專利名稱：：具有改善的底物接受性的r-羥腈裂解酶及其用途的制作方法具有改善的底物接受性的R-羥腈裂解酶及其用途生物催化方法對(duì)于化學(xué)工業(yè)已非常重要。在生物催化劑的協(xié)助下進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)在這方面令人感興趣，尤其是在可能利用到酵的在化學(xué)反應(yīng)中優(yōu)領(lǐng)域，^這種:質(zhì)是常見的:質(zhì)。'"''用于利用酶的這些有利性質(zhì)的重要前提是它們能以工業(yè)需要的量被獲得、具有足夠的高反應(yīng)活性、以及在工業(yè)工藝的實(shí)際條件下的穩(wěn)定性。特別令人感興趣的一類手性化學(xué)物質(zhì)是氰醇。氰醇對(duì)于例如合成用于獲得生物活性物質(zhì)(例如活性藥物成分、維生素或擬除蟲菊酯類化合物)的仏羥基酸、O"羥基酮、/3-氨基醇來說是重要的。這些氰醇是通過將氫氡酸加成到酮或醛的羰基上來制備的。己經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)例如(s)-氰醇的手性化合物的工業(yè)生產(chǎn)，這通過制造可獲得的來自Hev從6raw7fe/w&的酶(S)-羥腈裂解酶來實(shí)現(xiàn)，該酶例加被描述于WO97/03204、EP0951561和EP0927766中。但是，存在多種令人感興趣的化學(xué)物質(zhì)，它們的R對(duì)映異構(gòu)體對(duì)于工業(yè)應(yīng)用來說是重要的。迄今為止，僅描述了可以以實(shí)驗(yàn)室規(guī)模使用的、制備大量產(chǎn)物的方法(例如，EP0276375、EP0326063、EP0547655)。這些情況下使用的酶制劑主要是從菴薇科(Rosaceaefamily)的植物獲得那些，例如來自杏仁(尸mmtffl/^gdfl/w)的。目前已被使用的其它/-HNL例如是來自尸A/e6o必t/wflMrei/;n的及-HNL，或者來自亞麻幼苗(丄切"/nt/^tori孤'加"附；丄"HNL)的那些，其作為及-HNL的第一個(gè)基因被克隆，并被表達(dá)于co/z'和尸z'c/u'fl中。文獻(xiàn)中描述的用于獲得具有髙光學(xué)純度的有利反應(yīng)參數(shù)是低溫(例如Persson改al.;EnzymeandMicrobialTechnology30(7)，916-923;2002)、低于4的pH(例如Kragletal.;AnnalsoftheNewYorkAcademyofScience;613(enzymeEng.10)，167-75，19卯)以及使用兩相系統(tǒng)(例如EP0547655)或乳液(例如EP1238094)。不幸的是，大多數(shù)及-HNL在低于4的pH具有少于1小時(shí)的半衰期。EP1223220Al描述了下述重組酶，它們是通過克隆來自/Vi/wusa呷^/"/w的編碼及-HNL同工酶(例如同工酶5(尸aHNL5))的基因，以及通過例如在月c/h'fl/wwtoA^中異源表達(dá)來制備的，從實(shí)施例中明顯可見因?yàn)檩^之其它已知及-HNL在低pH值下大幅增加的穩(wěn)定性而使得它們不同于其它已知及-HNL。已發(fā)現(xiàn)的不利之處在于，底物接受性令人不滿意，因?yàn)樵诖嬖诶缰亟M尸aHNL5時(shí)，一些底物的轉(zhuǎn)化較之存在商業(yè)可獲得的來自杏仁的植物性天然(及)-HNL制劑的情況以顯著更低的反應(yīng)速率進(jìn)行。WO2004/083424描述了這些重組HNL的突變體，其中來自手性中心中丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的組的殘基被其它殘基替換，導(dǎo)致底物接受性增加，特別是針對(duì)被取代的苯甲醛。一個(gè)例子是A111G突變體。但是，該領(lǐng)域中對(duì)于下述酶仍有很大需求，所述酶首先可以以足夠的工業(yè)規(guī)模提供，對(duì)于技術(shù)轉(zhuǎn)化而言具有成本效益，并且其具有改善的底物接受性，由此具有增加的活性、增加的選擇性以及增加的穩(wěn)定性，有鑒于此，因此，本發(fā)明的目的是找到滿足這些要求的來自及o犯c加e科的/-羥腈裂解酶的新穎的突變體。