專利名稱：血鉛濃度的測定方法及血鉛診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥、食品、環(huán)境等領(lǐng)域內(nèi)對(duì)血鉛濃度的檢測，尤其涉及利用酶比色法及Ehrlich化學(xué)反應(yīng)技術(shù)測定血鉛濃度的方法，以及由此制得的血鉛診斷試劑盒，屬于血鉛濃度分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
四乙鉛[Pb(C2H5)4]是一種有機(jī)鉛化合物，為無色油狀液體，有芳香氣味，易揮發(fā)，性極毒，且易為皮膚吸收。常與有機(jī)鹵化物(溴化乙和油溶性染料)配成汽油抗震添加劑(乙基液或鉛水)，它是城市環(huán)境的重要污染源。
血鉛和尿鉛的測定方法主要有雙硫腙絡(luò)合比色法、原子吸收光譜法和溶出伏安法三類。
雙硫腙絡(luò)合比色法是早期廣泛使用的一種測鉛方法，該法繁雜、費(fèi)時(shí)，需要大量潔凈玻璃器皿，且易受錫、鉍和鉈的干擾，所用試劑氰化鉀和氯仿毒性大，對(duì)人體健康有影響。
原子吸收光譜法包括溶劑萃取-火焰原子吸收光譜法，石墨爐無焰原子吸收光譜法、Delve杯原子吸收光譜法和氫化物發(fā)生-原子吸收光譜法。其中，溶劑萃取-火焰原子吸收光譜法是經(jīng)典的原子吸收法，靈敏度不理想；Delve杯原子吸收光譜法(DC-AAS)測定，樣品不需作灰化處理，該法的優(yōu)點(diǎn)是樣品用量小，且由于減少了樣品前處理步驟，分析速度加快，此外測試費(fèi)用相對(duì)較低。石墨爐無焰原子吸收光譜法突出優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，樣品不需消化，只需用基體改進(jìn)劑作適當(dāng)稀釋后即可直接上儀器測定。GFAAS應(yīng)用最廣，并被推薦為B-pb的參考方法。氫化物發(fā)生-原子吸收光譜法是先將樣品加混合消化液，用電熱板或微波爐消化后，采用氫化發(fā)生裝置與WFX-ID型原子吸收光譜儀聯(lián)用測定尿鉛。
溶出伏安法陽極溶出伏安法ASV是預(yù)先將被測物血鉛或尿鉛在恒定負(fù)電位下電解富集在工作電極上，即將離子鉛還原為元素鉛在預(yù)先設(shè)定的電積時(shí)間后，將電極電位向反方向快速掃描，電位變化由負(fù)到正。該法的靈敏度較差。微分電位溶出法是一種新電化學(xué)技術(shù)，用于測定生物樣品中鉛時(shí)，與陽極溶出伏安法一樣，需要富集和溶出，只是所用方法不同。生物體液中鉛測定法，除上述幾種外，還有穩(wěn)定性同位素稀釋氣相色譜-質(zhì)譜等，但所用儀器價(jià)格昂貴，且需要配備訓(xùn)練有素的專業(yè)人員。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種測定血鉛濃度的方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的血鉛診斷試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，一種酶比色法及Ehrlich化學(xué)反應(yīng)技術(shù)測定血鉛濃度的方法，采用以下步驟進(jìn)行首先，將測定的樣品與含有氨基酮戊酸、Ehrlich試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，
卟吩膽色素原+Ehrlich試劑————→卟吩膽色素然后，將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測555nm處直接反應(yīng)卟吩膽色素含量高低的光吸收程度；通過比較受鉛抑制血漿中的5-氨基酮戊酸脫水酶活性和再激活的受鉛抑制的5-氨基酮戊酸脫水酶活性，測出血鉛濃度的大小。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明血鉛診斷試劑盒可以是單劑，由以下成分組成緩沖液 40～200mmol/L，穩(wěn)定劑 5～100g/ml，
氨基酮戊酸 1～50mmol/L，還原型谷胱甘肽 1～50mmol/L，Ehrlich試劑。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將以上單劑中的各種成分進(jìn)行組合配制成雙劑，比如

雙劑的配方不僅僅限于上述表中所列，其中試劑I的成分還原型谷胱甘肽，可以放在試劑II；試劑II中的氨基酮戊酸也可以放到試劑I，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II當(dāng)中通常加入穩(wěn)定劑，濃度在0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v范圍之內(nèi)。
Ehrlich試劑是由1g的對(duì)-2甲胺基苯甲醛溶于42ml的冰醋酸配制而成，使用前加入8ml的濃度為700g/ml的過氯酸。
