專利名稱：基因檢測(cè)方法和基因檢測(cè)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過讀取插入劑的電化學(xué)的發(fā)光，檢測(cè)存在于樣品中的具有特定的基因序列的目的基因的基因檢測(cè)方法及其裝置。
背景技術(shù)：
以往的通過電化學(xué)方法檢測(cè)特定基因序列的方法是將具有與待檢測(cè)的目的基因互補(bǔ)的堿基序列的單鏈核酸探針固定在電極表面上，使變性成單鏈的目的基因樣品與該核酸探針雜交后，在該核酸探針與基因樣品的反應(yīng)體系中添加特異性結(jié)合于該核酸探針與目的基因樣品的雙鏈核酸的、并且具有電化學(xué)活性的插入劑。然后，在添加了前述插入劑的反應(yīng)體系中外加電壓進(jìn)行電化學(xué)的測(cè)定，通過檢測(cè)與前述雙鏈核酸結(jié)合的插入劑，檢測(cè)與前述目的基因樣品雜交的前述核酸探針，確認(rèn)目的基因的存在(例如，參照專利文獻(xiàn)1和專利文獻(xiàn)2)。
這里，所謂前述插入劑是指識(shí)別前述雙鏈核酸，與該雙鏈核酸特異性結(jié)合的物質(zhì)。前述插入劑，在任意分子中具有苯基等平板狀插入基，該插入基通過介入雙鏈核酸的堿基對(duì)和堿基對(duì)之間，與雙鏈核酸結(jié)合。這種插入劑與雙鏈核酸的結(jié)合是通過靜電的相互作用或疏水性相互作用的結(jié)合，并且是通過以一定的速度重復(fù)前述插入劑在前述雙鏈核酸的堿基對(duì)間的插入，和從這些堿基對(duì)間的脫離的平衡反應(yīng)的結(jié)合。
前述插入劑中有電學(xué)性地發(fā)生可逆的氧化還原反應(yīng)的物質(zhì)。通過使用這種在電化學(xué)上發(fā)生可逆的氧化還原反應(yīng)的插入劑，通過電化學(xué)變化的測(cè)定，可以檢測(cè)與前述雙鏈核酸結(jié)合的插入劑的存在。并且，這種電化學(xué)變化可以通過氧化還原時(shí)發(fā)生的電流和發(fā)光等測(cè)定。
總之，在以往的基因檢測(cè)方法中，重要的是前述插入劑僅與雙鏈核酸特異性結(jié)合，并且正確檢測(cè)與前述雙鏈核酸結(jié)合的插入劑的量。
但是，以往的基因檢測(cè)中可以使用的插入劑非特異性地吸附在單鏈核酸探針和固定了該核酸探針的電極表面。于是，這種非特異性吸附的插入劑在檢測(cè)與前述雙鏈核酸結(jié)合的插入劑的量時(shí)形成背景噪音，成為使檢測(cè)靈敏度降低的原因。
為了解決這個(gè)問題，在以往方法中，在前述核酸探針和基因樣品的反應(yīng)體系中添加前述插入劑后形成前述背景噪音，因此現(xiàn)在就需要除去非特異性吸附在單鏈核酸探針和電極表面的插入劑的清洗處理(例如，參照專利文獻(xiàn)2)。
專利文獻(xiàn)1特許第2573443號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2特許第3233851號(hào)公報(bào)發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題然而，如前文所述，由于插入劑與雙鏈核酸通過靜電相互作用或疏水性相互作用結(jié)合，這種結(jié)合力弱，因此存在著在前述清洗處理時(shí)與雙鏈核酸結(jié)合的插入劑會(huì)解離，檢測(cè)靈敏度反而降低這樣的問題。
另一方面，在前述清洗處理中，在考慮要與前述雙鏈核酸結(jié)合的插入劑不解離時(shí)，由于非特異吸附在前述單鏈的核酸探針和電極表面上的插入劑的除去不充分，會(huì)產(chǎn)生無(wú)法充分除去背景噪音，檢測(cè)靈敏度降低的問題。
進(jìn)而，由于前述插入劑和雙鏈核酸間的結(jié)合反應(yīng)是平衡反應(yīng)，該插入劑在雙鏈核酸的堿基對(duì)間插入的比例低，因此即使不產(chǎn)生前述背景噪音，也存在檢測(cè)靈敏度低這樣的問題。
本發(fā)明是為了解決上述問題而完成的，其目的在于提供一種可以以高靈敏度檢測(cè)樣品中的基因的基因檢測(cè)方法及其裝置。
用于解決問題的方法為了解決前述以往的問題，本發(fā)明的基因檢測(cè)方法是一種檢測(cè)樣品中具有特定序列的基因的基因檢測(cè)方法，其包括通過將檢測(cè)樣品中待檢測(cè)的基因變性成單鏈制備基因樣品的基因樣品制作步驟，和將具有與前述待測(cè)基因序列互補(bǔ)的堿基序列的單鏈核酸探針固定在電極上的固定步驟，和在固定了前述核酸探針的電極上添加前述單鏈基因樣品，形成前述核酸探針與前述基因樣品雜交而成的雙鏈核酸形成步驟，在形成前述雙鏈核酸的電極上添加具有電化學(xué)活性并且通過光照射共價(jià)結(jié)合前述雙鏈核酸的插入劑的插入劑添加步驟，通過進(jìn)行光照射使前述插入劑與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的光照射步驟，清洗未與前述雙鏈核酸反應(yīng)的插入劑的清洗步驟，和前述清洗步驟后通過電化學(xué)測(cè)定檢測(cè)與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的插入劑的測(cè)定步驟。
由此，可以使前述基因樣品與核酸探針雜交而成的雙鏈核酸與前述插入劑不可逆并且牢固地結(jié)合，并且可以以高靈敏度檢測(cè)前述樣品中的基因。此外，在前述清洗過程中，由于與前述雙鏈核酸結(jié)合的插入劑不解離，可以除去與單鏈核酸探針或者電極表面非特異性吸附的插入劑，因而可以以高靈敏度檢測(cè)前述樣品中的基因。