出人意料地，已可能可以通過對(duì)來自及o加ce從科的及-羥腈裂解酶(例如來自EP1223220Al的PaHNL5)的特定突變，來獲得該目的。本發(fā)明因此涉及具有改善的底物接受性、增加的活性以及增加的選擇性的及-羥腈裂解酶，其特征在于在來自科的R-羥腈裂解酶的氨基酸序列中存在任何下述替換a)對(duì)應(yīng)于成熟PaHNL5蛋白的第360位的氨基酸殘基被另-一種無極性氨基酸或中性氨基酸替換，和/或b)對(duì)應(yīng)于成熟PaHNL5蛋白的第225位的氨基酸殘基被另一種極性氨基酸替換，如果合適的話，還可能替換活性中心中或?qū)驅(qū)⒈惶鎿Q的活性中心的疏水通道中的大約1至20個(gè)額外的殘基。本發(fā)明的及-HNL是來自及o卵c郎e科的及-羥腈裂解酶的突變體?？梢允褂脕碜约癘Mceae科的天然及-HNL(例如，來自/Vwmwa附y(tǒng)gda/u5(尸。HNL)、/Vtwmasserari"a(尸sHNL)、/ai/racerasws、(iVHNL)、M。/幼cow/wm/hs等等的R-HNL)或重組R-HNL(例如EP1223220公開的)作為起始基礎(chǔ)來生產(chǎn)本發(fā)明的突變體。優(yōu)選使用的天然及-HNL是來自尸rwmwfl附;;gt/。/iw(PaHNL)、/Vwmwi/o附esft'cfl(PdHNL)或來自尸nz/wtf(PsHNL)的R-HNL。優(yōu)選的重組及-HNL是來自尸n/"t^dome幼'ca的重組及-HNL(PrfHNL)，特別是PdHNLl,以及EP1223220中描述的及-HNL:PflHNLl至PaHNL5，特別優(yōu)選的是重組PflHNL5。此外，待修飾的R-HNL還可以是經(jīng)改造的形式，這是例如通過序列中開頭的(first)—個(gè)或多個(gè)氨基酸的交換、或者通過缺失開頭的一個(gè)或多個(gè)氨基酸、或者通過加入其它的氨基酸(例如GluAlaGluAla)來實(shí)現(xiàn)的，或者通過與其它同工酶融合來實(shí)現(xiàn)的。例如，尸aHNL5可以與尸aHNL4融合。在活性中心中的突變發(fā)生之前的另一個(gè)可能性是將天然信號(hào)序列或植物性信號(hào)序列與另一種信號(hào)序列交換，所述另一種信號(hào)序列例如，來自5!acc/wra加yc幼cereviw'。e的alpha交配因子(alpha-MF)、SaccAfl,o加ycescem;&z'fle轉(zhuǎn)化酶(SUC2)、A'cWfl殺手毒素信號(hào)序列、&淀粉酶、A'c/w'a/wwtoris酸性磷酸酶(PHOl)、i^似eo/itfvw/go^s凝集素(PHA-E)的信號(hào)序列；來自A/;eA^7/itf/^er的葡糖淀粉酶信號(hào)序列(glaA)、來自^y/7erg/〃"jWgw的葡糖氧化酶(GOX)信號(hào)序列、來自p似to^的Secl0信號(hào)序列、來自《/M"era/^CM/fl"is的殺手毒素的28kD亞基的信號(hào)序列、BSA信號(hào)序列等等或其重組信號(hào)序列。.此外，信號(hào)序列可包含點(diǎn)突變。在例如HeijneG.etal.，F(xiàn)EBSLetters244(2)，439-46(1989)、EP19911213、Paiferetal.，BiotecnologiaAplicada10(1)，41-46，(1993)、Raemaekersetal"EuropeanJournalofBiochemistry265(1),394-403(1999)等中描述了合適的信號(hào)序列及其突變體。植物性信號(hào)序列優(yōu)選被來自SaccAaramycescewvz'w'ae的alpha交配因子信號(hào)序列替換。本發(fā)明的及-HNL通過定點(diǎn)誘變來制備，例如按照l'商說明書使用QuikChange(XL)SiteDirectedMutagenesisKit、QuikChangeMultiSiteDirectedMutagenesisKit(來自Stratagene)以及來自Invitrogen(例如，GeneTailorSite-DirectedMutagenesisKit)、Clontach(例如，Site-DirectedMutagenesisTransformerKit)或Promega等的試劑盒來制備或通過例如在CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubeletal.