專(zhuān)利名稱(chēng)：：水溶性四唑鹽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于醫(yī)學(xué)目的的生物樣品的分析。
背景技術(shù)：
：生物樣品的分析通常涉及其中顏色與樣品中分析物的量成比例顯示的方法。例如，可以使用酶來(lái)氧化所考慮的分析物并且通過(guò)指示劑化合物的變色顯示反應(yīng)程度。本文特別感興趣的是用作指示劑的四唑鹽的家族。此類(lèi)鹽被還原物質(zhì)還原成甲艚(formazan)染料。為了測(cè)量分析物，酶(例如，NAD-依賴(lài)性脫氫酶)將分析物氧化而產(chǎn)生還原形式(例如，NADH)，后者與四唑鹽反應(yīng)產(chǎn)生有色的甲腯?？赡苄枰絼┮源龠M(jìn)反應(yīng)。因?yàn)橛煞治鑫锓磻?yīng)產(chǎn)生的NADH的量與所產(chǎn)生的曱歷的量成比例，所以可以通過(guò)所形成的顏色間接地測(cè)量分析物的量。四唑鹽已經(jīng)用于各種應(yīng)用。但是，特別地，它們已經(jīng)用于測(cè)量各種生物流體例如血液、尿、血漿和血清中的分析物的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。這些指示劑通常以放在試驗(yàn)條上的反應(yīng)物體系方式使用，當(dāng)與流體樣品接觸時(shí)，它們與所考慮的分析物反應(yīng)并且顯示指示所存在的分析物的量的顏色。雖然在某些情況下，可以參考比色圖表視覺(jué)上讀取顏色變化，但是更準(zhǔn)確的讀取可以通過(guò)為這種目的而設(shè)計(jì)的儀器以分光光度方式進(jìn)行。通常，將光射到該試驗(yàn)條上并且測(cè)量反射光來(lái)測(cè)定試驗(yàn)條上的變色效果。四唑鹽應(yīng)該產(chǎn)生甲腯，所述甲邇?cè)诒苊庥捎跇悠分械奈镔|(zhì)，例如全血中的血紅蛋白干擾的波長(zhǎng)下吸收光。因此，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一類(lèi)噻唑基四唑鹽，它們產(chǎn)生吸收波長(zhǎng)大于大約640nm的光(例如由用作光源的LED產(chǎn)生的那些光)的甲廂。LED提供變化僅為大約士5nm的窄波長(zhǎng)范圍。此類(lèi)噻唑基四唑鹽在若干美國(guó)專(zhuān)利如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,126,275;5，322，680;5，300，637和5，290，536中進(jìn)行了公開(kāi)。大多數(shù)生物樣品性質(zhì)上是水性的，所以希望指示劑可溶于樣品。然而，許多四唑鹽是不易溶的。四唑鹽的一個(gè)供應(yīng)商(DojindoLaboratories)具有一系列指示劑，通過(guò)將磺酸基添加到指示劑分子中而使這一系列指示劑變得更可溶。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，063,587和公開(kāi)的日本專(zhuān)利申請(qǐng)JP58113181A2和JP58113182A2。它們的WST系列四唑鹽指示劑通常在公開(kāi)分析方法的專(zhuān)利中提到。一個(gè)實(shí)例參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，586，199。據(jù)報(bào)道WST系列四唑鹽的溶解度為大約10mg/mL水。當(dāng)使用四唑鹽的某些磺酸根和膦酸根平衡離子時(shí)，還可以增加溶解度，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,250,695中公開(kāi)的那樣。論述四唑鹽指示劑的其它專(zhuān)利包括EP0476455Bl;US2004/0132004Al;W098/37157;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，183，878Bl;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，207，292Bl;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,277,307Bl;DE2147466;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,185,450;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，196，314。本發(fā)明發(fā)明人想要改進(jìn)噻唑基四唑鹽的溶解性同時(shí)保持它們?cè)趯?duì)由LED提供的入射光作出反應(yīng)時(shí)由它們的甲脂在600-640認(rèn)范圍內(nèi)作出較平緩頻語(yǔ)響應(yīng)的能力。如將從下面發(fā)明說(shuō)明書(shū)中知道的那樣，它們已經(jīng)成功地提供具有更大溶解性同時(shí)保持所需頻譜響應(yīng)的噻唑基四唑鹽
發(fā)明內(nèi)容.本發(fā)明包括新型噻唑基四唑鹽。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其中一些在水中具有比相關(guān)專(zhuān)利性噻唑基四唑鹽更好的溶解性。改進(jìn)溶解性使它們變得更容易施加到用于測(cè)量生物樣品中分析物(例如血樣中的葡萄糖)的試驗(yàn)條上。所述四唑鹽的特征在于具有增加溶解性的烷基銨烷氧基取代基。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述四唑鹽由以下通式限定。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中A-平衡離子X(jué)=1-6C烷基或雜烷基a=l-3b+3R產(chǎn)1-6C烷基R2和R3之一是烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(RJ3—b，或1(2和R3形成亞甲二氧基，R4和Rs之一是卣素并且另外一個(gè)是閨素取代的1-6C烷基，l和Rs中一個(gè)或兩個(gè)是XN+Hb(RJ3-b，或R4和R5連接形成芳族或雜芳族環(huán)或取代的芳族環(huán)或取代的雜芳族環(huán)。上面給出的通式表示新型瘞唑基四唑鹽，即它們包含在2氮位置與四唑環(huán)連接的參唑環(huán)。另外，它們各自具有在四唑環(huán)上的3氮位置連接的苯基環(huán)和在5氮位置連接的另一個(gè)苯基環(huán)。通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)烷基銨烷氧基連接到噻唑基四唑鹽上，實(shí)現(xiàn)了相對(duì)于在此由HTC-045命名的專(zhuān)利性漆唑基四唑鹽的溶解性增加。所述烷基銨烷氧基可以作為R,和/或Rs與噢唑基環(huán)連接，或在由R^和Rs形成的芳族或雜芳族環(huán)上進(jìn)行取代。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述烷基銨烷氧基是與四唑環(huán)連接的苯基環(huán)上的取代基。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本烷基銨烷氧基是三烷基銨丙氧基。苯并噻唑基四唑鹽是優(yōu)選的具有增加的溶解性的化合物。對(duì)于本發(fā)明的另一方面，所述噻唑基四唑鹽在使用酶氧化分析物的生物樣品分析中，如在測(cè)定血液的葡萄糖含量中用作檢測(cè)還原物質(zhì)(例如NADH)的存在的顯色指示劑。附圖簡(jiǎn)述圖1是制備實(shí)施例的化合物的第一種方法的示意圖。圖2是制備實(shí)施例的化合物的第二種方法的示意圖。圖3示出了實(shí)施例中報(bào)道的對(duì)比化合物。圖4a-b示出了在實(shí)施例中制備的本發(fā)明的化合物。圖5a和b是四唑鹽吸光率對(duì)光波長(zhǎng)的曲線(xiàn)。具體實(shí)施方式定義以下定義適用于本發(fā)明的噻唑基四唑鹽的取代基。"