進(jìn)而，本發(fā)明的基因檢測(cè)方法中的前述電化學(xué)的測(cè)定是對(duì)前述電極外加電壓，通過與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的插入劑測(cè)定電化學(xué)發(fā)光量。
因此可以以高靈敏度檢測(cè)固定在電極上的雙鏈核酸。其結(jié)果是，可以以高靈敏度檢測(cè)與核酸探針發(fā)生雜交反應(yīng)的基因樣品。
進(jìn)而，本發(fā)明的基因檢測(cè)方法中的前述插入劑包含具有特異性插入前述雙鏈核酸中并且通過光照射形成與該雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的雙鏈核酸結(jié)合部位、具有電化學(xué)活性的電化學(xué)活性部位、連結(jié)前述雙鏈核酸結(jié)合部位和前述電化學(xué)活性部位的連結(jié)部位的化合物。
因此，可以使前述雙鏈核酸與前述插入劑不可逆地且牢固地結(jié)合，其結(jié)果是，插入前述雙鏈核酸中的插入劑的比例增加，可以以高靈敏度檢測(cè)待檢測(cè)的基因樣品。
進(jìn)而，本發(fā)明的基因檢測(cè)方法中的插入劑為在前述雙鏈核酸結(jié)合部位具有感光性的插入劑。
因此，通過光照射可以使前述雙鏈核酸與前述插入劑不可逆地且牢固地結(jié)合。
進(jìn)而，本發(fā)明的基因檢測(cè)方法中的前述具有感光性的插入劑是呋喃香豆素(furocoumarin)衍生物。
進(jìn)而，本發(fā)明的基因檢測(cè)方法中的前述呋喃香豆素衍生物是補(bǔ)骨脂內(nèi)酯衍生物。
進(jìn)而，本發(fā)明的基因檢測(cè)方法中的前述具有氧化還原性的化合物為顯示電化學(xué)發(fā)光的化合物。
因此，如果給電極外加電壓，與固定在該電極上的雙氧化核酸結(jié)合的插入劑在發(fā)生氧化還原反應(yīng)的同時(shí)發(fā)光，測(cè)定該電化學(xué)發(fā)光量，可以檢測(cè)待檢測(cè)的基因樣品。
進(jìn)而，本發(fā)明的基因檢測(cè)方法中的顯示出電化學(xué)發(fā)光的化合物是在配體上具有雜環(huán)類化合物的金屬配合物，紅熒烯，蒽，六苯并苯，芘，熒蒽，，菲，苝，聯(lián)二萘，辛四烯。
進(jìn)而，本發(fā)明的基因檢測(cè)方法中的前述在配體上具有雜環(huán)類化合物的金屬配合物是在配體上具有吡啶部位的金屬配合物。
進(jìn)而，本發(fā)明的基因檢測(cè)方法中的前述在配體上具有吡啶部位的金屬配合物是金屬二吡啶配合物，金屬二氮雜菲配合物。
進(jìn)而，本發(fā)明的基因檢測(cè)方法中的前述在配體上具有雜環(huán)類化合物的金屬配合物的中心金屬是釕，鋨。
因此，在給前述電極外加電壓時(shí)，可以獲得更好的電化學(xué)發(fā)光量，并且可以以更高的靈敏度檢測(cè)出前述基因樣品。
此外，本發(fā)明的基因檢測(cè)裝置是檢測(cè)樣品中具有特定序列的基因的基因檢測(cè)裝置，其裝備有固定了具有與前述待檢測(cè)基因序列互補(bǔ)的堿基序列的單鏈核酸探針的電極；固定在前述電極上的核酸探針；通過與前述樣品中的待檢測(cè)基因被變性為單鏈的基因樣品雜交形成雙鏈核酸的雙鏈核酸形成槽；和在前述電極上添加具有電化學(xué)活性并且通過光照射共價(jià)結(jié)合前述雙鏈核酸的插入劑，然后光照射使前述插入劑與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的插入劑添加槽；和通過清洗液除去未與前述雙鏈核酸反應(yīng)的插入劑的清洗槽；和通過電化學(xué)測(cè)定檢測(cè)與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的插入劑的檢測(cè)槽；以及使前述電極在前述雙鏈核酸形成槽，前述插入劑添加槽，前述清洗槽和前述檢測(cè)槽的各槽內(nèi)按順序移動(dòng)的電極移動(dòng)部。
由此，可以提供通過經(jīng)電化學(xué)測(cè)定檢測(cè)與由前述基因樣品與核酸探針雜交而成的雙鏈核酸不可逆且牢固地結(jié)合的插入劑，可以以高靈敏度檢測(cè)前述樣品中的基因的基因檢測(cè)裝置。進(jìn)而，在前述清洗槽中，使與前述雙鏈核酸結(jié)合的插入劑不解離，可以除去非特異吸附在前述單鏈核酸探針或電極表面的插入劑，因此可以以高靈敏度檢測(cè)前述樣品中的基因。
此外，本發(fā)明的基因檢測(cè)裝置是檢測(cè)樣品中具有特定序列的基因的基因檢測(cè)裝置，其裝備有固定了具有與前述待檢測(cè)基因序列互補(bǔ)的堿基序列的單鏈核酸探針的電極；和通過將前述待檢測(cè)基因變性為單鏈制備基因樣品的基因樣品制作部；和容納具有電化學(xué)活性并且通過光照射共價(jià)結(jié)合前述雙鏈核酸的插入劑的插入劑槽；和容納除去未與前述雙鏈核酸反應(yīng)的插入劑的清洗液的清洗液槽；和容納用于檢測(cè)與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的插入劑的電解液的電解液槽；和與前述基因樣品制作部，插入劑槽，清洗液槽，電解液槽連接，使固定在前述電極上的核酸探針與前述基因樣品形成雙鏈核酸，通過光照射使前述結(jié)合劑與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合，用前述清洗液清洗未與前述雙鏈核酸反應(yīng)的插入劑，通過電化學(xué)測(cè)定檢測(cè)與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的插入劑的處理槽。