，2004中描述的其它傳統(tǒng)方法來制備。定點(diǎn)誘變試劑盒是用于制備特定突變體的即用型系統(tǒng)，其可商業(yè)出售，例如通過StratageneCloningSystems,LaJolla，CA(USA)出售。在定點(diǎn)誘變中，存在根據(jù)本發(fā)明的如下替換a)對(duì)應(yīng)于成熟PaHNL5蛋白的第360位的氨基酸殘基被另一種無極性氨基酸或中性氨基酸替換，和/或b)對(duì)應(yīng)于成熟PaHNL5蛋白的第225位的氨基酸殘基被另一種極性氨基酸替換。纈氨酸殘基存在于成熟PflHNL5蛋白的第360位，天冬酰胺殘基存在于第225位。對(duì)應(yīng)于其它及-HNL中的該位置的殘基可通過多序列比對(duì)確定。圖1描述了針對(duì)及o加c郎e科的多種已知HNL序列的多序列比對(duì)。在這種情況下，按照沒有信號(hào)序列的方式來描述序列。因此，該位置的纈氨酸殘基或相對(duì)應(yīng)的氨基酸按照木發(fā)明被另一種非極性氨基酸(例如異亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸)或中性氨基酸(例如甘氨酸或色氨酸)替換。亮氨酸、異亮氨酸或甲硫氨酸的替換是優(yōu)選的。該位置的天冬酰胺殘基或者相對(duì)應(yīng)的氨基酸按照本發(fā)明被另一種極性氨基酸(例如絲氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或天冬氨酸)替換。絲氨酸或天冬氨酸的替換是優(yōu)選的。如果合適的話，本發(fā)明的突變體還可以具有1至20處另外的突變，優(yōu)選地，最多15處另外的突變，例如，在活性中心的突變，例如WO2004/083424描述的突變A111G，或者如果合適的話，在導(dǎo)向活性中心的疏水通道中具有例如突變L331A。本文中，活性中心可被定義為底物結(jié)合位點(diǎn)附近大約10-12埃的球形空間。本文的編號(hào)源自成熟的、未經(jīng)修飾的重組及-羥腈裂解酶PaHNL5，但是位置可根據(jù)對(duì)序列的上述修飾(例如，序列的融合、隨機(jī)插入或缺失、截短或延伸)有所變動(dòng)。然后在合適的微生物中，例如在尸z'c/iz'a/wwtorfe、SaccAara/wj;ces。"o附a/a、5fctowacc/wra亭es/o/nfee等等中，進(jìn)行(異源或分泌性)表達(dá)，優(yōu)選地，分泌性表達(dá)。通過標(biāo)準(zhǔn)方法，例如類似于Drevenyetal.;Structure(Cambridge;MA，UnitedStates)9(9)，803-815;2001所述的，對(duì)得到的本發(fā)明的及-HNL加以純化。本發(fā)明的及-HNL突變體適合用于以較之現(xiàn)有技術(shù)更高的轉(zhuǎn)化率、活性和選擇性制備對(duì)映異構(gòu)體純的氰醇。本發(fā)明因此還涉及本發(fā)明的及-HNL突變體用于制備對(duì)映異構(gòu)純的氰醇的用途。特別地，用脂肪族和芳香族醛和酮作為底物，來使用本發(fā)明的/-HNL突變體。本文中醛表示脂肪族、芳香族或雜芳香族的醛。脂肪族醛在本文中表示飽和的或不飽和的脂肪族的醛，可以是直鏈的、帶支鏈的或環(huán)狀的醛。優(yōu)選的脂肪族醛是直鏈或帶支鏈的醛，其具有2至30個(gè)C原子、優(yōu)選4至18個(gè)碳原子，其是飽和的、或者單不飽和或多不飽和的。本文中醛可具有c-c雙鍵和c-c三鍵。此外，脂肪族、芳香族或雜芳香族的醛可以是未取代的，或被在反應(yīng)條件下惰性的基團(tuán)取代，例如，被可選被取代的芳基或雜芳基(例如，苯基、苯氧基或吲哚基)、鹵素、羥基、羥基-<:1-(:5-垸基、d-Cr烷氧基、d-Cs-烷硫基、醚、醇、羧酸酯、硝基或疊氮基取代。優(yōu)選的脂肪族醛的例子是丁醛、2-丁醛、3-苯丙醛、3-苯丙烯醛、3-苯丙炔醛、新戊醛、羥基新戊醛等等。