用作穩(wěn)定劑的物質(zhì)可以是硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一種。
研究表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑還是雙劑，如下配方成分關(guān)系的診斷/檢測試劑盒較為理想，也是本發(fā)明的優(yōu)選方案(1)激活5-氨基酮戊酸脫水酶試劑緩沖液100mmol/L，穩(wěn)定劑2mol/L，氨基酮戊酸5mmol/L，還原型谷胱甘肽50mmol/L，Ehrlich試劑。
(2)不激活5-氨基酮戊酸脫水酶活試劑緩沖液100mmol/L，穩(wěn)定劑2mol/L，氨基酮戊酸5mmol/L，Ehrlich試劑。
本發(fā)明利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及Ehrlich化學(xué)反應(yīng)技術(shù)，計(jì)量通過酶促反應(yīng)生成卟吩膽色素所導(dǎo)致在555nm波長處吸光度的上升，得以測定血鉛濃度的方法。同時(shí)，本發(fā)明還給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的血鉛診斷試劑盒，采用該試劑不僅可以在可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行血鉛濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明技術(shù)方案的突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步主要表現(xiàn)在(1)本發(fā)明完全利用酶比色法及Ehrlich化學(xué)反應(yīng)技術(shù)測定血鉛濃度，測試結(jié)果準(zhǔn)確；(2)參與反應(yīng)的成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測試過程精確度高；(3)該方法簡便、易操作，可快速得到檢測結(jié)果，而且反應(yīng)是在緩沖液條件下進(jìn)行，不會(huì)污染環(huán)境；(4)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用；(5)應(yīng)用本發(fā)明提供的測定方法可以制成液態(tài)試劑、干粉試劑等多種形式的試劑，用于測定各種樣品中血鉛濃度的大??；(6)本發(fā)明提供的液態(tài)血鉛診斷/檢測試劑盒，穩(wěn)定性好，很好地保證了應(yīng)用測試效果。配成雙劑以后，能夠進(jìn)一步降低各種成分之間的交叉影響，檢測結(jié)果更加可信，試劑更為穩(wěn)定，可以長時(shí)間儲(chǔ)存。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明一種血鉛濃度的測定方法及血鉛診斷試劑盒，鉛會(huì)抑制血漿中5-氨基酮戊酸脫水酶(aminolevulinate dehydratase；EC4.2.1.24)的活性；還原型谷胱甘肽能移走和5-氨基酮戊酸脫水酶結(jié)合的鉛，從而重新激活5-氨基酮戊酸脫水酶的活性；因此比較血漿中受激活及不受激活(試劑中含還原型谷胱甘肽及不含還原型谷胱甘肽)5-氨基酮戊酸脫水酶的活性可以測算出血漿中鉛的含量。應(yīng)用5-氨基酮戊酸脫水酶聯(lián)合Ehrlich反應(yīng)終點(diǎn)比色法。5-氨基酮戊酸脫水酶酶解氨基酮戊酸反應(yīng)產(chǎn)生卟吩膽色素原，再通過聯(lián)合Ehrlich試劑的作用，最后生成卟吩膽色素，從而可以通過可見光分析儀器，在555nm波長處，測定卟吩膽色素含量高低的光吸收大??；通過測量555nm處吸光度上升的程度，比較血漿中受激活及不受激活(試劑中含還原型谷胱甘肽及不含還原型谷胱甘肽)5-氨基酮戊酸脫水酶的活性可以測算出血漿中鉛的濃度大小。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。這些例子僅是一些應(yīng)用范例，不能理解為對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍的一種限制。
實(shí)施例一按以下成分和用量配制血鉛診斷試劑盒磷酸鹽緩沖液100mmol/L，硫酸銨 80g/ml，氨基酮戊酸 5mmol/L，還原型谷胱甘肽 50mmol/L。
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，設(shè)定全程反應(yīng)時(shí)間10分鐘；樣品加入上述試劑反應(yīng)5分鐘后，加入Ehrlich試劑再反應(yīng)5分鐘，測試主波長555nm，測試副波長700nm，被測血鉛樣品與試劑的體積比為1∶25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為終點(diǎn)法，檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和激活試劑(含還原型谷胱甘肽)及不激活試劑(不含還原型谷胱甘肽)后，分別使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終分別將反應(yīng)物置于生化分析儀下，比較二種試劑在檢測主波長555nm吸光度上升的程度差異，可以測算出血鉛的濃度大小。
