毛狀根，并對 毛狀根進行離體培養(yǎng)，迅速大量的提取有效成分，是藥用植物資源可持續(xù)發(fā)展的有效 途徑之一。甘草發(fā)根的誘導研究早在八十年代已經(jīng)開始，并已成為該領(lǐng)域的一個研究 熱點。目前，關(guān)于如何提高甘草發(fā)根誘導效率的研究不是很多，大部分報道只注重對 影響發(fā)根生長因素的研究。陳士云(陳士云，桂耀林發(fā)根土壤桿菌體外轉(zhuǎn)化甘草子 葉及下胚軸.武漢植物學研究1991.9.04 301)等采用幾種不同發(fā)根農(nóng)桿菌介導甘草 下胚軸和子葉發(fā)根的誘導，得到了甘草毛狀根，各菌株介導的轉(zhuǎn)化效率及不同外植體 的誘導效率均有很大差異，最高的誘導率由A15834介導的甘草下胚軸產(chǎn)生，為93%， 但每個外植體產(chǎn)生的發(fā)根數(shù)量少；燕飛(燕飛,梁玉玲,崔東亞，張慧，朱寶成.發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化脹果甘草的研究.河北大學學報(自然科學版).2004年05期)等用R1601發(fā) 根農(nóng)桿菌介導甘草下胚軸轉(zhuǎn)化的最高誘導率為56. 49%;楊世海(楊世海，劉曉峰,沈昕等，
甘草Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及不同理化因子對甘草毛狀根生長的影響，中國中藥雜志， 2006,31(11):875)等報道用LAB9402介導甘草發(fā)根轉(zhuǎn)化，最高誘導率為85. 2%。這些研 究所采用的外植體均為甘草子葉和下胚軸，誘導率大多較低，其發(fā)根的出現(xiàn)時間約為 8-10天左右。杜旻(杜旻,向德軍,丁家宜等.甘草毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及化學成分分 析.植物資源與環(huán)境學報,2001,10(I):7 10)等通過A15834和R1000兩種發(fā)根農(nóng)桿菌介 導產(chǎn)生了甘草發(fā)根，所用的外植體為甘草幼莖，最高誘導率僅為39. 5%。綜上所述，目前所公開的甘草發(fā)根方法的誘導率大多不是很高，發(fā)根出現(xiàn)的時間 偏長，每個外植體上產(chǎn)生的平均發(fā)根數(shù)量少，不能滿足生產(chǎn)實際需要。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種高效、穩(wěn)定、快速的用發(fā)根農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化甘草，誘導 甘草發(fā)根產(chǎn)生的方法。本發(fā)明所提供的誘導甘草產(chǎn)生毛狀根的方法，是將甘草子葉節(jié)與含有A'質(zhì)粒的 發(fā)根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后，以含有頭孢霉素的無菌水沖洗之后轉(zhuǎn)入到誘導培養(yǎng)基中誘 導培養(yǎng)，在甘草子葉節(jié)上生長出甘草毛狀根。其中，發(fā)根農(nóng)桿菌在與甘草子葉節(jié)共培養(yǎng)前，先在固體YEB培養(yǎng)基中28i:培養(yǎng)兩 天，然后選取單克隆到液體YEB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，收集菌液，離心收集菌體；將收 集到的菌體以等同于YEB液體培養(yǎng)基體積的MS液體培養(yǎng)基混勻。甘草子葉節(jié)來源于 甘草種子萌發(fā)后三天的無菌苗。在本發(fā)明方法中，共培養(yǎng)所用的共培養(yǎng)基為含有50 — 300umol/L乙酰丁香酮的 MS固體培養(yǎng)基；優(yōu)選為含有200y raol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基。共培養(yǎng)的時間 為1一3天，優(yōu)選為2天。誘導培養(yǎng)基為含有100 —1000mg/L頭孢霉素的MS固體培養(yǎng) 基；優(yōu)選為含有500mg/L頭孢霉素的MS固體培養(yǎng)基。本發(fā)明首次以甘草子葉節(jié)為受體材料，通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導實現(xiàn)甘草發(fā)根的誘 導，既縮短了甘草發(fā)根出現(xiàn)的時間，誘導培養(yǎng)4天即可以產(chǎn)生出發(fā)根；又提高了轉(zhuǎn)化 效率，達到96%以上。并且，發(fā)根中活性成分甘草總黃酮高，含量可達到發(fā)根干重的 1.6%，使生藥根的兩倍多(生藥根為0.7%左右)，為利用甘草發(fā)根培養(yǎng)物來生產(chǎn)甘草 總黃酮奠定了良好的基礎(chǔ)。


圖1為發(fā)根農(nóng)桿菌介導^質(zhì)粒轉(zhuǎn)化甘草子葉節(jié)后甘草發(fā)根產(chǎn)生的照片；