芳香族或雜芳香族醛的例子是苯甲醛和多種被取代的苯甲醛(例如，2-氯苯甲醛、3-氯苯甲醛、4-氯苯甲醛、3，4-二氟苯甲醛、3-苯氧基苯甲醛、4-氟-3-苯氧基苯甲醛、羥基苯甲醛、甲氧基苯甲醛)以及糠醛、甲基糠醛、蒽-9-甲醛(anthracene-9-carbaldehyde)、呋喃-3-甲醛、H引哚-3-甲醛、萘-l-甲醛、苯一.醛、吡唑-3-甲醛、吡咯-2-甲醛、噻吩-2-甲醛、異苯二醛或吡啶甲醛(pyridinealdehyde)、噻吩甲醛(thienylaldehyde)等等。酮是脂肪族、芳香族或雜芳香族酮，其中，羰基碳原子具有不同的取代基。脂肪族酮可以是飽和的或不飽和的，可以是直鏈的、帶支鏈的或環(huán)狀的酮。酮可以是飽和的、或單不飽和或多不飽和的。它們可以是未取代的，或被在反應(yīng)條件下是惰性的基團(tuán)取代，例如被可選被取代的芳基或雜芳基(例如，苯基或吲哚基)、鹵素、醚、醇、羧酸酯、硝基或疊氮基取代。芳香族或雜芳香族酮的例子是苯乙酮、吲哚丙酮等等。根據(jù)本發(fā)明適合使用的醛和酮是已知的，可用傳統(tǒng)方法制備。在存在本發(fā)明的HNL的情況下，用氰化基團(tuán)(cyanidegroup)供體來轉(zhuǎn)化底物。適合作為氰化基團(tuán)的是氫氰酸、堿性金屬氰化物或通式I的氰醇R!R2C(OH)(CN)。在結(jié)構(gòu)式I中，Ri和R2互相獨(dú)立地是氫或未被取代的烴基，或者Ri和R2—起是具有4或5個(gè)C原子的亞烴基，并且R!和R2不同時(shí)是氫。烴基是脂肪族或芳香族的，優(yōu)選地，是脂肪族的基團(tuán)。Ri和R2優(yōu)選是具有l(wèi)-6個(gè)C原子的烷基，氰化基團(tuán)供體非常優(yōu)選地是丙酮氰醇。氰化基團(tuán)供體可通過已知方法來制備。氰醇，特別是丙酮氰醇還可購買。所用的氰化基團(tuán)供體優(yōu)選是氫氰酸(HCN)、KCN、NaCN或丙酮氰醇，特別優(yōu)選氫氰酸。此外，還可剛好在反應(yīng)之前從其鹽之一(例如NaCN或KCN)釋放出氫氰酸，其可不經(jīng)稀釋加入到反應(yīng)混合物中或以溶解形式加入到反應(yīng)混合物中。轉(zhuǎn)化可在有機(jī)、水性或兩相系統(tǒng)中或者在乳液中、或在沒有稀釋劑的情況下進(jìn)行。包含本發(fā)明的HNL的水溶液或緩沖溶液用作為水性系統(tǒng)。其例子是檸檬酸鈉緩沖液、磷酸緩沖液等。水不可混溶或水略可混溶的脂肪族或芳香族碳?xì)浠衔?可選被鹵化的)、醇、醚或酯或其混合物或底物自身可能被用作為有機(jī)稀釋劑。優(yōu)選使用甲苯、二甲苯、甲基叔丁基醚(MTBE)、二異丙醚、二丁醚和乙酸乙酯或其混合物。此外，本發(fā)明的HNL可原樣使用或被固定后使用，例如，被固定于載體上，或作為"經(jīng)交聯(lián)酶聚集物"存在于有機(jī)稀釋劑中，但轉(zhuǎn)化也可在具有未被固定的HNL的乳液或兩相系統(tǒng)中進(jìn)行。此外，轉(zhuǎn)化可在-10。C至+50。C的溫度進(jìn)行，優(yōu)選地，-5°(3至+45°(:。反應(yīng)混合物的pH可以為1.8至7，優(yōu)選地，2至5，特別優(yōu)選地，2.5至3.5。實(shí)施例l定點(diǎn)誘變每次實(shí)驗(yàn)中，用10ng表達(dá)質(zhì)粒pHILDPaHNL5a一LlQ(具有alpha因子信號(hào)序列的PaHNL5，在WO2004/083424和Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2003;42，4815中有所描述)(突變體V360I、V360M和N225S)和pHILDPaHNL5a一LlQ，AlllG(WO2004/083424，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2003;42，4815)(突變體All1GV360I)作為模板，用于誘變反應(yīng)，其中使用來自Stratagene的QuikChangeXLSiteDirectedMutagenesisKit(Cat.#200516)。兩種誘變引物每種取200ng用于反應(yīng)。