1-6C"-是指含1-6個(gè)碳原子的殘基"烷基"-是指通式CJ^的線(xiàn)性和支化烴殘基"雜烷基"-是指包含與相鄰碳原子連接的雜原子的線(xiàn)性和支化烴殘基"烷氧基，，-是指殘基-OR，其中R是烷基"亞曱二氧基"-是指通式-0-CH2-0-的二價(jià)殘基"卣素"-是指氟、氯、碘和溴"卣素取代的l-6C烷基"-是指具有通式CJ^Y2的線(xiàn)性或支化殘基，其中Y是鹵素"芳族環(huán)"-是指苯或萘環(huán)"雜芳族環(huán)"-是指吡啶或喹啉環(huán)"平衡離子"-是指來(lái)自于制備四唑鹽的反應(yīng)物的離子殘基(例如，亞硝酸根、磷酸根、磷酸氫根、磷酸二氫根、硫酸氫根、硫酸根、碳酸氫根、碳酸根、甲烷磺酸根、氟硼酸根、溴離子、氯離子、碘離子或它們的結(jié)合物)"tet鹽"是四唑鹽的縮寫(xiě)漆峻基四哇鹽如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,126,275中所公開(kāi)的那樣，來(lái)自噻唑基四唑鹽的甲脂的特征在于具有在大于大約600-65Gnm顯示延長(zhǎng)的平穩(wěn)段的反射傳，這在使用LED作為光源的設(shè)備中是有用的。使樣品與產(chǎn)生顏色的反應(yīng)體系接觸，該顏色指示存在于樣品中的分析物的量。檢測(cè)從試驗(yàn)區(qū)返回的光并與分析物含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)。在一個(gè)重要的實(shí)施例中，在NAD+的存在下葡糖脫氫酶催化在血樣中的葡萄糖氧化。通過(guò)酶媒劑如黃遞酶將還原的NADH再氧化，所述酶媒劑催化四唑鹽還原成甲腯。所產(chǎn)生的變色與由葡萄糖的氧化制備的NADH的量成比例并且間接地與存在于樣品中的葡萄糖的量成比例。從噻唑基四唑鹽轉(zhuǎn)化成有色甲膽的變色可以通過(guò)將它暴露在光源下來(lái)測(cè)量。檢測(cè)從有色試驗(yàn)區(qū)返回的光并通過(guò)適合的算法轉(zhuǎn)化成樣品中分析物的量。雖然在此對(duì)于MD-NADH進(jìn)行了描述，但是本發(fā)明的四唑鹽具有更寬廣的應(yīng)用，包括它們與具有其它補(bǔ)助因子如PQQ和FAD的脫氫酶一起使用。因?yàn)槿剡蚧倪螓}和它們相應(yīng)的曱膽應(yīng)該可溶于施加到用來(lái)檢測(cè)分析物的試驗(yàn)條上的反應(yīng)混合物，所以發(fā)明人的目的是改進(jìn)噻唑四唑鹽的溶解性，同時(shí)維持它們提供在600-640nm范圍中具有較平緩反射譜的甲滯的能力。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括滿(mǎn)足它們的目的的化合物的一類(lèi)新型噢唑基四唑鹽。這些鹽由以下通式表示其中A-平衡離子X(jué)-1-6C烷基或雜烷基a=l—3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>R產(chǎn)1-6C烷基R2和R3之一是烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(RJ3-b，或112和R3形成亞曱二氧基，R,和Rs之一是卣素并且另外一個(gè)是卣素取代的l-6C烷基，R4和R5中一個(gè)或兩個(gè)是XN+Hb(RJ3-b，或l和R5連接形成芳族或雜芳族環(huán)或取代的芳族環(huán)或取代的雜芳族環(huán)。本發(fā)明的四唑鹽也可以分離成取代的漆唑基四唑鹽和取代的苯并噻唑基四唑鹽，如以下所特別考慮的通式所示。其中A-平衡離子X(jué)-1-6C烷基a=l-3b=0-3R產(chǎn)1-3C烷基R2和R3之一是1-4C烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(IU3_b，或IU和113連接成為亞甲二氧基，R4=CHF2R產(chǎn)卣素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>A-平衡離子X(jué)-1-6C烷基a=l-3b=0-3R產(chǎn)1-3C烷基R2和Rs之一是1-4C烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(RJ3—b，或112和1(3連接成為亞甲二氧基，R4和Rs是H，或艮和Rs連接形成芳族環(huán)R6=1-4C烷氧基，氫或卣素。這些化合物(I和II)的溶解性將在下面實(shí)施例中說(shuō)明。改進(jìn)塞唑基四唑鹽的溶解性應(yīng)該減少獲得試驗(yàn)結(jié)果所需要的時(shí)間并且在高分析物水平下提供更好的線(xiàn)性度。此外，改進(jìn)的水溶性應(yīng)該促進(jìn)配制一個(gè)反應(yīng)物的混合物，它制造起來(lái)將更容易和更廉價(jià)。本發(fā)明四唑鹽的制備方法在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,126,275中，描述了噻唑基四唑鹽的制備方法。該方法包括使腙與重氮化苯胺起反應(yīng)以制備曱腯，然后將該甲滯氧化成四唑鹽。發(fā)展了待描述的用于制造本發(fā)明化合物的新方法，將一個(gè)(方案1)或兩個(gè)(方案2)極性基團(tuán)引入化合物I和II的優(yōu)選的四唑鹽中。圖1和2說(shuō)明了這兩種方法。以下實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。方案1用來(lái)制備其中在四唑環(huán)上的5位置處的苯基取代基具有亞甲二氧基取代基的四唑鹽。在方案1中，三甲基銨丙氧基在四唑環(huán)上的3位置處的苯基取代基上進(jìn)行取代。在方案1中，鄰硝基苯酚與溴化3-溴代丙基三甲基銨起反應(yīng)以形成溴化3-(2-硝基苯氧基)丙基三甲基銨然后經(jīng)氫化形成等同的苯胺。該化合物與含取代的瘞唑基環(huán)和具有亞甲二氧基取代基的苯基環(huán)的腙起反應(yīng)產(chǎn)生曱斕。然后將該甲膽氧化成四唑鹽。該腙由取代的苯甲醛與取代的肼的反應(yīng)而形成，所述取代的肼包含該四唑鹽所需的取代基。方案2用來(lái)制備這樣的四唑鹽，其中在四唑環(huán)上的5位置處的苯基取代基具有在3或4位置(或兩者)取代的三曱基銨丙氧基。如在方案1中那樣，三甲基銨丙氧基在四唑環(huán)上的3位置處的苯基取代基上進(jìn)行取代。在方案2中，4-羥基-3-甲氧基苯甲醛與溴化3-溴代丙基三甲基銨起反應(yīng)以將三甲基銨丙氧基添加到該苯曱醛上。該產(chǎn)物與取代的肼起反應(yīng)產(chǎn)生腙。該腙與方案1的第一步中制備的溴化3-(2-氨基苯氧基)丙基三甲基銨起反應(yīng)而產(chǎn)生曱雁，將該甲脂變?yōu)樗倪螓}。從下面的結(jié)果中將看出，溶解性似乎受與四唑鹽有關(guān)的平衡離子的影響。平衡離子由方法中所使用的反應(yīng)物產(chǎn)生并且可以進(jìn)行改變以提供優(yōu)選的平衡離子?；蛘?，平衡離子可以被替代，例如通過(guò)離子交換法替代。在以下非限制性實(shí)施例中，通過(guò)分光光度分析法鑒定每個(gè)步驟的產(chǎn)物并且為每個(gè)產(chǎn)物給出結(jié)果。實(shí)施例15-苯并[1,3-間二氧雜環(huán)戊烯-5-基]-3-[2-(3-三甲基銨)丙氧基-苯基]-2-(5-氯-4-二氟甲基-噻唑-2-基)-2H-四唑溴代亞硝酸鹽的制備如方案1所示，使鄰硝基苯酚與溴化3-溴代丙基三甲基銨起反應(yīng)以形成溴化3-(2-硝基苯氧基)丙基三甲基銨，然后將它氫化形成等同的苯胺。使該苯胺與含取代的塞唑基環(huán)和苯基環(huán)的腙起反應(yīng)以制備甲腯，所述苯基環(huán)具有亞甲二氧基取代基。然后將該甲滯氧化成四唑鹽。在以下實(shí)施例中將更完全地描述該方法向在氮?dú)庀碌?50mL干燥的一頸圓底燒瓶中的鄰硝基苯酚(Aldrich,6.3g，45mmol)在DMF(150mL)中的黃色溶液中，添加碳酸鉀(6.6g,48mmol)。該混合物轉(zhuǎn)變成橙色。在攪拌10分鐘之后，添加溴化3-溴代丙基三曱基銨(Aldrich，12.9g，45mmo1)。在下加熱所得的混合物3小時(shí)。在將該反應(yīng)混合物冷卻到室溫之后，將殘留物過(guò)濾并用DMF(2x2(J)mL)洗滌該沉淀。將濾液緩慢地添加到EtOAc(750mL)中，引起沉淀形成。攪拌所得的混合物30分鐘。將沉淀過(guò)濾并用EtOAc:DMF,5:1(3xl00mL)的溶液，然后用EtOAc(100mL)和己烷(100mL)洗滌。在將該淺黃色固體風(fēng)干5分鐘之后，將產(chǎn)物添加到EtOAc:DMF，10:l(550mL)的溶液中并攪拌1小時(shí)。將該固體過(guò)濾，用EtOAc(lOOmL)和己烷(lOOmL)洗滌。將所得的固體過(guò)濾而產(chǎn)生通過(guò)以下性能鑒定的淡米黃色產(chǎn)物(14.54g,>100°/。)