由此，可以提供通過經(jīng)電化學(xué)測(cè)定檢測(cè)與由前述基因樣品與核酸探針雜交而成的雙鏈核酸不可逆且牢固地結(jié)合的插入劑，可以以高靈敏度檢測(cè)前述樣品中的基因的基因檢測(cè)裝置，此外因?yàn)樵O(shè)置一個(gè)處理槽，所以可以使基因檢測(cè)裝置小型化。進(jìn)而，在前述處理層中，在用前述清洗液清洗不與前述雙鏈核酸反應(yīng)的插入劑時(shí)，使與前述雙鏈核酸結(jié)合的插入劑不解離，可以除去非特異吸附在前述單鏈核酸探針或電極表面的插入劑，因此可以提供小型的、可以以高靈敏度檢測(cè)前述樣品中的基因的基因檢測(cè)裝置。
發(fā)明效果如果按照本發(fā)明的基因檢測(cè)方法和裝置，檢測(cè)具有特定序列的基因時(shí)，使用具有電化學(xué)活性并且通過光照射共價(jià)結(jié)合前述雙鏈核酸的插入劑，通過光照射使前述插入劑與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合，可以使插入劑與該雙鏈核酸不可逆且牢固地結(jié)合，其結(jié)果是可以以高靈敏度檢測(cè)前述基因樣品。
此外，如果按照本發(fā)明的基因檢測(cè)方法和裝置，通過前述光照射使插入劑與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合后，因?yàn)樾枰獮榱顺シ翘禺愇皆谇笆鰡捂満怂崽结樆螂姌O表面的插入劑而進(jìn)行清洗處理，與前述雙鏈核酸結(jié)合的插入劑不被清洗液解離，所以可以除去非特異吸附在前述單鏈核酸探針或電極表面的插入劑，并可以以高靈敏度檢測(cè)前述樣品中的基因。


圖1是表示本發(fā)明的實(shí)施方式1所涉及的基因檢測(cè)裝置的結(jié)構(gòu)的圖。
圖2是表示本發(fā)明的實(shí)施方式2所涉及的基因檢測(cè)裝置的其它結(jié)構(gòu)的圖。
圖3是表示在由本發(fā)明的實(shí)施方式1的過程獲得的、形成雙鏈核酸的金電極x，和不形成雙鏈核酸的電極y中分別檢測(cè)出的最大電化學(xué)發(fā)光量的圖。
符號(hào)的說(shuō)明1基因樣品的制作部2電極3雙鏈核酸形成槽4，10溫度控制器
5，25電極移動(dòng)部5a電極支持臂5b臂驅(qū)動(dòng)部6基因樣品清洗液槽7基因樣品清洗槽8插入劑槽9插入劑反應(yīng)槽11UV燈12插入劑清洗液槽13插入劑清洗槽14電解液槽15檢測(cè)槽16光電倍增管17恒電位器18控制部23處理槽27廢液槽100，200基因檢測(cè)裝置具體實(shí)施方式
以下，對(duì)本發(fā)明的基因檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
并且，所謂在以下實(shí)施方式中的基因樣品，是從例如血液、白細(xì)胞、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養(yǎng)細(xì)胞、各種器官細(xì)胞這樣的組織細(xì)胞，其它含有基因的任意樣品中通過破壞該樣品中的細(xì)胞分離雙鏈核酸，通過熱處理或堿處理使其解離成單鏈核酸的樣品。此外，本實(shí)施方式中的基因樣品可以是用限制性酶切割，然后通過電泳分離等純化的核酸片段。
(實(shí)施方式1)下面，對(duì)實(shí)施方式1中的基因檢測(cè)方法進(jìn)行說(shuō)明。
首先，制備作為檢測(cè)對(duì)象的基因樣品。這種基因樣品，如上所述，通過破壞任意樣品中的細(xì)胞使雙鏈核酸游離，通過熱處理或堿處理使其變性成單鏈。
這時(shí)，可以按照常規(guī)方法進(jìn)行前述樣品中的細(xì)胞的破壞。例如，可以通過從外部外加振動(dòng)，超聲波等物理作用進(jìn)行。此外，還可以使用核酸提取溶液(例如，含有SDS，Triton-X，Tween-20等表面活性劑或皂甙，EDTA，蛋白酶等的溶液等)，使核酸從細(xì)胞游離。
接著，生成具有與待檢測(cè)的基因序列互補(bǔ)的堿基序列的單鏈核酸探針。
這種核酸探針，可以使用經(jīng)限制性酶切割從生物樣品中提取的核酸，通過電泳分離等純化的核酸或通過化學(xué)合成獲得的單鏈核酸。從生物樣品中提取的核酸時(shí)，優(yōu)選通過熱處理或堿處理使其解離成單鏈核酸。
然后，將前述獲得的核酸探針固定在電極上。
本發(fā)明中使用的電極如果是可作為電極使用的，可以是任意一種，可以例舉有，例如金、鉑、鉑黑、鈀、銠等貴金屬電極，和石墨、玻璃碳、熱解石墨、炭漿、碳纖維等碳電極，和氧化鈦、氧化錫、氧化錳、氧化鉛等氧化物電極，和Si、Ge、ZnO、CdS、TiO、GaAs等半導(dǎo)體電極等。這些電極上也可以被導(dǎo)電性高分子包被，如果這樣包被的話可以制備更穩(wěn)定的探針固定化電極。
并且，作為在前述電極上固定前述核酸探針的方法，可以使用公知的方法。如果舉一例，例如，在前述電極為金時(shí)，在固定的核酸探針的5’或3’-末端(優(yōu)選5’-末端)上導(dǎo)入巰基，通過金與硫的共價(jià)結(jié)合使前述核酸探針固定在該金電極上。在該核酸探針上導(dǎo)入巰基的方法可以例舉有記載在文獻(xiàn)(M.Maeda et al.，Chem.Lett.，1805-1808(1994)和B.A.Connolly，Nucleic Acids Res；，13，4484(1985))中的方法。
也就是，將由前述方法獲得的具有巰基的核酸探針滴落在金電極上，通過在低溫下放置數(shù)小時(shí)，使該核酸探針固定在電極上，制備出核酸探針。