使用下述溫度程序A)在95。C變性l分鐘B)95。C50秒，60。C50秒和68。C20分鐘，共18個(gè)循環(huán)C)在68。C延伸7分鐘按照試劑盒說明書所述，用Dpnl消化模板DNA,并按照針對(duì)轉(zhuǎn)化超感受態(tài)五.co/z'XL10Gold細(xì)胞所述方法，使用2jxl混合物。從轉(zhuǎn)化子制備質(zhì)粒DNA,并測序。在編碼DNA插入?yún)^(qū)域具有正確序列的來自突變體的質(zhì)粒被復(fù)制，并被轉(zhuǎn)化進(jìn)PidH'a;wwtoAisGS115，這在標(biāo)準(zhǔn)Invitrogen程序協(xié)助下進(jìn)行。在深孔板上培養(yǎng)若干種組氨酸-自養(yǎng)型尸&Wfl轉(zhuǎn)化子，在96孔板中用外消旋扁桃腈(mandelonitrile)測定培養(yǎng)物上清液的活性。在每種情況下個(gè)體突變體中具有最高的酶活的克隆性被選出來，用于搖瓶實(shí)驗(yàn)。使用底物扁桃腈來測定培養(yǎng)物上清液的酶活性。用于定點(diǎn)誘變的PCR引物用于突變V360I:V360Iforw:5'-cgacttttgctcatattiltagccaagttccaggacc-3'V360Irev:5'畫ggtcctggaacttggc幽taatatgagcaaaagtcg-3'用于突變V360M:V360Mforw:5'-cgacttttgctcatattatgagccaagttccaggacc-3,V360Mrev:5'-ggtcctggaacttggctcataatatgagcaaaagtcg-3'用于突變N225S:N225Sf:5，國gaagatcctc加tc加c^acatcaaatttgtoagctattg-3'N225Sr:5'-caatagctgacaaatttgatgtagagjgaapagaa卿gatcttc-3'實(shí)施例2對(duì)酶變體進(jìn)行純化和表征通過用每種表達(dá)克隆進(jìn)行若干次搖瓶培養(yǎng)來測定各個(gè)突變體對(duì)于不同底物的比活性。使用來自Sartorius的20mlVivaspinPES離心柱(G6ttingen，D)，通過超濾(30kDa，分離點(diǎn))來濃縮培養(yǎng)物上清液，然后通過色譜進(jìn)行純化。在純化之前，先用低鹽結(jié)合緩沖液A平衡經(jīng)濃縮的培養(yǎng)物上清液，這通過在30kDa超濾離心模塊(Vivaspin，Sartorius)中用結(jié)合緩沖液A(20mM檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液，pH5.5)重復(fù)稀釋和濃縮來進(jìn)行，然后再在來自Amersh咖BiosciencesUKLimited(Buckinghamshire,GB)的AKTApurifier10FPLC系統(tǒng)中柱體積為10ml的Q-SepharoseFastFlow(QFF)陰離子交換柱上對(duì)其進(jìn)行純化。洗脫用洗脫緩沖液B(20mM檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液+1MNaCl，pH5.5)進(jìn)行洗脫，使用下述梯度情況，用于來自用尸/cAto/wwtoriy異源生產(chǎn)的尸aHNL5的不同變體洗脫步驟中的一個(gè)柱體積被證明為對(duì)于洗掉所有未結(jié)合的蛋白組分來說都是理想的。緩沖液B(洗脫緩沖液20mM檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液，lMNaCl，pH5.5)的濃度在一半的柱體積中上升至4%，隨后在下--個(gè)柱體積中增加至48%。下一個(gè)步驟是將洗脫緩沖液B的濃度增加至70%，在本情況下使用1.5個(gè)柱體積。最后，在一個(gè)柱體積中將濃度升高至最大的100%，最后由此用于下一個(gè)柱體積(洗滌步驟，沒有分級(jí)分離)。使用Biorad(Hercules,Ca)蛋白質(zhì)試驗(yàn)(Bradford方法)對(duì)按照色譜的判斷應(yīng)當(dāng)含有蛋白質(zhì)(取決于峰的位置)的那些級(jí)分測定蛋白質(zhì)含量，使用底物扁桃腈測定酶活性。