，mp(178。-181t:)。"CNMR(400MHz，DMSOd6):5151，139.45，134.71，125.14，121，115.39，66.59，62.84，52.39，22.48力NMR(400MHz，DMSO-d6):57.90(dd，J=8.lHz，J=l.7Hz，1H),7.58(dt，J=8.2Hz，J-l.7Hz，1H)，7.39(d，J=8.2Hz，1H)，7.15(d，J-l.7Hz，1H)，4.25(t，J=6Hz，2H)，3.45(m,2H)，3.11(s，9H),2.23(m，2H)。ESI-MS:m/z239(100%，M2+)。在35psi下在Parr氫化裝置中，將溴化3-(2-硝基苯氧基)丙基三甲基銨(7g，21.94mmo1)、10%Pd/C(725mg)、MeOH(70mL)和水(70mL)的漿料氫化2.5小時(shí)。在30分鐘之后，壓力降至22psi。將所得的混合物濾過(guò)521Celite墊。用MeOH(2xlOmL)洗滌該黑色催化劑/Celite的墊子。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上在減壓并40-451C下將該濾液濃縮。當(dāng)不再形成餾出液時(shí)，將該淡粉紅色溶液輸送到另一個(gè)燒瓶中并通過(guò)冷凍干燥濃縮2天而產(chǎn)生通過(guò)以下光譜性能鑒定的淡米黃色苯胺衍生物(5.92g，93%)。13CNMR(400MHz,DMSO-d6):5145.19，137.76，121.39，116.15，114.09,111.86，64.79，63.27，52.36，22.78'HNMR(400MHz,DMSO—d6):56.78(d，J=4Hz，1H)，6.66(m，2H),6.53(d，J=6Hz，1H)，4.82(brs，2H)，3.99(t，J=6Hz，2H),3.54(m，2H)，3.11(s，9H)，2.17(m，2H)。ESI-MS:m/z209(100%，M2+)。在冰水浴中，向上述苯胺衍生物(7.7g，26.64mmo1)在水(80ml)中的溶液中逐滴添加濃HC1(7.2ml)。在攪拌該溶液5分鐘之后，逐滴添加亞硝酸鈉(2.2g，32mmo1)在水(16mL)中的溶液。該溶液的顏色從淺棕色變成金黃色。攪拌所得的溶液30分鐘。在鹽/冰/水浴(-15。至-2(TC)中的裝備有機(jī)械攪拌器和夾套添加漏斗的3頸2升燒瓶中，將腙(Bayer，9.8g，27.98mmo1)在吡啶(400mL)中的溶液攪拌。經(jīng)由用冰/水填充的夾套添加漏斗，逐滴將剛才制備的重氮溶液添加到該腙溶液中。在開(kāi)頭幾滴之后，反應(yīng)物顏色從黃色變成深藍(lán)色。在l/3添加之后，該深藍(lán)色反應(yīng)混合物變得非常粘。當(dāng)完成添加時(shí)，攪拌該混合物30分鐘。然后，經(jīng)由水/水浴使該反應(yīng)物溫?zé)岬?-5*€。攪拌反應(yīng)物1小時(shí)。將該混合物轉(zhuǎn)移至裝有甲醇(500mL)的2升圓底燒瓶中。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上在減壓和45X:下將該混合物濃縮直到不再形成餾出液。再次添加MeOH(500mL)并將混合物濃縮。重復(fù)該過(guò)程。在真空下干燥所得的固體一整夜。然后，用MeOH(100mL)沖洗該燒瓶并用EtOAc(500mL)稀釋。在冰/水浴中攪拌該漿料30分鐘。將產(chǎn)物過(guò)濾并用EtOAc(100mL)，冷MeOH(50mL)、EtOAc(150mL)和己烷(150mL)洗滌。將所得的深藍(lán)色產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至淡黃色瓶子中并在真空下干燥而獲得通過(guò)以下光譜性能鑒定的所需的甲脂U3，11.3g，67%)。19FNMR:(376mHz，DMSOd6):5-177.77(d，J=59.2Hz)，13CNMR(400MHz，DMSO-d6):5169.57，153.6，148.1，147.8，144.81，141.9，137.1，132.74,128.82，121.53，121.5,121.1，115.89,113.96，108.8，108.22，106.68，101.33，66.21，63.03,51.99，22.351H腿(400MHz，DMS0-d6):511.78(brs，1H)，8.05(dd，J=8.lHz，J=l.5Hz，1H)，7.55(dd，J=8.2Hz，J=l.6Hz，1H)，7.48(dd，J=8.2Hz,J-l.7Hz，1H)，7.43(d，J=l.7Hz，1H),7.32(dd，J-8Hz，J-〈lHz，1H)，7.16(t，J-7.9Hz，1H)，7.15(t，JHF=59.2，1H),7.04(d，J=8.2Hz，1H)，6.11(s，2H)，4.32(t，J=6Hz,2H),3.49(m，2H)，3.05(s，9H)，2.38(m，2H)。ESI-MS:m/z611(100%，M-Ms)，258(26%，M2+)。向上述甲腯(2.16g，3.4mmol)、水(1.4mL)和THF(40mL)的混合物中添加甲烷磺酸(0.68mL，10.24mmol)。攪拌該混合物5分鐘。然后，按一份添加亞硝酸鈉(720mg,10.24mmo1)。攪拌該混合物3天。漿料顏色從深藍(lán)色變成橙色。將該橙色沉淀物過(guò)濾并用THF(2x10mL)洗滌。在真空下干燥該產(chǎn)物一整夜。然后，用MeOH(80mL)將該固體制漿，過(guò)濾并用MeOH(2x5mL)洗滌殘留物。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上在減壓和40TC下將該濾液濃縮。在真空下干燥所得的產(chǎn)物2天而獲得通過(guò)以下光譜性能鑒定的橙色tet鹽(2.86g，>100%)。19FNMR:(376MHz,DMSO-cU:5-181.13(d，J=52.1Hz)，13CNMR(400MHz，DMSO-d6):5165.1,152.52，152.27，148.85，146.68,142.72，142.45，137.07，135.95，128.44，123.87，121.87，121.86，121.39，115.57,114.68，110.80，109.84，108.43，107.14,106.06，102.78，100.49，66.92，62.23，52.21，22.08^NMR(400MHz,DMSO-d6):57.98(dd，J=8.0Hz，J=l.5Hz，1H)，7.91(m，2H)，7.82(d，J=l.8Hz，1H)，7.53(d，J=8.2Hz，1H)，7.37(m，1H)，7.31(d，J=8.2Hz，1H),7.25(t，JHF-59.2，1H)，6.27(s，2H)，4.17(t，J=6Hz，2H),3.49(m，2H),2.93(2，9H)，2.02(m，2H)。ESI-MS:m/z663(22%，M2++TFA),645(17%，M+)，275(100%，M2+)。實(shí)施例25-苯并[1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-5-基]-3-[2-(3-三曱基銨)丙氧基-苯基]-2-(5-氯-4-二氟甲基噻唑-2-基)-2H-四唑溴代四氟硼酸鹽的制備.如實(shí)施例1那樣制備鹽，不同在于使用48%四氫氟代硼酸與相同的甲應(yīng)而產(chǎn)生所需的橙色四唑鹽。'3CNMR(400MHz,DMSOd6):13CNMR(400MHz，DMSOd6):5137，128，124，121，114，111，110，108,107，106，103，68，63，53,2819FNMR:(376MHz,DMSO-d6):5-181.13(d，J=59.2Hz)，^腿(400MHz，DMSO-d6):57.92(m，3H)，7.82(d，J=l.8Hz，1H),7.52(bd，J=8.2Hz，1H)，7.37(m，1H)，7.31(d，J=8.2Hz，1H)，7.25(t，JHF=59.2，1H)，6.27(s，2H)，4.17(t，J=6Hz，2H)，3.35(m，2H)，2.93(2，9H),2.02(m，2H)。ESI-MS:m/z637(謂。，M+-Br)。實(shí)施例35-苯并[1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-5-基]-3-[2-(3-二曱基氫銨)丙氣基-苯基]-2-(5-氯-4-二氟甲基噻唑-2-基)-2H-四唑溴代亞硝酸鹽的制晝向在氮?dú)庀碌?00mL干燥的一頸圓底燒瓶中的鄰硝基苯酚(Aldrich，2.lg，45mmo1)在DMF(50mL)中的黃色溶液中，添加碳酸鉀(4.4g，32mmo1)。