此外，如果要舉其它的例子，例如在前述電極為玻璃碳時(shí)，首先通過用高錳酸鉀氧化玻璃碳，在電極表面導(dǎo)入羧酸基，由此，核酸探針通過酰胺結(jié)合被固定在玻璃碳電極表面。核酸探針被固定在該玻璃碳電極上。將核酸探針固定在該玻璃碳上的實(shí)際的固定化方法詳細(xì)地記載于文獻(xiàn)((K.M.Millan et al.，Analytical Chemistry，65，2317-2323(1993))中。
接著，使固定有前述核酸探針的電極與含有前述基因樣品的溶液接觸。由此，具有與前述固定的核酸探針互補(bǔ)的序列的基因樣品與之雜交，在電極上形成雙鏈核酸。由于使基因樣品與該核酸探針雜交的方法是周知的，故這里省略說(shuō)明。
通過這樣在電極上形成雙鏈核酸后，在形成該雙鏈核酸的電極上添加插入劑，在前述雙鏈核酸上插入插入劑使之反應(yīng)。并且，這種添加劑的添加可以在形成雙鏈核酸前，也可以最后在雜交反應(yīng)前添加到前述樣品中。
這之后，對(duì)添加了插入劑的雙鏈核酸進(jìn)行光照射，使雙鏈核酸與插入劑間形成共價(jià)結(jié)合。
以下，對(duì)本實(shí)施方式1的插入劑進(jìn)行說(shuō)明。
本發(fā)明中，作為插入劑使用具有以下特征的物質(zhì)特異性插入于前述雙鏈核酸并且通過光照射與雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合。
由此，前述插入劑由于與雙鏈核酸牢固且不可逆地結(jié)合，因此通過之后的清洗過程，與雙鏈核酸結(jié)合的插入劑不從該雙鏈核酸解離，在清洗過程中可以僅除去未反應(yīng)的插入劑。
進(jìn)而，本發(fā)明中，作為插入劑使用具有電化學(xué)活性的特征的物質(zhì)。
由此，通過源于特異性結(jié)合在前述雙鏈核酸的插入劑的電化學(xué)信號(hào)，可以以高靈敏度檢測(cè)出該雙鏈核酸的存在。
滿足這兩種特性的插入劑是具有特異性插入于前述雙鏈核酸并且通過光照射與雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的雙鏈核酸結(jié)合部位(I)、具有電化學(xué)活性的電化學(xué)活性部位(F)、以及連結(jié)前述雙鏈核酸結(jié)合部位(I)和前述電化學(xué)活性部位(F)的連結(jié)部位(L)的化合物。
例如，本發(fā)明的插入劑可以由下述通式(1)表示。
通式F-L-I...(1)(式中F表示電化學(xué)活性基，L表示連結(jié)基，I表示具有通過光照射與雙鏈核酸交聯(lián)的部位的雙鏈核酸插入基。)這里，可以作為前述通式(1)表示的雙鏈核酸插入基I使用的物質(zhì)，可以例舉有為特異性插入于雙鏈核酸并且通過光照射與雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的物質(zhì)并且具有感光性的插入劑。
然后，作為這種具有感光性的插入劑可以例舉有例如呋喃香豆素衍生物，尤為優(yōu)選補(bǔ)骨脂內(nèi)酯衍生物。這種補(bǔ)骨脂內(nèi)酯衍生物如果插入在雙鏈核酸中，就與雙鏈核酸產(chǎn)生非共價(jià)性相互作用，如果再照射長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外線(300-400nm)，插入于雙鏈核酸的補(bǔ)骨脂內(nèi)酯衍生物部分就會(huì)與雙鏈核酸牢固且不可逆地結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合。
因此，在后述清洗過程中可以確實(shí)地除去固定在電極表面上的、不形成雙鏈核酸的探針，在清洗非特異吸附在該電極表面的插入劑時(shí)，結(jié)合于雙鏈核酸上的插入劑不會(huì)脫落，通過在該清洗過程中進(jìn)行強(qiáng)洗滌可以確實(shí)地除去前述未反應(yīng)的單鏈核酸探針和非特異吸附的插入劑。
作為這種補(bǔ)骨脂內(nèi)酯衍生物的具體實(shí)例，可以例舉有補(bǔ)骨脂內(nèi)酯，甲氧基補(bǔ)骨脂內(nèi)酯，三甲基補(bǔ)骨脂內(nèi)酯等。
接著，可以作為前述通式(1)所示的電化學(xué)活性基F使用的物質(zhì)如果是可通過電化學(xué)檢測(cè)的物質(zhì)可以是任意物質(zhì)，例如，可以例舉有通過測(cè)定在可逆性氧化還原反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的氧化還原電流可以進(jìn)行物質(zhì)的檢測(cè)的、且具有氧化還原性的化合物。
而且，作為這種具有氧化還原性的化合物，有例如二茂鐵，兒茶酚胺，在配體上具有雜環(huán)類化合物的金屬配合物，紅熒烯，蒽，六苯并苯，芘，熒蒽，，菲，苝，聯(lián)二萘，辛四烯或viologen等。
進(jìn)而，作為前述具有氧化還原性的化合物的例子列舉的在配體上具有雜環(huán)類化合物的金屬配合物，紅熒烯，蒽，六苯并苯，芘，熒蒽，屈，菲，苝，聯(lián)二萘，辛四烯中也存在在氧化還原反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光的物質(zhì)，因此通過測(cè)定其發(fā)光也可以進(jìn)行物質(zhì)的檢測(cè)。
而且，作為前述在配體上具有雜環(huán)類化合物的金屬配合物，有含有氧或氮等的雜環(huán)類化合物，例如在配體中具有吡啶部位、吡喃部位的金屬配合物，尤為優(yōu)選在配體中具有吡啶部位的金屬配合物，而且作為該在配體中具有吡啶部位的金屬配合物，有例如金屬聯(lián)二吡啶配合物，金屬鄰二氮雜菲配合物等。