收集合并具有最高活性的2-3份級(jí)分，并用它來分析酶特征。用Biorad(Hercules,Ca)蛋白質(zhì)試驗(yàn)(Bradford)來進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定。用于產(chǎn)生校正線的標(biāo)準(zhǔn)物是來自Sigma的天然尸flHNL(M-6782Lot41H4016)。通過交叉流(cross-flow)來過濾將培養(yǎng)物上清液濃縮20倍，然后通過色譜進(jìn)行純化。從經(jīng)純化酶中取樣，直接上樣至凝膠(蛋白質(zhì)凝膠NuPAGE4-12%bisgel1mmX17孑L;Invitrogen),用糖類內(nèi)切酶H(#P0702L，NEB)對(duì)大約500ng進(jìn)行去糖基化(按照提供的程序進(jìn)行)，然后上樣。所用的標(biāo)準(zhǔn)是來自Invitrogen(Carlsbad,USA)的"SeeBluePlus2Pre-StainedStandard"。為比較底物特異性，使用Biorad蛋白質(zhì)試驗(yàn)(Hercules,Ca)測量經(jīng)純化的酶的蛋白含量和培養(yǎng)物上清液中的蛋白質(zhì)含量，通過GC比較對(duì)于3-苯丙醛和3-苯丙烯醛的比活性就此目的而言，將15mmol底物溶解于2.1ml叔丁基甲醚(MTBE)中。用pH3.4的50mMK2HPOV檸檬酸鹽緩沖液將多種含量的合適PaHNL稀釋至3.6ml的終體積，再將緩沖液調(diào)節(jié)至pH3.4，然后在20ml玻璃試管中與MTBE中的底物混合。將溶液冷卻至10°C，用注射器加入1.2mlHCN，在磁力攪拌器上于700rpm和10。C進(jìn)行攪拌。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，存在吡啶和二氯甲垸的時(shí)候用乙酸酐進(jìn)行衍生化，通過GC在環(huán)糊精柱(CP-Chirasil-DexCB)上進(jìn)行分析或通過HPLC進(jìn)行分析。表1:用尸oHNL5-L1Q(WO2004/083424)和本發(fā)明的突變體對(duì)15mmol3-苯丙醛進(jìn)行轉(zhuǎn)化<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>n.d:未探測到表2:PflHNL5-LlQ和本發(fā)明突變體針對(duì)底物3-苯丙醛的比活性和TOF(周轉(zhuǎn)頻率)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3:用PaHNL5-LlQ和本發(fā)明突變體轉(zhuǎn)化15mmol3-苯丙醛<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例3測定PaHNL5-L10.N225S在切割扁桃腈中的活性對(duì)P./wwto&GS115PaHNL5-LlQ，N225S進(jìn)行培養(yǎng)(如上文所述)和通過離心收獲培養(yǎng)物上清液之后，通過超濾(30kDa分離點(diǎn))對(duì)后者進(jìn)行大約20倍的濃縮。通過Bradford方法測定蛋白質(zhì)濃度以及使用上述方法在扁桃腈切割反應(yīng)中測定活性之后，提供了以U/mg酶標(biāo)識(shí)的比活性的值。完整程序重復(fù)三次以便得到PaHNL5-LlQ，N225S的比活性的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。其為525+/-30U/mg,這大約是重組野生型PaHNL5-LlQ的1.6倍。權(quán)利要求1.具有改善的底物接受性、增加的活性以及增加的選擇性的R-羥腈裂解酶，其特征在于在來自Rosaceae科的R-羥腈裂解酶的氨基酸序列中存在任何下述替換a)對(duì)應(yīng)于成熟PaHNL5蛋白的第360位的氨基酸殘基被另一種無極性氨基酸或中性氨基酸替換，和/或b)對(duì)應(yīng)于成熟PaHNL5蛋白的第225位的氨基酸殘基被另一種極性氨基酸替換，如果合適的話，還可以替換活性中心中或?qū)驅(qū)⒈惶鎿Q的活性中心的疏水通道中的大約1至20個(gè)額外的殘基。