圖2為A'質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后甘草發(fā)根的southern雜交結(jié)果。
具體實施方式
本發(fā)明用發(fā)根農(nóng)桿菌介導對甘草進行基因轉(zhuǎn)化，誘導發(fā)根產(chǎn)生的方法主要操作如 下將甘草子葉節(jié)與含有A'質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，將A7質(zhì)粒上帶有的T-DNA區(qū) 轉(zhuǎn)移到受體基因組中。其中，發(fā)根農(nóng)桿菌應(yīng)先涂布于固體YEB培養(yǎng)基，28"C培養(yǎng)2天后，選取單克隆菌 斑于液體YEB培養(yǎng)基中，28。C振蕩培養(yǎng)至一定濃度，再取少量菌液至YEB培養(yǎng)基中擴 大培養(yǎng)，然后，將菌液離心收集，去上清，加入同體積的MS液體培養(yǎng)基混勻。甘草 種子萌發(fā)三天后的子葉節(jié)在其中浸染20分鐘后，取出用無菌濾紙吸干，接入共培養(yǎng) 培養(yǎng)基，共培養(yǎng)2天后，無菌水沖洗，轉(zhuǎn)入無激素的MS固體培養(yǎng)基(含有500 mg/L 頭孢霉素)進行誘導培養(yǎng)。4天后即有發(fā)根出現(xiàn)，得到的甘草發(fā)根轉(zhuǎn)接入無激素的MS 固體培養(yǎng)基中繼代生長。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。 實施例l、用本發(fā)明的方法進行甘草發(fā)根的誘導本實施例中，以甘草Wj^Krr力J'^3 ^^/e/7^s種子萌發(fā)三天后的子葉節(jié)為受體材 料；以發(fā)根農(nóng)桿菌A4為介導菌株，該菌株含W質(zhì)粒，無抗性。 具體操作步驟如下1、 將發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液涂布于YEB固體培養(yǎng)上，28'C培養(yǎng)2天后長出單克??；2、 隨機挑取發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌落在液體YEB培養(yǎng)基中，28。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。 "0.6-0.9，再取lml菌液至100ralYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD6。。&0.5-0.7，收 集菌液，3500rpra離心10分鐘收集菌體；3、 將收集到的菌體以等同于YEB液體培養(yǎng)基體積并含有200n mol/L乙酰丁香酮 的MS液體培養(yǎng)基混勻；4、 將甘草的成熟種子消毒后于1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)三天，從無菌苗上切取帶有 lram左右下胚軸和子葉的部分，縱向剖開分成兩半，各帶一片子葉，然后切去三分之 一的子葉部分，保留三分之二的子葉和子葉節(jié)(保留部分子葉是為了在培養(yǎng)過程中給 子葉節(jié)提供營養(yǎng)，發(fā)根的發(fā)生部位在子葉節(jié)處)。以上外植體在上述菌液中浸染20 分鐘后，取出用無菌濾紙吸干，接入含有200nmol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基， 共培養(yǎng)2天；5、 將共培養(yǎng)后的甘草子葉節(jié)以含有500 mg/L頭孢霉素的無菌水沖洗三次，無菌
濾紙吸干，轉(zhuǎn)入含有500mg/L頭孢霉素的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；4天后即有發(fā)根僅在 子葉節(jié)部分出現(xiàn)，而子葉部分經(jīng)如此短時間的培養(yǎng)并不會出現(xiàn)發(fā)根，并且只有極少數(shù) 子葉培養(yǎng)10天左右會在傷口處出現(xiàn)少量發(fā)根，但看起來僅為一些白點，而這時候子 葉節(jié)上面的發(fā)根已經(jīng)伸長并向培養(yǎng)基里生長。6、 12天后將從子葉節(jié)處得到的甘草發(fā)根根尖2-3cm處轉(zhuǎn)接入含有200 mg/L頭孢 霉素的MS固體培養(yǎng)基中除菌并繼代培養(yǎng)。按上述方法，對供試材料進行了遺傳轉(zhuǎn)化，共處理500個子葉節(jié)，結(jié)果有480個 外植體成功的誘導出發(fā)根，平均每個外植體上的發(fā)根數(shù)為IO根左右，轉(zhuǎn)化效率達到 96%。發(fā)根農(nóng)桿菌介導A'質(zhì)粒轉(zhuǎn)化甘草子葉節(jié)后甘草發(fā)根產(chǎn)生的照片如圖1所示。實施例2、發(fā)根系的分子檢測隨機選取實施例1中得到的3個甘草發(fā)根株系，用CTAB法提取總DNA，采用地高 辛標記的/^質(zhì)粒上與根形成有關(guān)的rWC基因片段作探針，進行southern雜交。