該混合物轉(zhuǎn)變成橙色。在攪拌10分鐘之后，添加3-氯代丙基二甲基銨氯化氫(Aldrich,2.4g，16.5mmo1)。在125匸下加熱所得的混合物一天。在將該反應(yīng)混合物冷卻到室溫之后，將殘留物過(guò)濾并用MeOH(2x10mL)洗滌該沉淀。在真空和40C下濃縮該濾液直到5mL。然后添力卩EtOAc(100mL)。沉淀形成并過(guò)濾。將水(100mL)和EtOAc(150mL)添加到該濾液中，層混合并分離。用EtOAc(3x25mL)萃取水層。用飽和的氯化鈉水溶液(25mL)洗滌合并的EtOAc萃取物，在硫酸鎂(5g)上干燥，過(guò)濾并濃縮而獲得黃色油(2.55g，81%)。!H醒(400MHz,DMS0-d6):57.80(dd，J=8.1Hz，J=l.7Hz，1H)，7.58(dt，J=8.2Hz，J=l.7Hz,1H)，7.05(d，J-8.2Hz，1H)，6.65(d，J=l.7Hz，1H)，4.25(t，J=6Hz，2H)，2.45(m，2H)，2.15(s，9H)，1.9(m，2H)。ESI-MS:m/z225(100%，M+1)。按與實(shí)施例1相同的方式處理該烷基化的硝基苯酚而產(chǎn)生所需的tet鹽。13CNMR(400MHz，DMSOd6):5127，124，121，115，110，109，108，107，104，102,64，48，36，2819FNMR:(376MHz,DMSO-d6)(d，J=59.2Hz):5—119.13，工H腿(400MHz,DMSO-d》:57.95(m，3H)，7.80(d，J-l.8Hz，1H)，7.50(d，J-8.2Hz，1H)，7.35(t，J=8.2Hz，1H)，7.31(d，>8.2Hz，1H),7.25(t，JHF-59.2，1H)，6.27(s，2H),4.20(t，J=6Hz，2H)，3.45(m，2H),2.65(d，j-l.8Hz，6H)，1.98(m，2H)。ESI-MS:m/z535(100%，M2+)。實(shí)施例45-苯并[1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-5-基]-3-[2-(3-三甲基銨)丙氧基-苯基]-2-(苯并噻唑-2-基)-2H-四唑溴代亞硝酸鹽的制備如實(shí)施例1中那樣使胡椒醛-苯并噻唑-2-基腙與溴化3-(2-氨基苯氧基)丙基三甲基銨起反應(yīng)以制備甲雁，然后將它轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的四唑鹽。在與實(shí)施例1中制備甲脂所使用的相似的條件下，使胡椒醛苯并噻唑-2-基腙(Bayer，2.5g，10.5mmo1)與實(shí)施例1的苯胺衍生物(2.85g，9.6mmo1)起反應(yīng)而獲得通過(guò)以下光譜性能鑒定的暗紫色固體(4.7g，82%)。力畫(huà)R(400MHz，DMSO-d6):511.78(brs，IH)，7.98(dd，2H)，7.73(m，1H)，7.60(m，2H)，7.50(m，1H)，7.41(m，2H)，7.29(m,1H)，7.05(d，1H)，6.14(s，2H)，4.39(t，2H)，3.55(m，2H)，3.05(s，9H)，2.48(m，2H)。ESI-MS:m/z517(100%，M+)。在與實(shí)施例1相同的條件下，將上述曱腯(600mg，l.Ol腿ol)轉(zhuǎn)變成四唑鹽(870mg，〉100%)。通過(guò)以下光語(yǔ)性能鑒定該四唑鹽。13C腿(100MHz，DMSO-d6):5164.98，152.59，152.26，148.91，136.64，132.74，135.08，129.27,128.88，128.24,124.77，123.97，123.7，122.6，121.97，115.81，114.56，109.86，107.12，102.82,66.88，62.26,52.2，22.02。腿(400MHz,DMSO-(U:58.42(dd，J=8.2Hz，J-0.8Hz，lH)，8.03(dd，J-7.7Hz，3=1.6Hz，1H)，8.02(dd，J=8.lHz，J-O.9Hz，1H)，7.97(dd，J-8.2Hz，J=l.8Hz，1H)，7.93(m，lH)，7.86(d，J=1.7Hz，lH),7.76(m，lH),7.73(m，lH)，7.55(dd，J=8.6Hz，J=0.9Hz，lH)，7.39(m，lH),7.32(d，J-8.lHz，1H)，6.28(s，2H)，4.12(t，J=6Hz，2H)，3.16(m，2H)，2.91(s，9H)。BSI-MS:m/z561.2(100°/。，M+)。實(shí)施例55-苯并[1,3-間二氣雜環(huán)戊烯-5-基]-3-[2-(3-三甲基銨)丙氧基-苯基]-2-(6-曱氧基萘基嚷唑-2-基)-2H-四唑溴代亞硝酸鹽的制備使用6-甲氧基-2-胼基-萘基噻唑代替實(shí)施例4中的2-肼基-苯并噻唑以制備合適的腙。然后，在相同的條件下處理該腙而產(chǎn)生所需的甲應(yīng)(44%總)。13CNMR(400MHz，DMS0-d6):5135，130,125，122，121，120，115，114，113，110，65，64,55，52，38,22^腿(400MHz，DMSO—d6):58.61(d，J=8.lHz，1H),8.29(d，J=8.2Hz，1H)，8.05(dd，J=8.lHz，J=l.8Hz，1H)，7.82(dt，J=8.2Hz，J-l.7Hz，1H)，7.68(叫2H)，7.61(dd，J=8.lHz，J=l.6Hz，1H)，7.55(d，J=l.8Hz)，7.37(dd，J=8.2Hz，J=l.8Hz，1H)，7.31(dd，J=8.2Hz，J-l.8Hz，1H),7.27(dt，J=8.lHz，J-l.7Hz，1H)，7.08(d，J=8.lHz，1H)，6.12(s，2H)，4.45(t，J=6Hz，2H)，4.10(s，3H)，3.60(叫2H)，2.95(s，9H)，2.65(叫2H)。ESI"MS:m/z597(100%,NO。向在冰/鹽/水浴中的乙酸(5mL)和四氫呋喃(5mL)的溶液中，添加亞硝酸鈉(143mg，2.Q8mmo1)。在攪拌10分鐘之后，添加上述甲雁(340mg，0.051mmo1)。在1小時(shí)之后，允許反應(yīng)物回升到室溫并攪拌一整夜。將暗栗色混合物過(guò)濾并用乙酸(3x5mL)、乙酸乙酯(2xl0mL)和己烷U0mL)洗滌固體。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上在30C下濃縮該濾液然后在真空下干燥一整夜。用乙酸乙酯U5mL)將該殘留物制漿、沉積并潷析。重復(fù)該過(guò)程。然后添加己烷U0mL)。將產(chǎn)物過(guò)濾并干燥一整夜而獲得所需的栗色tet鹽(260mg，75%)。13CNMR(400MHz，DMS0-d6):5129,128，126,123，121,119，115，114，112，108，105，101，98，66，63,57，51，22NMR(400MHz，DMSO-d6):58.32(m，1H)，8.02(m，4H)，7.87(d,J=1.8Hz，lHz)，7.78(m，3H)，7.66(d,8.2Hz，1H),7.47(t，J=8.2Hz,IH)，7.33(d，J-8.2Hz，lH)，6.28(s，2H)，4.13(s，3H)，3.15(m，2H)，2.85(s，9H)，1.87(m，2H)。ESI-MS:m/z298(100%，M2+)，709(20。/。，M十+TFA)，實(shí)施例65-[4-(3-三曱基銨)丙氧基-3-甲氧基-苯基]-3-[2-(3-三甲基銨)丙氧基-苯基]-2-(5-氯-4-二氟曱基-噻唑-2-基)-2H-四唑二溴代亞硝酸鹽的制備使4-羥基-3-甲氧基苯甲醛與溴化3-溴代丙基三甲基銨反應(yīng)以引入另一個(gè)三甲基銨丙氧基取代基。使該產(chǎn)物與5-氯-4-二氟甲基-2-肼基-噻唑起反應(yīng)以產(chǎn)生腙。該腙與如實(shí)施例1所述的溴化3-(2-氨基苯氧基)丙基三甲基銨起反應(yīng)而產(chǎn)生甲腯，將該曱艚轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的四唑鹽。在與實(shí)施例1中所使用的相同的條件下用溴化3-溴代丙基三甲基銨(8.8g，34隱o1)將4-羥基-3-曱氧基-苯甲醛(香草醛，Aldrich，4.56g，30mmo1)烷基化以制備通過(guò)以下光語(yǔ)性能鑒定的灰白色產(chǎn)物(9.73g，97%)。13C腿(400MHz，DMS0-d6):5192.5，155,150，130,125.75,112.6，110，66.5，63.4，56，25.5。