2.如權(quán)利要求1所述的及-羥腈裂解酶，其特征在于所述替換在來白R(shí)-羥腈裂解酶或重組R-羥腈裂解酶中進(jìn)行。3.如權(quán)利要求1所述的及-羥腈裂解酶，其特征在于將被修飾的R-羥腈裂解酶是完整序列的形式，或者是通過對(duì)開頭的一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行替換、通過隨機(jī)插入或缺失從而被修飾的形式，或者通過缺失開頭的一個(gè)或多個(gè)氨基酸而被截短的序列的形式，或通過加入其它氨基酸或通過融合而延伸的序列的形式。4.如權(quán)利要求1所述的/-羥腈裂解酶，其特征在于在突變之前，天然的或植物性的信號(hào)序列被交換為來自SflccAwwnycMcewv&Zae的alpha交配因子、5laccAara加ycescerevz'w-ae轉(zhuǎn)化酶、尸z'cAz'。殺手毒素信號(hào)序歹ij、《淀粉酶、尸z'c/h'flp似toris酸性磷酸酶、尸Aaseo/M5vw/g。r&凝集素的信號(hào)序列；來自^sperg"/ws的葡糖淀粉酶信號(hào)序列、來自v4矽erg///1/5w/ge/'的葡糖氧化酶信號(hào)序列、來自的Sec10信號(hào)序列、來自K/i(yvera/nj;c幼/acris的殺手毒素的28kD亞基的信號(hào)序列、BSA信號(hào)序列或其重組信號(hào)序列，或具有點(diǎn)突變的上述信號(hào)序列之一。5.如權(quán)利要求1所述的及-羥腈裂解酶，其特征在于制備通過定點(diǎn)誘變以及隨后在下述微生物中的異源表達(dá)或分泌性表達(dá)來進(jìn)行，所述微生物來自/wm^oa1s、iSaccAaro/wycescerev&z'ae或￡!scAen'c/w"aco//、5ad〃z"'組。6.如權(quán)利要求1所述的及-羥腈裂解酶，其特征在于對(duì)應(yīng)于成熟PaHNL5蛋白的第360位的氨基酸殘基被來自異亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸的組的無極性氨基酸或被來自甘氨酸或色氨酸的中性氨基酸替換。7.如權(quán)利要求1所述的及-羥腈裂解酶，其特征在于對(duì)應(yīng)于成熟PaHNL5蛋白的第225位的氨基酸殘基被來自絲氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或天冬氨酸的組的極性氨基酸替換。8.如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的及-羥腈裂解酶用于制備對(duì)映異構(gòu)純的氰醇的用途。9.用于制備對(duì)映異構(gòu)純的氰醇的方法，其特征在于，在有機(jī)、水性或兩相系統(tǒng)中或在乳液中或在沒有稀釋劑的情況下，在-10。C至+5。C的溫度以及L8至7的pH下，在存在氰化基團(tuán)供體的情況下，用如權(quán)利要求l-7中任意一項(xiàng)所述的及-羥腈裂解酶對(duì)脂肪族、芳香族或雜芳香族醛或酮進(jìn)行轉(zhuǎn)化。全文摘要本發(fā)明公開了一種R-羥腈裂解酶，其具有改善的底物接受性、增加的活性以及增加的選擇性，其中，在來自Rosaceae科的R-羥腈裂解酶的氨基酸序列中存在任何下述替換a)對(duì)應(yīng)于成熟PaHNL5蛋白的第360位的氨基酸殘基被另一種無極性氨基酸或中性氨基酸替換，和/或b)對(duì)應(yīng)于成熟PaHNL5蛋白的第225位的氨基酸殘基被另一種極性氨基酸替換，如果合適的話，還可能替換活性中心中或?qū)驅(qū)⒈惶鎿Q的活性中心的疏水通道中的大約1至20個(gè)額外的殘基。文檔編號(hào)C12P13/00GK101103113SQ200580047002公開日2008年1月9日申請(qǐng)日期2005年12月28日優(yōu)先權(quán)日2005年1月20日發(fā)明者卡爾·古伯爾,奧利弗·瑪瑞爾,安盾·金爾德,沃夫?qū)に箍ò部?理查德·蓋斯伯格,羅蘭·威斯申請(qǐng)人:Dsm精細(xì)化學(xué)奧地利Nfg兩合公司