進(jìn)而，作為前述在配體上具有雜環(huán)類化合物的金屬配合物的中心金屬，可以例舉有例如釕，鋨，鋅，鈷，鉑，鉻，鉬，鎢，锝，錸，銠，銥，鈀，銅，銦，鑭，鐠，釹，釤等，并且尤其是，該中心金屬為釕，鋨的配合物具有良好電化學(xué)發(fā)光特性，作為這種具有良好電化學(xué)發(fā)光特性的物質(zhì)可以例舉有例如釕聯(lián)二吡啶配合物，釕鄰二氮雜菲配合物，鋨聯(lián)二吡啶配合物，鋨鄰二氮雜菲配合物等。
而且，作為前述通式(1)中可以作為連結(jié)基L使用的基團(tuán)如果是連結(jié)前述電化學(xué)活性基F和前述雙鏈核酸插入基I的基，這種連結(jié)序列沒有特別的限制，例如，可以列舉有烷基，-O-基，-CO-基，-NH-基，磷酸基或它們的組合構(gòu)成的基團(tuán)等。
在前述基因樣品與前述核酸探針雜交前或后添加這種插入劑，通過光照射，使前述核酸探針與基因樣品雜交而成的雙鏈核酸與前述插入劑共價(jià)結(jié)合后進(jìn)行電極的清洗處理。
然后通過這種清洗處理，除去固定在電極表面上的未反應(yīng)的單鏈核酸探針和非特異吸附在該電極表明上的插入劑。
其結(jié)果是，前述雜交的雙鏈核酸中就僅留下特異性共價(jià)結(jié)合的插入劑，通過測(cè)定源于這種插入劑的電化學(xué)信號(hào)可以以高靈敏度檢測(cè)出雙鏈核酸的存在。
前述來(lái)源于插入劑的電化學(xué)信號(hào)因添加的插入劑種類而不同，但是在使用產(chǎn)生氧化還原電流的插入劑時(shí)，可以用由恒電位器，函數(shù)發(fā)生器(function generator)等構(gòu)成的測(cè)量系統(tǒng)測(cè)定。另一方面，使用產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光的插入劑時(shí)可以使用光電倍增管等進(jìn)行測(cè)量。
下面，用圖1對(duì)本發(fā)明中這種基因檢測(cè)裝置進(jìn)行說(shuō)明。圖1是表示本發(fā)明實(shí)施方式1基因檢測(cè)裝置的結(jié)構(gòu)的圖。圖1中，基因檢測(cè)裝置100有雙鏈核酸形成槽3、基因樣品清洗槽7、插入劑反應(yīng)槽9、插入劑清洗槽13、檢測(cè)槽15這5種槽。1是從樣品中的細(xì)胞中制作作為檢查對(duì)象的基因樣品的基因樣品制作部，2是固定了具有與檢測(cè)對(duì)象的基因樣品互補(bǔ)的序列的單鏈核酸探針的電極。5由支持前述電極2的電極支持臂5a和驅(qū)動(dòng)該電極支持臂5a的臂驅(qū)動(dòng)部5b構(gòu)成，其是使前述電極2在前述5個(gè)槽3，7，9，13，15的內(nèi)部按順序移動(dòng)的電極移動(dòng)部，例如可以例舉有傳送臂，帶式傳送器等裝載器。
6是容納清洗電極2表面的未反應(yīng)的基因樣品的清洗液的基因樣品清洗液槽，8是容納插入劑的插入劑槽，12是容納清洗電極2表面的未反應(yīng)的插入劑的清洗液的插入劑清洗液槽，14是容納電解液的電解液槽。
而且，前述基因樣品制作部1連接在前述雙鏈核酸反應(yīng)槽3上，前述基因樣品清洗液槽6連接在前述基因樣品清洗槽7上，前述插入劑槽8連接在前述插入劑反應(yīng)槽9上，前述插入劑清洗液槽12連接在前述插入劑清洗槽13上，前述電解液槽14連接在前述檢測(cè)槽15上。此外，前述插入劑反應(yīng)槽9中設(shè)置有給電極2照射光的UV燈11，前述檢測(cè)槽15中設(shè)置有給電極2外加電壓的恒電位器17和測(cè)定前述電極2的電化學(xué)發(fā)光的光電倍增管16，和在控制外加給前述電極2的外加電壓的同時(shí)從前述光電倍增管16獲得測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析的控制部18。
此外，前述雙鏈核酸形成槽3，插入劑反應(yīng)槽9分別嵌合了溫度控制器4、10。
下面，對(duì)該裝置100的操作進(jìn)行說(shuō)明。
首先，將含有待檢測(cè)的基因的被檢查細(xì)胞裝入基因樣品制作部1，制成含有將作為檢查對(duì)象的基因變性為單鏈的基因樣品的樣品溶液。然后，將前述含有基因樣品的樣品溶液送至雙鏈核酸形成槽3，將前述樣品溶液滴落在設(shè)置于該雙鏈核酸形成槽3中的固定有核酸探針的電極2上。此時(shí)在雙鏈核酸形成槽3中通過溫度控制器4將槽內(nèi)溫度預(yù)先控制在適當(dāng)溫度。
在滴落了前述樣品溶液的電極2表面上，與固定在該電極2上的核酸探針具有互補(bǔ)的堿基序列的基因樣品雜交，形成雙鏈核酸。
反應(yīng)結(jié)束后，使該電極2從電極移動(dòng)部5移動(dòng)到基因樣品清洗槽7。
在基因樣品清洗槽7中將容納于前述基因樣品清洗液槽6中的清洗液滴落在前述電極2上，用該清洗液除去前述電極2表面未反應(yīng)的基因樣品。
反應(yīng)結(jié)束后，使該電極2從電極移動(dòng)部5移動(dòng)到插入劑反應(yīng)槽9。
插入劑反應(yīng)槽9中，將容納于前述插入劑槽8中的插入劑滴落在前述電極2上，使該插入劑插入到前述雙鏈核酸進(jìn)行反應(yīng)。此時(shí)在插入劑反應(yīng)槽9中通過溫度控制器10將槽內(nèi)溫度預(yù)先控制在適當(dāng)溫度。
進(jìn)而，這之后，在前述插入劑反應(yīng)槽9中，通過前述UV燈11對(duì)滴落了前述插入劑的電極2進(jìn)行光照射，使前述插入劑與雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合。
反應(yīng)結(jié)束后，使該電極2從電極移動(dòng)部5移動(dòng)到插入劑清洗槽13。