力腿(400MHz,DMS0-d6):59.88(s，1H)，7.58(dd，J=8.2Hz，J=l.9Hz，1H),7.41(d，J=l.9Hz，1H)，7.22(d，J=8.2Hz，1H)，4.35(t，J=6.4Hz，2H)，3.49(m，2H)，3.14(s，9H)，2.30(m，2H)。ESI-MS:m/z252.2(100%，M+)。向上述烷基化的苯甲醛(6.8g，20.5mmol)和5-氯-4-二氟甲基-2-肼基-參唑(Bayer，3.72g，18.6mmo1)在MeOH(60mL)中的漿料中添加乙酸(0.55mL)。在5分鐘之后該漿料幾乎溶解。在80。C下加熱所得的混合物一整夜。在冷卻反應(yīng)物到室溫之后，將該溶液緩慢地添加到EtOAc(650mL)中。形成淡灰色沉淀。攪拌該混合物30分鐘。將固體過(guò)濾并用EtOAc和己烷洗滌。將該淡灰色產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至淡黃色的瓶子中并在真空下干燥一整夜而獲得通過(guò)以下性能鑒定的所需腙(8.7g，87%)。19FNMR:(376MHz，DMSO-d6):5111.08(d，J-47Hz)，"CNMR(400MHz，DMSO-d》:5143，121，114，109，108.5，66，63，55，53，39,22。力NMR(400MHz，DMSO-cU:12.37(s，1H)，7.29(d，J-l.9Hz，1H)，7.19(dd，J=10Hz，J-l.8Hz，1H)，7.06(tJ=7.7Hz，1H)，7.18(mm，1H)，6.95(t，JHF=47，1H)，4.09(t，J=6.1Hz,2H)，3.83(s，3H)，3.47(m，2H)，3.47(m，2H),3.29(s,9H)，2.50(m，2)，2.20(m，2H)。ESI-MS:m/z433.1(簡(jiǎn)，M+)。在與實(shí)施例l相似的條件下使上述腙(7.08g，13.86mmo1)與實(shí)施例l的苯胺衍生物(6g,20.76mmo1)起反應(yīng)而獲得通過(guò)以下光語(yǔ)性能鑒定的深藍(lán)色甲艚(8.56g，76%)。19FNMR:(376MHz，DMS0-d6):5177.77(d，J=59.2Hz)13C麗R(400MHz,DMS0-d6):5153，148.98，148.63，144.5，136.5，132.73，132.74，127，121.59，119.53，115.54，113.96，113.58，110.98，108.92，66.10，65.79，62.77，55.54，52.15，22.45，22.25。丄H纖(400MHz,DMSO-d6):5:11.78(brs，1H)，8.03(dd，J=8.lbHz，J=l.5Hz，1H)，7.56(m，IH)，7.52(dt，J-8.5Hz，J=2Hz，1H)，7.50(d，J-2Hz，1H)，7.35(dd，J=8.5Hz，J=lHz,1H)，7.30(d，J=7.9Hz，1H)，7.18(mm，lH)，7.17(t，JHF=59.2，1H)，4.35(t，J=5.8Hz，2H)，4.13(t，J-6.lHz，2H)，3.88(s，3H)，3.55(m，2H)，3.50(m，2H),3.14(s，9H),3.07(s，9H)，2.50(m，2H)，2.30(m，2H)。ESIMS:m/z652.2(45%，M+)，326.8(100%，M+)。在與實(shí)施例1中所使用的相似的條件下將上述曱滯(2.44g,3mmo1)轉(zhuǎn)變成四唑鹽，不同之處在于在40匸下加熱該反應(yīng)混合物15小時(shí)。通過(guò)以下光譜性能鑒定該產(chǎn)物。13CNMR(100MHz，DMSO-d6):5136.7,128.5，121.9，121.8，114.5，113.5，110.2,108.1，105.7，66.7，66.1，62.5，62.1，56.1，52.1，51.8，21.8,21.2。力腿(400MHz,DMSO-d6):58.06(dd，J=8.lHz，J-l.5Hz，lH)，7.93(m，8H)，7.77(d，J=2Hz，1H)，7.53(d，J=8.6Hz，1H)，7.38(t，J=8.5Hz，2H)，7.26(d，J=52.2Hz，1H),4.23(t，J=6H，2H)，4.17(t，J=6.1Hz，2H)，3.94(s，3H)，3.53(m，2H)，3.32(m，2H)，3.14(s，9H),3.01(s，9H),2.26(m，2H)，2.03(m，2H)，ESIMS:m/z652.2(45%,M+)，326.8(100%，M+)，326.8(100%，M2+)。實(shí)施例75-[4-(3-三甲基銨)丙氧基-3-曱氧基-苯基]-3-[2-(3-三曱基銨)丙氧基-苯基]-2-(6-乙氧基-苯并噻唑-2-基)-2H-四唑二溴代亞硝酸鹽的制備使6-乙氧基-2-肼基-苯并噻唑與實(shí)施例6中制備的烷基化苯甲醛起反應(yīng)以形成腙，然后使該腙與實(shí)施例1中制備的取代的苯胺起反應(yīng)以制備甲腯。將該曱腯轉(zhuǎn)變成等同的四唑鹽。在與實(shí)施例6相似的條件下使6-乙氧基-2-肼基-苯并噻唑(Acros，4.62g，22mmol)與4-(3-三甲基銨丙氧基)-3-甲氧基-苯甲醛起反應(yīng)而獲得通過(guò)以下性能鑒定的淡灰色產(chǎn)物(10.23g，95%)。13CNMR(400MHz，DMSO-d6):5165.58，153.82，153.74，149.24，148.96，142.42，128.01，120.16，118.24，113.62，113.54,108.66，106.49，101.33，65.83,63.51，62.86，55.32，52.16，22.51，14.6。^腿(400MHz，DMS0-d6):511.98(brs，1H)，8.03(s，1H)，7.38(d，J=2.2Hz，lH)，7.34(d，J=8.7Hz，1H)，7.32(d，J=l.8Hz，1H),7.20(dd，J-8.4Hz，J=l.8Hz，1H)，7.07(d，J-8.4Hz，1H)，6.89(dd，J=8.7Hz，J=2.5Hz，lH)，4.09(t，J=6.1H，2H)，4.03(t，J=7Hz，2H)，3.84(m，3H)，3.49(m，2H)，3.12(s，9H)，2.22(m，2H),1.33(t，J=7Hz)。ESI-MS:m/z561.2(100%,M+).ESI-MS:m/z443.1(78%,M+)，222.1(100%，M+2)。在與實(shí)施例1中所使用的相似的條件下使上面制備的腙(3.6g，6.93mmol)與實(shí)施例1的苯胺(3g，10.38mmol)起反應(yīng)以制備甲艚，不同在于^f吏用吡啶和DMF的3:1混合物作為溶劑，以產(chǎn)生通過(guò)以下光鐠性能鑒定的所需深藍(lán)色產(chǎn)物(3.8g，66%)。13CNMR(400MHz，DMS0—d6):5130.5，123.2，121.8，118.8，116，115.3，114.1，113.8，109.8，106.3，67.1，66.5，63.6，52.5，22.6,22.5，14.2。力NMR(400MHz,DMS0—d6):S11.78(brs，1H)，8.01(brd，J=8Hz，lH)，7.81(brs，1H=8.8Hz，1H)，7.62(m，3H)，7.48(t，J=8Hz，1H)，7.33(d，>8.3Hz，1H),7.16(m，lH)，7.10(dd，J=8.8Hz，J-2.4Hz，1H)，4.38(t，>5.8Hz，2H)，4.13(m，2H)，3.91(s，3H),3.55(m，2H)，3,50(m，2H)，3.13(s，9H)，3.08(s，9H),2.54(m，2H)，2.25(m，2H)，1.38(t，J-7Hz，3H)。ESIMS:m/z776(12%，M++TFA)662.2(45°/。，M+)，331.8(100°/。，M+2)。在與實(shí)施例1中所使用的相似的條件下，將上述甲脂U.24g，1.5mmo1)轉(zhuǎn)變成四唑鹽(2g，>100%)。通過(guò)以下光鐠性能鑒定該產(chǎn)物。"C畫(huà)R(400MHz，DMS0-(U:5136.8，128.1,125.4,121.5，121.4，114，113.5，109.8，106.8，66.6，66.2，64.5,62.5，62.2,56.1，52.2，52.1,22.1，21.5,13.5。