實(shí)施例二(雙劑)按以下成分和用量配制血鉛診斷試劑盒試劑I——磷酸鹽緩沖液100mmol/L，甘油2mol/L，還原型谷胱甘肽 2mol/L；試劑II——磷酸鹽緩沖液100mmol/L，
丙二醇 50％v/v，氨基酮戊酸 5mmol/L。
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，設(shè)定全程反應(yīng)時(shí)間10分鐘；樣品加入上述試劑I反應(yīng)1分鐘左右，加入上述試劑II再反應(yīng)4分鐘左右，然后加入Ehrlich試劑再反應(yīng)5分鐘，測試主波長555nm，測試副波長700nm，被測血鉛樣品與試劑的體積比例為1∶25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為終點(diǎn)法，檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和激活試劑(試劑I含還原型谷胱甘肽)及不激活試劑(試劑I不含還原型谷胱甘肽)后，分別使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終分別將反應(yīng)物置于生化分析儀下，比較二種試劑在檢測主波長555nm吸光度上升的程度差異，可以測算出血鉛的濃度大小。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好、不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.血鉛濃度的測定方法，包括以下步驟①將測定的樣品與含有氨基酮戊酸、Ehrlich試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，②將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測555nm處直接反應(yīng)卟吩膽色素含量高低的光吸收程度；通過比較受鉛抑制血漿中的5-氨基酮戊酸脫水酶活性和再激活的受鉛抑制的5-氨基酮戊酸脫水酶活性，測出血鉛濃度的大小。
2.血鉛診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩沖液40～200mmol/L，穩(wěn)定劑0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v，氨基酮戊酸1～50mmol/L，還原型谷胱甘肽1～50mmol/L，Ehrlich試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的血鉛診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為硫酸銨、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一種。
4.權(quán)利要求2～3中任意一種血鉛診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑或者雙劑。
5.權(quán)利要求2～3中任意一種血鉛診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒為干粉試劑盒或液體試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種血鉛濃度的測定方法及血鉛診斷試劑盒，應(yīng)用5－氨基酮戊酸脫水酶聯(lián)合Ehrlich反應(yīng)終點(diǎn)比色法，5－氨基酮戊酸脫水酶酶解氨基酮戊酸反應(yīng)產(chǎn)生卟吩膽色素原，再通過聯(lián)合Ehrlich試劑的作用，最后生成卟吩膽色素，通過可見光分析儀器，在555nm波長處，測定卟吩膽色素含量高低的光吸收大?。煌ㄟ^測量555nm處吸光度上升的程度，比較血漿中受激活及不受激活5－氨基酮戊酸脫水酶的活性測算出血漿中鉛的濃度大小。該方法特異性高，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測試結(jié)果精確、準(zhǔn)確性好。診斷試劑盒制成雙劑可減少各成分的交叉影響，保持試劑的穩(wěn)定性。本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1987471SQ200610161228
公開日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司