在插入劑清洗槽13中，將容納于前述插入劑清洗液槽12中的清洗液滴落在前述電極2上，用該清洗液除去前述電極2表面未反應(yīng)的插入劑。
清洗結(jié)束后使該電極2從電極移動(dòng)部5移動(dòng)到檢測(cè)槽15。
在檢測(cè)槽15中，前述電極2連接在恒電位器17上，將容納于前述電解液14的電解液滴落在前述電極2上。
前述恒電位器17在控制部18的控制下對(duì)電極2外加電壓，使電化學(xué)發(fā)光，然后，通過前述光電倍增管16測(cè)定該電化學(xué)發(fā)光，將該測(cè)定值輸入控制部18，進(jìn)行分析。
如上所述，如果根據(jù)本實(shí)施方式1，由于使用具有電化學(xué)活性且通過光照射與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的物質(zhì)作為插入于由與具有與檢測(cè)對(duì)象的基因互補(bǔ)的序列的核酸探針雜交獲得的雙鏈核酸的插入劑，故通過光照射使前述雙鏈核酸與前述插入劑共價(jià)結(jié)合，可以使該雙鏈核酸與插入劑可逆地且牢固地結(jié)合，其結(jié)果是可以獲得高精確度的測(cè)定結(jié)果，可以以高靈敏度檢測(cè)具有特定序列的待檢測(cè)基因。此外，如果根據(jù)本實(shí)施方式1，即使清洗電極2表面的未反應(yīng)的插入劑，由于設(shè)法使前述插入劑與雙鏈核酸形成共價(jià)結(jié)合，因此結(jié)合到前述雙鏈核酸的插入劑不解離，由于可以除去非特異吸附在單鏈核酸探針或電極表面上的插入劑，因此可以以高靈敏度檢測(cè)前述樣品中的基因。
并且，本實(shí)施方式1中，作為清洗槽，設(shè)置有清洗雙鏈核酸形成過程后的未反應(yīng)的基因樣品的基因樣品清洗槽7、和清洗插入劑添加過程后的未反應(yīng)的插入劑的插入劑清洗槽13的結(jié)構(gòu)，但是即使將清洗槽并為一個(gè)槽，成為在同一清洗槽中進(jìn)行這些清洗處理的結(jié)構(gòu)也可以，或者即使在前述兩個(gè)清洗處理后只進(jìn)行前述未反應(yīng)的插入劑清洗處理。不進(jìn)行前述未反應(yīng)的基因樣品清洗處理也可以。
進(jìn)而，前述基因檢測(cè)裝置100中，對(duì)電極2進(jìn)行的每種處理，均設(shè)置用于進(jìn)行這些處理的槽的結(jié)構(gòu)，但是也可以在一個(gè)槽里實(shí)現(xiàn)所有的處理。
(實(shí)施方式2)前述實(shí)施方式1中說(shuō)明了設(shè)置對(duì)電極2進(jìn)行多個(gè)處理的多個(gè)處理槽，在不同的處理槽中進(jìn)行各個(gè)處理的情況，而本實(shí)施方式2中是將處理槽合并為1個(gè)，在該1個(gè)處理槽中對(duì)電極2進(jìn)行處理的情況。
圖2是表示本實(shí)施方式2所涉及的基因檢測(cè)裝置的結(jié)構(gòu)的圖。圖2中，基因檢測(cè)裝置200有對(duì)電極2進(jìn)行處理的處理槽23。25是前述處理槽23內(nèi)部使前述電極在水平方向移動(dòng)的電極移動(dòng)部，例如，可以例舉有例如使平臺(tái)(stage)平行移動(dòng)的機(jī)械裝置等。而且，27是排出滯留于前述處理槽23內(nèi)部的液體的廢液槽。
前述處理槽23中，在槽內(nèi)部設(shè)置固定了核酸探針的電極2和使該電極2在水平方向上移動(dòng)的電極移動(dòng)部25，進(jìn)而在槽上部連接前述基因樣品制作部1、基因樣品清洗液槽6、插入劑槽8、插入劑清洗液槽12、電解液槽14、和廢液槽27。
此外，前述處理槽23中設(shè)置對(duì)電極2照射光的UV燈11和測(cè)定該電極2的電化學(xué)發(fā)光的光電倍增管16，其嵌合了溫度控制器4。
進(jìn)而，在該裝置200中，設(shè)置對(duì)電極2外加電壓的恒電位器17和在控制外加給前述電極2的外加電壓的同時(shí)從前述光電倍增管16獲得測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析的控制部18。
下面，對(duì)該裝置200的操作進(jìn)行說(shuō)明。
首先，將含有待檢測(cè)的基因的被檢查細(xì)胞裝入基因樣品制作部1，制成含有將作為檢查對(duì)象的基因變性為單鏈的基因樣品的樣品溶液。然后，將前述含有基因樣品的樣品溶液送至處理槽23，將前述樣品溶液滴落在設(shè)置于該處理槽23中的固定有核酸探針的電極2上。此時(shí)在處理槽23中通過溫度控制器4將槽內(nèi)溫度預(yù)先控制在適當(dāng)溫度。
在滴落了前述樣品溶液的電極2表面上，與固定在該電極2上的核酸探針具有互補(bǔ)的堿基序列的基因樣品雜交，形成雙鏈核酸。
反應(yīng)結(jié)束后，將容納于前述基因樣品清洗液槽6中的清洗液滴落在前述電極2上，用該清洗液除去前述電極2表面未反應(yīng)的基因樣品。此時(shí)，電極移動(dòng)部25使該電極2水平方向移動(dòng)到所定位置以使由基因樣品清洗液槽6傳送的清洗液適當(dāng)?shù)温涞角笆鲭姌O2上。此外，滴落在前述電極2上的清洗液回收于廢液槽27中。
清洗結(jié)束后，容納于前述插入劑槽8中的插入劑滴落在前述電極2上，使該插入劑插入于前述雙鏈核酸反應(yīng)。此時(shí)，電極移動(dòng)部25使該電極2水平方向移動(dòng)到所定位置以使由插入劑槽8傳送的插入劑適當(dāng)?shù)温涞角笆鲭姌O2上。此外，在處理槽23中通過溫度控制器4預(yù)先將槽內(nèi)溫度控制于適當(dāng)溫度。