力醒(400MHz，DMS0-d6):58.04(dd，J=8Hz，J=l.5Hz，1H)，7.95(m，4H)，7.78(d，J-2Hz，3H)，7.54(d，J=8.5Hz，1H)，7.40(t，J=7.8Hz，1H)，7.38(d，J=8.6Hz，lH)，4.23(t,J=6.1H，2H),4.1(q，J=8Hz，2H)，4.12U，2H)，3.96(s，3H)，3.53(m，2H)，3.50(m,2H)，3.18(m，2H)，3.15(s，9H)，2.92(2，9H),2.30(m，2H)，1.89(m，2H)，1.40(t，J=7Hz，2H)。ESIMS:m/z220.8(100%，M+3)。實(shí)施例85-[4-(3-三曱基銨)丙氧基-3-甲氧基-苯基]-3-[2-(3-三曱基銨)丙氧基-苯基]-2-(6-溴苯并噻唑-2-基)-2H-四唑二溴代亞硝酸鹽的制備使用6-溴-2-肼基-苯并噻唑代替實(shí)施例8中的6-乙氧基-2-肼基-苯并噢唑以制備合適的腙。然后，在相同的條件下處理該腙而產(chǎn)生所需的甲脂(44%總)。^NMR(400MHz,DMSO-d6)，57.90(dd，J=8.1Hz，J=l.7Hz，1H)，7.58(dt，J=8.2Hz，J=l.7Hz，1H)，7.39(d，J-8.2Hz，1H)，7.15(d，J=l.7Hz，1H),4,25(t，J=6Hz，2H)，3.45(m，2H)，3,11(s，9H)，2.48(m，2H)，2.25(m，2H)。ESI-MS:m/z249(100%，M2+)。在與實(shí)施例8相同的條件下處理該甲腯(322mg，0.375mmo1)以形成四唑鹽，不同之處在于在40"C下加熱反應(yīng)物一整夜以產(chǎn)生所需的四唑鹽(478mg，>100%)。13CNMR(100MHz，DMSOd6):5151，139.45，134.71，125.14，121，115.39，66.59，62.84，52.39，22.48:57.90^NMR(400MHz，DMS0-d6)，8.74(d，J=2.lHz，1H)，7.95(m,5H)，7.78(d，J=2.lHz，1H)，7.51(d，J=7.8Hz，1H)，7.39(m，2H)，4.2U，2H)，4.08(m，2H)，3.96(s，3H)，3.53(m，2H),3.19(m，2H)，3.11(s，9H)，2.91(s，9H),2.24(m，2H),1.87(m，2H)。ESI-MS:m/z233(100%,M3+)。實(shí)施例9三溴化5-[4-(3-三甲基銨)丙氧基-3-甲氧基-苯基]-3-[2-(3-三曱基銨)丙氧基-苯基]-2-(6-乙氧基-苯并噻唑-2-基)-2H-四唑鹽的制備在室溫下，向甲廂(得自實(shí)施例7，1.18g，1.43mmol)在乙腈(15niL)中的漿料中添加正溴代琥珀酰亞胺(300mg，1.69腿o1)。在1小時(shí)之后，所有物質(zhì)溶解。在3小時(shí)之后，橙色沉淀物形成。攪拌反應(yīng)物一整夜。將沉淀物過(guò)濾并用乙腈(3x5mL)洗滌。在真空下干燥所得的橙色產(chǎn)物一整夜。(1.07g，83"13CNMR(100MHz，DMSOd6):5151，139.45，134.71，125.14，121，115.39，66.59，62.84，52.39，22.48^NMR(400MHz,DMSO—d6):58.08(d，J=8.2Hz，1H)，8.04(d，J=I.7Hz，1H)，7.94(m，3H)，7.79(bs，lH)，7.55(d，J-8.2Hz，1H)，7.40(d，J=8.2Hz，1H),7.30(dd，J=8.2Hz，J=I.7Hz，1H)，4.23(t，J=6Hz，2H)，4.15(q，J=8.2Hz，2H)，4.10(m，2H)，3.95(s，3H)，3.57(m，2H),3.22(m，2H)，3.15(s，9H),2.95(s，9H)，2.30(m，2H)，1.90(m，2H)，1.4(t，J-8.2Hz)。ESI-MS:m/z221(100%，M3+)。實(shí)施例1-9中制備的四唑鹽的溶解性如下測(cè)定在室溫下將0.2M磷酸鹽緩沖液(pH值~7.5)添加到已知量的每個(gè)化合物中直到該化合物溶解。結(jié)果中表1中示出，其中將它們與WST-4(DojindoLaboratories的瘞唑基四唑鹽)、HTC-045(BayerCorp.的漆喳基四唑鹽)和改性的HTC-045(其中甲氧基被3-磺酸酯丙氧基替代)比較(參見(jiàn)圖3)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>雖然通過(guò)將三烷基銨丙氧基取代基添加到噻唑基四唑鹽上而實(shí)現(xiàn)了四唑鹽的溶解性的改進(jìn)，但是基于現(xiàn)有技術(shù)這種改進(jìn)是不易預(yù)知的?，F(xiàn)有技術(shù)將預(yù)知將3-磺酸酯丙氧基添加到該分子中將提高該分子的水溶性。DojindoLaboratories使用了將磺酸基引入分子中。然而，3-磺酸酯丙氧基替代與四唑環(huán)連接的苯基上的曱氧基(參見(jiàn)改性的HTC-045，圖3)導(dǎo)致比HTC-045(21mM)低的溶解度(8mM)。因此在我們的分子結(jié)構(gòu)中，這種現(xiàn)象不明顯。我們發(fā)現(xiàn)不同的極性基團(tuán)將改進(jìn)水溶性。然而，觀察到其它出乎意料的效果，將在下面論述這些效果。三甲基銨丙氧基替代甲氧基使溶解度從21mM(HTC-045)增加到33mM(實(shí)施例1)并且添加第二個(gè)三曱基銨丙氧基(實(shí)施例6)顯著地將溶解度增加到181mM。然而，當(dāng)用四氟硼酸根平衡離子替代硝酸根時(shí)，溶解度顯著地降低。(比較實(shí)施例2與實(shí)施例1)。當(dāng)將三曱基銨丙氧基改變?yōu)槎趸@丙氧基時(shí)，實(shí)施例1中的四唑鹽的溶解度降低(實(shí)施例3)。出人意料地，在其中僅包括一個(gè)三甲基銨丙氧基的實(shí)施例4(167mM)中也發(fā)現(xiàn)了由于添加兩個(gè)三曱基銨丙氧基(實(shí)施例6)獲得的溶解度的顯著增加，但是取代的瘞唑基被未取代的苯并噢唑基替代。然而，再添加噻唑基發(fā)現(xiàn)具有差的溶解度(5mM)，如其中使用取代的萘基噻唑基的實(shí)施例5所示。在另一個(gè)出乎意料的結(jié)果中，如實(shí)施例7所示，添加兩個(gè)三甲基銨基團(tuán)和一個(gè)苯并噻唑基(它們都導(dǎo)致溶解度方面的顯著增加)看來(lái)似乎沒(méi)有互補(bǔ)效果。實(shí)施例7具有167mM的溶解度。當(dāng)實(shí)施例7的苯并噻唑基上的乙氧基被實(shí)施例8中的溴基替代時(shí)，獲得溶解度的另一個(gè)顯著增加。溶解度從169mM增加290mM，在此示出的最高值。當(dāng)實(shí)施例7中的平衡離子(亞硝酸根離子)被實(shí)施例9中的溴離子替代時(shí)，發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的結(jié)果。溶解度從169mM增加到260mM?？磥?lái)包括溴似乎是改進(jìn)這類(lèi)四唑鹽的溶解度的有效手段。制備并測(cè)試它們?nèi)芙舛鹊幕衔锞哂猩晕⒉煌墓庾V性能。表1中的由四唑鹽形成的并測(cè)試了溶解度的每種曱脂的吸收語(yǔ)用HewlettPackardModel8453二極管陣列UV可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)量。在lOOmM磷酸鉀緩沖物中制備100jaM四唑鹽的溶液。在添加5倍過(guò)量的抗壞血酸鹽以將tet鹽轉(zhuǎn)化成它們的曱膽之后，測(cè)量甲贗光語(yǔ)。結(jié)果在圖5a和b中給出。如此前指出，來(lái)自噻唑基四唑鹽的甲腯旨在吸收波長(zhǎng)大于640nM的光，并且平緩響應(yīng)是希望的。為了對(duì)比，已經(jīng)在圖5a和b中繪制了HTC-045和WST-4的吸光率曲線(xiàn)。WST-4在大約560nM的范圍中表現(xiàn)出峰吸光率，而HTC-045在大約460nM-660nM之間顯示較平緩的吸光率。然而，它的溶解度小于WST-4。添加三曱基銨丙氧基改變了光鐠曲線(xiàn)。實(shí)施例l、2、3、4、6、7和8具有比HTC-045低的吸光率，但是曲線(xiàn)在整個(gè)所示的范圍內(nèi)都較平緩。可以看出，包括萘基噻唑基的實(shí)施例5tet鹽不但具有低的溶解度，而且顯示上升的吸光率對(duì)波長(zhǎng)曲線(xiàn)，這表明沒(méi)有與HTC-045或?qū)嵤├?、2、3、4、6、7和8的經(jīng)改性的化合物可比的平緩區(qū)域。實(shí)施例9顯示在400-640nM之間具有較平緩響應(yīng)的光譜曲線(xiàn)并且顯示是高度可溶的。