雜 交結(jié)果顯示，所得到的發(fā)根株系全部為陽性，證明發(fā)根農(nóng)桿菌中的T-DNA區(qū)己成功整 合進甘草根的基因組DNA中。如圖2所示，1-3分別為不同的轉(zhuǎn)基因發(fā)根系，其中探 針為地高辛標記的rWC基因片段；4為未轉(zhuǎn)基因的陰性對照(普通甘草組培根)；5 為陽性對照發(fā)根農(nóng)桿菌A4的W質(zhì)粒。實施例3、發(fā)根系中的總黃酮含量檢測以紫外分光光度計檢測發(fā)根系中的甘草總黃酮含量取經(jīng)繼代培養(yǎng)20天的甘草 發(fā)根樣品于60'C烘至恒重，粉碎，過60目篩，精密稱取0.1g粉末，以甲醇為溶劑超 聲波提取兩次，每次30min，離心，合并濾液定容至10ml，取100iU，加入1 ml甲 醇和0.5mll(P/。氫氧化鈉，定容至2ml，以柚皮苷為標準品，用紫外分光光度計在 420nm波長處進行檢測，并計算其總黃酮占發(fā)根的干重百分比。結(jié)果表明，發(fā)根中活性成分甘草總黃酮高，含量可達到發(fā)根干重的1. 6%，是野生 甘草生藥根的兩倍多(生藥根為0.7%左右)。
權(quán)利要求
1、一種誘導甘草產(chǎn)生毛狀根的方法，是將甘草子葉節(jié)與含有Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后，以含有頭孢霉素的無菌水沖洗之后轉(zhuǎn)入到誘導培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)，在甘草子葉節(jié)上生長出甘草毛狀根。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)根農(nóng)桿菌在與甘草子葉節(jié) 共培養(yǎng)前，先在固體YEB培養(yǎng)基中28r培養(yǎng)兩天，然后選取單克隆到液體YEB培養(yǎng)基 中振蕩培養(yǎng)，收集菌液，離心收集菌體；將收集到的菌體以等同于YEB液體培養(yǎng)基體 積的MS液體培養(yǎng)基混勻。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述甘草子葉節(jié)來源于甘草種子 萌發(fā)后三天的無菌苗。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1一3任一所述的方法，其特征在于共培養(yǎng)所用的共培養(yǎng)基為 含有50 — 300 u mol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基；優(yōu)選為含有200 w mol/L乙酰丁 香酮的MS固體培養(yǎng)基。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于共培養(yǎng)的時間為1一3天，優(yōu)選為2天。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l一3任一所述的方法，其特征在于所述誘導培養(yǎng)基為含有100 一1000mg/L頭孢霉素的MS固體培養(yǎng)基；優(yōu)選為含有500mg/L頭孢霉素的MS固體培養(yǎng) 基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種誘導甘草產(chǎn)生毛狀根的方法。本發(fā)明所提供的誘導甘草產(chǎn)生毛狀根的方法，是將甘草子葉節(jié)與含有Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后，以含有頭孢霉素的無菌水沖洗之后轉(zhuǎn)入到誘導培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)，在甘草子葉節(jié)上生長出甘草毛狀根。本發(fā)明首次以甘草子葉節(jié)為受體材料，通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導實現(xiàn)甘草發(fā)根的誘導，既縮短了甘草發(fā)根出現(xiàn)的時間，4天即可以產(chǎn)生出發(fā)根；又提高了轉(zhuǎn)化效率，達到96％以上。并且，發(fā)根中活性成分如甘草黃酮高，達到1.6％；為利用甘草發(fā)根培養(yǎng)物來生產(chǎn)有用的甘草酸和甘草黃酮奠定了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/82GK101157936SQ200710152328
公開日2008年4月9日 申請日期2007年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月8日
發(fā)明者劉敬梅, 盧虹玉, 驊 周, 毅 李 申請人:北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司