反應(yīng)結(jié)束后，將容納于前述插入劑清洗液槽12中的清洗液滴落在前述電極2上，用該清洗液除去前述電極2表面未反應(yīng)的插入劑。此時(shí)，電極移動(dòng)部25使該電極2水平方向移動(dòng)到所定位置以使由插入劑清洗液槽12傳送的清洗液適當(dāng)?shù)温涞角笆鲭姌O2上。此外，滴落在前述電極2上的清洗液回收于廢液槽27中。
清洗結(jié)束后，前述電極2與恒電位器17連接，容納于前述電解液槽14的電解液滴落在前述電極2上。此時(shí)，電極移動(dòng)部25使該電極2水平方向移動(dòng)到所定位置以使由電解液槽14傳送的電解液適當(dāng)?shù)温涞角笆鲭姌O2上。
前述恒電位器17在控制部18的控制下對(duì)電極2外加電壓，使電化學(xué)發(fā)光。然后，通過前述光電倍增管16測(cè)定該電化學(xué)發(fā)光，將該測(cè)定值輸入控制部18，進(jìn)行分析。
如上所述，如果根據(jù)本實(shí)施方式2，由于設(shè)法使用具有電化學(xué)活性且通過光照射與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的物質(zhì)作為插入于由與具有與檢測(cè)對(duì)象的基因互補(bǔ)的序列的核酸探針雜交獲得的雙鏈核酸的插入劑，故通過光照射使前述雙鏈核酸與前述插入劑共價(jià)結(jié)合，可以使該雙鏈核酸與插入劑可逆地且牢固地結(jié)合，其結(jié)果是可以獲得高精確度的測(cè)定結(jié)果，可以以高靈敏度檢測(cè)具有特定序列的待檢測(cè)基因。此外，如果根據(jù)本實(shí)施方式2，即使清洗電極2表面的未反應(yīng)的插入劑，由于設(shè)法使前述插入劑與雙鏈核酸形成共價(jià)結(jié)合，因此結(jié)合到前述雙鏈核酸的插入劑不解離，由于可以除去非特異吸附在單鏈核酸探針或電極表面上的插入劑，因此可以以高靈敏度檢測(cè)前述樣品中的基因。
并且，本實(shí)施方式2中，設(shè)置有清洗雙鏈核酸形成過程后的未反應(yīng)的基因樣品的基因樣品清洗槽6和清洗插入劑添加過程后的未反應(yīng)的插入劑的插入劑清洗槽12的結(jié)構(gòu)，但是即使將處理層23設(shè)置的清洗液槽并為一個(gè)槽，也可以在同一清洗槽中進(jìn)行雙鏈核酸形成過程后的清洗未反應(yīng)的基因樣品的處理以及光照射過程后的清洗未反應(yīng)的插入劑的處理，也可以在前述兩個(gè)清洗處理后只進(jìn)行前述插入劑清洗處理不進(jìn)行前述基因樣品清洗處理。
實(shí)施例1下面，公開了本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。
(1)核酸探針在金電極表面上的固定玻璃基板上通過濺鍍裝置(アルバツク制SH-350)形成鈦10nm，在襯底上形成金200nm，通過光刻術(shù)步驟形成電極圖案，從而制備金電極。用ピラニア溶液(過氧化氫∶濃硫酸＝1∶3)清洗電極表面1分鐘，用純水清洗后，通過吹氮使之干燥。
核酸探針中，使用具有位于自人來(lái)源的Cytochrome P-450的基因序列的5’-端的第629-668位的CCCCCTGGAT CCAGATATGC AATAATTTTCCCACTATCAT的序列且通過5’-端的磷酸基修飾了巰基的40個(gè)堿基的寡聚脫氧核苷酸(寶生物制)。然后，使該核酸探針溶解于10mM的PBS(pH7.4的磷酸鈉緩沖液)，調(diào)整至100μM。
將這樣調(diào)整的核酸探針的溶液滴落在前述金電極上，于飽和濕度下，室溫下放置4小時(shí)，通過使巰基與金結(jié)合，從而將核酸探針固定在金電極上。
(2)雜交基因樣品中，使用與前述核酸探針互補(bǔ)的在5’-末端具有ATGATAGTGG GAAAATTATT GCATATCTGG ATCCAGGGGG的序列的寡聚脫氧核苷酸(寶生物制)。然后，使該核酸樣品溶解于混合了10mM的PBS和2XSSC的雜交溶液，調(diào)整至20μM。
將這樣調(diào)整的溶解了基因樣品的雜交溶液滴落到固定了前述核酸探針的金電極上，在40℃的恒溫槽中使之反應(yīng)4小時(shí)，形成雙鏈核酸。由此獲得形成雙鏈核酸的金電極x。
進(jìn)而，在本實(shí)施例中，作為比較對(duì)象，制成不形成雙鏈核酸的金電極y。這種不形成雙鏈核酸的金電極y，通過使用具有與前述核酸探針非互補(bǔ)的序列的基因樣品(以下稱為“比較基因樣品”)進(jìn)行與獲得形成前述雙鏈核酸的金電極x時(shí)相同的處理。并且，其中，作為前述比較基因樣品，使用具有40mer的Poly-A(寶生物制)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA的序列的基因樣品。
(3)插入劑的添加插入劑中使用下述化1所示補(bǔ)骨脂內(nèi)酯修飾釕配合物。
補(bǔ)骨脂內(nèi)酯修飾釕配合物的合成可以通過以下方法獲得。
首先，將通過公知的方法(Biochemistry，Vol.16，No 6，1977)合成的4-氯甲基-4，5，8-三甲基補(bǔ)骨脂內(nèi)酯(0.5g，1.81mmol)溶于氫氧化鈉溶解二甲基甲酰胺(干燥)，160℃下一邊攪拌一邊滴落1，4-二氨基丁烷(0.32g，3.63mmol)，使之反應(yīng)12小時(shí)。蒸餾去除溶劑后，通過硅膠色譜法處理純化粗生成物，獲得生成物A(收率40％)。
接著，將溶解于60.0mL THF中的2.50g(1.35×10-2mol)4，4’-二甲基-2，2’聯(lián)二吡啶溶液注入氮?dú)獾娜萜髦泻?，滴?6.9mL的2M的二異丙基酰胺鋰溶液(2.70×10-2mol)，一邊冷卻一邊攪拌30分鐘。另一方面，同樣，在于氮?dú)饬髦懈稍锏娜萜髦屑尤?.61g的1，2-二溴乙烷(4.05×10-2mol)和10mL的THF，一邊冷卻一邊攪拌。