理想地，四唑鹽應(yīng)該產(chǎn)生在寬泛波長(zhǎng)內(nèi)具有高吸光率的甲腯以致當(dāng)分析物起反應(yīng)時(shí)顯示的顏色可以容易且可靠地測(cè)量。因此，較平緩的曲線(xiàn)是非常合乎需要的。從得自經(jīng)測(cè)試的tet鹽的甲腯的溶解度可以看出，它們都(實(shí)施例5可能例外)顯示作為有用的指示劑的前景。實(shí)施例5的四唑鹽是新型化合物并且可以用作指示劑，但是與具有更均勻光譜曲線(xiàn)和更大溶解度的那些相比它可能不是優(yōu)選的。四峻鹽的用途雖然四唑鹽是用于許多應(yīng)用的有用的指示劑，但是它們當(dāng)在用于測(cè)量生物樣品中的分析物的試驗(yàn)條中使用時(shí)是尤其有價(jià)值的。一個(gè)重要的應(yīng)用是測(cè)量血液的葡萄糖含量。試驗(yàn)條通常包含栽體和反應(yīng)物組合物。反應(yīng)物(例如葡糖脫氫酶)和補(bǔ)助因子(例如NAD或PQQ)與生物樣品中的分析物(例如葡萄糖)反應(yīng)并且媒劑(例如PMS或黃遞酶)將該瘞唑基四唑鹽還原成其相應(yīng)的有色的曱脂。所得的顏色通常使用為那種目的而設(shè)計(jì)的測(cè)量計(jì)最精確地測(cè)量。光源(例如LED)將入射光提供到試驗(yàn)條上。通過(guò)光檢測(cè)器測(cè)量從該試驗(yàn)條反射的光并與已經(jīng)起反應(yīng)的分析物的量進(jìn)行關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的噻唑基四唑指示劑提供寬的可從美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,126,275和早先提及的其它文獻(xiàn)中公開(kāi)的指示劑獲得的鐠。但是，如實(shí)施例所示，許多新型噻唑基四唑指示劑與HTC-045相比具有改進(jìn)的溶解性，從而提供更快速的測(cè)試時(shí)間和更精確的結(jié)果。將在以下備選實(shí)施方案中概述本發(fā)明。備選實(shí)施方案A具有以下通式的化合物其中A-平衡離子a=l-3b=0-3X=1-6C烷基或雜烷基R產(chǎn)1-6C烷基R2和R3之一是烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(R,)3-b，或112和R3形成亞曱二氧基R,和Rs之一是卣素并且另外一個(gè)是卣素取代的l-6C烷基，l和Rs中一個(gè)或兩個(gè)是XN+Hb(RJh，或114和Rs連接形式芳族或雜芳族環(huán)或取代的芳族環(huán)或取代的雜芳族環(huán)。備選實(shí)施方案B具有以下通式的備選實(shí)施方案A的化合物其中:入=平衡離子X(jué)-1-6C烷基a=l-3b=0-3R產(chǎn)l-3C烷基R2和R3之一是l-4C烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(IU3—b，或112和113形成亞甲二氧基，R4=CHF2Rf鹵素。備選實(shí)施方案C備選實(shí)施方案B的化合物，其中X是丙基b是0K是曱基R2和R3形成亞甲二氧基mCHF2Rs是Cl。備選實(shí)施方案D備選實(shí)施方案B的化合物，其中X是丙基b是1Ri是甲基l和R3形成亞甲二氧基R4是CHF2Rs是Cl。備選實(shí)施方案E備選實(shí)施方案B的化合物，其中X是丙基b是0Ri是甲基R2是三甲基銨丙基Rs是甲氧基R4是CHF2Rs是Cl。備選實(shí)施方案F具有以下通式的備選實(shí)施方案A的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>其中a=l-3A-平衡離子X(jué):1-6C烷基b=0-3R產(chǎn)1-3C烷基R2和R3中一個(gè)是烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(RJ3—b,或R2和R3形成亞甲二氧基，R4和Rs中一個(gè)是卣素并且另外一個(gè)是卣素取代的l-6C烷基，或R4和Rs是氫R6=1-4C烷氧基，氫或鹵素。備選實(shí)施方案G備選實(shí)施方案F的化合物，其中X是丙基b是0K是曱基R2是三甲基銨丙基R3是甲氧基R"Rs和R6是氫。備選實(shí)施方案H備選實(shí)施方案F的化合物，其中乂是丙基K是甲基b是0R2是三曱基銨丙基R3是甲基IU和R5形式芳環(huán)R6是曱氧基。備選實(shí)施方案I備選實(shí)施方案F的化合物，其中X是丙基b是0^是甲基R2是三甲基銨丙基R3是甲基R4和Rs是氫^是乙氧基。備選實(shí)施方案J備選實(shí)施方案F的化合物，其中X是丙基b是0^是甲基R2是三甲基銨丙基Rs是甲基R^和Rs是氫Rs是溴。備選實(shí)施方案K備選實(shí)施方案A的化合物，其中所述至少一種平衡離子是亞硝酸根、磷酸根、磷酸氫根、磷酸二氫根、硫酸氫根、硫酸根、碳酸氫根、碳酸根、甲烷磺酸根、氟硼酸根、溴離子、氯離子、碘離子或它們的結(jié)合物。備選方法L包含在生物流體中的分析物的測(cè)量方法，所述分析物適合于在反應(yīng)后產(chǎn)生比例性變色，所述方法包括以下措施提供四唑鹽作為指示劑，所述四唑鹽具有以下通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>其中A-平衡離子a-l-3b=0-3X=l-6C烷基或雜烷基R產(chǎn)1-6C烷基R2和R3之一是烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(R！)3—b，或R2和R3形成亞曱R4和Rs之一是卣素并且另外一個(gè)是卣素取代的l-6C烷基，IU和Rs中一個(gè)或兩個(gè)是XN+Hb(Id)3—b，或R4和Rs連接形成芳族或雜芳族環(huán)或取代的芳族環(huán)或取代的雜芳族環(huán)；和二氧基，借助作為指示劑的所述四唑鹽測(cè)定所述分析物在所述生物流體中的濃度。備選方法M備選方法L的方法，其中所述分析物是葡萄糖。備選方法N備選方法M的方法，其中所述生物流體是全血。備選方法0備選方法M的方法，其中所述四唑鹽具有通式(A-),<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>其中.-A-平衡離子X(jué)=l-6C烷基b-0-3R產(chǎn)1-3C烷基l和R3之一是l-4C烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(RJ3—b,或1(2和l形成亞曱二氧基，R4=CHF2R產(chǎn)鹵素。備選方法P備選方法0的方法，其中X是丙基b是ORi是曱基R2和R3形成亞甲二氧基mCHF2Rs是Cl。備選方法Q備選方法0的方法，其中X是丙基b是1Ri是甲基R2和R3形成亞甲二氧基R4是CHF2Rs是Cl。備選方法R備選方法0的方法，其中X是丙基b是0l是曱基R2是三曱基銨丙基R3是曱氧基mCHF2Rs是Cl。備選方法S具有以下通式的備選方法L的方法其中a=l-3A-平衡離子X(jué)=l-6C烷基b=0-3Ri-1-3C烷基R2和R3中一個(gè)是烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb()3—b，或R2和R3形成亞甲二氧基，H和Rs中一個(gè)是卣素并且另外一個(gè)是卣素取代的1-6C烷基，或114和Rs是氫R6=1-4C烷氧基，氫或卣素。備選方法T備選方法S的方法，其中X是丙基b是0l是甲基R2是三甲基銨丙基R3是曱氧基R4、Rs和R6是氫。備選方法U備選方法s的方法，其中x是丙基K是曱基b是0l是三甲基銨丙基R3是曱基R4和Rs形式芳環(huán)Rs是曱氧基。備選方法V備選方法s的方法，其中x是丙基b是0l是甲基R2是三甲基銨丙基R3是甲基^和Rs是氫l是乙氧基。備選方法W備選方法S的方法，其中X是丙基b是0R,是曱基R2是三甲基銨丙基l是曱基^和R5是氫Re是溴。備選方法X備選方法L的方法，其中所述至少一種平衡離子是亞硝酸根、磷酸根、磷酸氬根、磷酸二氬根、疏酸氬根、硫酸根、碳酸氫根、碳酸根、甲烷磺酸才艮、氟硼酸根、溴離子、氯離子、碘離子或它們的結(jié)合物。備選方法Y噻唑基四唑鹽的溶解度的增加方法，所述蓉唑基四唑鹽的噢唑基與四唑環(huán)的第三個(gè)氮原子連接，該方法包括將至少一個(gè)三烷基銨烷氧基作為取代基添加到噻唑基四唑鹽中。備選方法Z備選方法Y的方法，其中所述噻唑基四唑鹽在四唑環(huán)的第三個(gè)氮原子處和碳原子處具有苯基取代基。備選方法AA備選方法Z的方法，其中所述至少一個(gè)三烷基銨烷氧基是三甲基銨丙氧基。備選方法BB備選方法Z的方法，其中所述至少一個(gè)三烷基銨烷氧基是所述苯基的取代基。備選方法cc備選方法z的方法，其中至少一個(gè)三烷基銨烷氧基是所迷?xún)蓚€(gè)苯基取代基的取代基。備選方法DD備選方法Z的方法，其中所述噻唑基是苯并噢唑基。備選方法EE備選方法Z的方法，其中所述漆唑基四唑鹽具有亞硝酸根、磷酸根、磷酸氫根、磷酸二氫根、硫酸氫根、硫酸根、碳酸氫根、碳酸根、曱烷磺酸根、氟硼酸根、溴離子、氯離子、碘離子或它們的結(jié)合物的平衡離子。備選方法FF備選方法EE的方法，其中所述平衡離子是溴代亞硝酸根、二溴代亞硝酸根或三溴離子。權(quán)利要求1.具有以下通式的化合物其中A＝平衡離子a＝1-3b＝0-3X＝1-6C烷基或雜烷基R1＝1-6C烷基R2和R3之一是烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(R1)3-b，或R2和R3形成亞甲二氧基，R4和R5之一是鹵素并且另外一個(gè)是鹵素取代的1-6C烷基，R4和R5中一個(gè)或兩個(gè)是XN+Hb(R1)3-b，或R4和R5連接形成芳族或雜芳族環(huán)或取代的芳族環(huán)或取代的雜芳族環(huán)。2.權(quán)利要求1的化合物，具有以下通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中A-平衡離子X(jué)-卜6C烷基a-l-3b-0-3R產(chǎn)1-3C烷基l和l中一個(gè)是1-4C烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(RJ3—b,或l和R形成亞曱二氧基，R4=CHF2Rs-鹵素。3.權(quán)利要求2的化合物，其中X是丙基b是0R,是甲基R2和R3形成亞甲二氧基mCHF2Rs是Cl。4.權(quán)利要求2的化合物，其中X是丙碁b是1Rt是甲基R2和R3形成亞甲二氧基R^是CHF2Rs是Cl。5.權(quán)利要求2的化合物，其中X是丙基b是0Ri是甲基l是三甲基銨丙基l是甲氧基R4是CHF2Rs是Cl。6.權(quán)利要求1的化合物，具有以下通式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>R6R5」其中a-l-3A-平衡離子X(jué)-1-6C烷基b+3R產(chǎn)1-3C烷基R2和R3中一個(gè)是烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(^)3-b，或R2和R3形成亞甲二氧基，R4和Rs中一個(gè)是卣素并且另外一個(gè)是卣素取代的l-6C烷基，或R4和Rs是氫R6=1-4C烷氧基，氫或囟素。7.權(quán)利要求6的化合物，其中X是丙基b是0K是甲基R2是三曱基銨丙基Rs是甲氧基R,、Rs和R6是氫。8.權(quán)利要求6的化合物，其中叉是丙基K是曱基b是0R2是三曱基銨丙基l是甲基114和Rs形式芳環(huán)l是甲氧基。9.權(quán)利要求6的化合物，其中X是丙基b是0Ri是曱基R2是三甲基銨丙基R3是甲基L和Rs是氫R6是乙氧基。10.權(quán)利要求6的化合物，其中X是丙基b是0R2是三甲基銨丙基R3是曱基Fl和Rs是氫Re是溴。11.權(quán)利要求1的化合物，其中所述至少一種平衡離子是亞硝酸根、磷酸根、磷酸氫根、磷酸二氫根、硫酸氫根、硫酸根、碳酸氫根、碳酸根、曱烷磺酸根、氟硼酸根、溴離子、氯離子、碘離子或它們的結(jié)合物。12.包含在生物流體中的分析物的測(cè)量方法，所述分析物適合于在反應(yīng)后產(chǎn)生比例性變色，所述方法包括以下措施提供四唑鹽作為指示劑，所述四唑鹽具有以下通式其中A-平衡離子a二l一3b-0-3X=1-6C烷基或雜烷基R嚴(yán)1-6C烷基R2和R3之一是烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(R,)3—b，或R2和R3形成亞甲二氧基，R4和R5之一是離素并且另外一個(gè)是囟素取代的l-6C烷基，L和Rs中一個(gè)或兩個(gè)是XN+Hb(RJ3—b，或R4和Rs連接形成芳族或雜芳族環(huán)或取代的芳族環(huán)或取代的雜芳族環(huán)；和借助作為指亍劑的所述四唑鹽測(cè)定所述分析物在所述生物流體中的濃度。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述分析物是葡萄糖。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述生物流體是全血。15.權(quán)利要求13的方法，其中所述四唑鹽具有通式其中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>A-平衡離子X(jué)-1-6C烷基a=l-3b=0-3R產(chǎn)l-3C烷基l和R3中一個(gè)是1-4C烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(RJ3_b，或R，和R3形成亞曱二氧基，R4=CHF2R產(chǎn)鹵素。16.權(quán)利要求15的方法，其中x是丙基b是0Ri是曱基R2和R3形成亞甲二氧基R4是C服2Rs是Cl。17.權(quán)利要求15的方法，其中X是丙基b是1!^是甲基R2和R3形成亞甲二氧基R4是CHF2Rs是Cl。18.權(quán)利要求15的方法，其中X是丙基b是0^是甲基R2是三甲基銨丙基R3是甲氧基R4是CHF2Rs是Cl。19.權(quán)利要求12的方法，具有以下通式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中a=l-3A-平衡離子X(jué)-1-6C烷基b=0-3R產(chǎn)1-3C烷基R2和R3之一是烷基并且另外一個(gè)是XN+Hb(R:)3-b，或R2和R3形成亞甲二氧基，R4和R5之一是卣素并且另外一個(gè)是閨素取代的1-6C烷基，或R4和R;是氫K-4C烷氧基，氫或鹵素。20.權(quán)利要求19的方法，其中X是丙基b是0Ri是曱基R2是三甲基銨丙基R3是曱氧基R4、Rs和Re是氫。21.權(quán)利要求19的方法，其中X是丙基K是曱基R5R6、R4'b是0R2是三甲基銨丙基R3是甲基R4和R5形成芳環(huán)R6是甲氧基。22.權(quán)利要求19的方法，其中X是丙基b是0H是甲基R2是三曱基銨丙基R3是甲基R4和Rs是氫Rs是乙氧基。23.權(quán)利要求19的方法，其中X是丙基b是0K是曱基R2是三曱基銨丙基R3是甲基R4和R;是氫Rs是溴。24.權(quán)利要求12的方法，其中所迷至少一種平衡離子是亞硝酸根、磷酸根、磷酸氫根、磷酸二氫根、硫酸氫根、硫酸根、碳酸氫根、碳酸根、甲烷磺酸根、氟硼酸根、溴離子、氯離子、碘離子或它們的結(jié)合物。25.噻唑基四唑鹽的溶解度的增加方法，所述噻唑基四唑鹽的瘞唑基與四唑環(huán)的第三個(gè)氮原子連接，該方法包括將至少一個(gè)三烷基銨烷氧基作為取代基添加到噻唑基四唑鹽中。26，權(quán)利要求25的方法，其中所述噻唑基四唑鹽在四唑環(huán)的第三個(gè)氮原子處和碳原子處具有苯基取代基。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述至少一個(gè)三烷基銨烷氧基是三甲基銨丙氧基。28.權(quán)利要求26的方法，其中所述至少一個(gè)三烷基銨烷氧基是所述苯基的取代基。29.權(quán)利要求26的方法，其中至少一個(gè)三烷基銨烷氧基是所述兩個(gè)苯基取代基的取代基。30.權(quán)利要求25的方法，其中所述噻唑基是苯并噻唑基。31.權(quán)利要求25的方法，其中所述噻唑基四唑鹽具有亞硝酸根、磷酸根、磷酸氫根、磷酸二氫根、硫酸氫根、硫酸根、碳酸氫根、碳酸根、甲烷磺酸根、氟硼酸根、溴離子、氯離子、殃離子或它們的結(jié)合物的平衡離子。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述平衡離子是溴代亞硝酸根、二溴代亞硝酸根或三溴離子。全文摘要在水溶液中具有增加的溶解度的噻唑基四唑鹽具有在與四唑環(huán)連接的苯基環(huán)上的烷基銨烷氧基取代基，優(yōu)選三甲基銨丙氧基取代基。在水溶液中具有增加的溶解度的噻唑基四唑鹽具有在與四唑環(huán)連接的苯基環(huán)上的烷基銨烷氧基取代基，優(yōu)選三甲基銨丙氧基取代基，例如上面所示通式(A-)_a的化合物。文檔編號(hào)C12Q1/32GK101115750SQ200680004439公開(kāi)日2008年1月30日申請(qǐng)日期2006年1月13日優(yōu)先權(quán)日2005年1月14日發(fā)明者J·J·蘭蒂,J·P·阿爾巴瑞拉,K·L·瑪弗特,S·W·菲爾曼申請(qǐng)人:拜爾保健有限公司