使先前的溶解于THF的4，4’-二甲基-2，2’聯(lián)二吡啶溶液與2M二異丙基酰胺鋰溶液反應(yīng)的反應(yīng)液慢慢滴落到這種插入了1，2-二溴乙烷和THF的容器中，使之反應(yīng)2.5小時(shí)。然后，用2N的鹽酸中和這種反應(yīng)溶液，蒸餾去除THF后用氯仿提取，進(jìn)而用硅膠柱純化通過蒸餾前述溶劑獲得的粗生成物，獲得生成物B(收率47％)。
然后，將前述生成物A(0.50g，1.52mmol)和前述生成物B(0.49g，1.68mmol)溶于氫氧化鈉溶解二甲基甲酰胺(干燥)，160℃下攪拌18小時(shí)。然后，蒸餾去除這種攪拌的溶劑后，通過硅膠色譜法處理純化粗生成物，獲得生成物C(收率38％)。
進(jìn)而，在二甲基甲酰胺(80.0mL)中回流氯化釕(III)(2.98g，0.01mol)和2，2’聯(lián)二吡啶(3.44g，0.022mol)后，蒸餾去除溶劑。然后，加入丙酮，收集經(jīng)冷卻一晚獲得的黑色沉淀物，加入170mL乙醇水溶液(乙醇∶水＝1∶1)，進(jìn)行1小時(shí)的加熱回流。過濾后，加入20g氯化鋰，蒸餾乙醇，再冷卻一晚。析出的黑色物質(zhì)通過吸引過濾收集，獲得生成物D(收率68.2％)。
然后，將前述生成物C(0.30g，0.56mmol)和前述生成物D(0.32g，0.66mmol)溶于二甲基甲酰胺中然后回流6小時(shí)，反應(yīng)后通過蒸餾溶劑獲得的黑紫色物質(zhì)中加入蒸餾水使之溶解，通過過濾出去未反應(yīng)的配合物后，蒸餾去除溶劑。
通過硅膠色譜法處理純化所得的粗生成物，獲得補(bǔ)骨脂內(nèi)酯修飾釕配合物(收率68％)。表1是以前述方式獲得的補(bǔ)骨脂內(nèi)酯修飾釕配合物的質(zhì)子NMR(1H-NMR)的結(jié)果。
表11H-NMR(300MHz，DMSOd-6)σ1.4-1.8 (6H，m)2.4-2.6 (12H，m)2.74 (2H，t)3.8-3.1 (6H，m)4.31 (2H，s)6.32 (1H，s)7.38 (2H，d)7.54 (7H，m)7.77 (4H，m)8.16 (4H，t)8.70 (2H，d)8.88 (4H，d)用10mM的PBS將這樣獲得的補(bǔ)骨脂內(nèi)酯修飾釕配合物調(diào)整成2μM。
將該調(diào)整的溶液分別添加到前述形成雙鏈核酸的金電極x和不形成雙鏈核酸的金電極y上，在4℃的冷藏庫(kù)中進(jìn)行30分鐘的暗反應(yīng)。
(4)雙鏈核酸和插入劑的共價(jià)結(jié)合
30分鐘后，用UV crosslinker(フナコシ制UVPLCL1000L型)分別對(duì)前述金電極x，y照射波長(zhǎng)為365nm，5mW/cm2的紫外線10分鐘。共價(jià)結(jié)合后，用10mM的PBS分別振動(dòng)清洗金電極x，y 10分鐘，除去未反應(yīng)的Ru配合物。
(5)電化學(xué)測(cè)定在以上過程后，在前述金電極x，和不形成雙鏈核酸的金電極y上分別滴落混合了0.1M的PBS和0.1M的三乙胺的電解液。
然后，對(duì)金電極x，y外加電壓，進(jìn)行此時(shí)產(chǎn)生的源于插入劑的電化學(xué)發(fā)光的測(cè)定。
并且，電壓的外加以0V至1.3V掃描，進(jìn)行1秒鐘的電化學(xué)測(cè)定。電化學(xué)發(fā)光量的測(cè)定用光電倍增管(浜松ホトニクス制H7360-01)進(jìn)行，測(cè)定最大發(fā)光量。
圖3表示由本實(shí)施例1的電化學(xué)測(cè)定獲得的結(jié)果。根據(jù)圖3可知形成雙鏈核酸的金電極x上的發(fā)光量顯著高于在不形成雙鏈核酸的金電極y上的發(fā)光量。表明了如果使用本發(fā)明的插入劑，就可以以高靈敏度進(jìn)行雙鏈核酸的檢測(cè)。
工業(yè)上的可利用性本發(fā)明中的這種基因檢測(cè)方法可以以高靈敏度檢測(cè)具有特定序列的基因，可以應(yīng)用于基因診斷，傳染病診斷，基因組創(chuàng)新藥物等用途。
序列表<110>松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社<120>基因檢測(cè)方法和基因檢測(cè)裝置<130>P38717-P0<150>JP 2004-128940<151>2004-04-23<160>3<210>1<211>40<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<223>用巰基修飾5’-末端磷酸基團(tuán)<400>1ccccctggat ccagatatgc aataattttc ccactatcat 40<210>2<211>40<212>DNA<213>智人<400>2atgatagtgg gaaaattatt gcatatctgg atccaggggg 40<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>3aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 40
權(quán)利要求
1.一種基因檢測(cè)方法，其特征在于其為一種檢測(cè)樣品中具有特定序列的基因的基因檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟通過將檢測(cè)樣品中待檢測(cè)的基因變性成單鏈制備基因樣品的基因樣品制作步驟；將具有與前述待測(cè)基因序列互補(bǔ)的堿基序列的單鏈核酸探針固定在電極上的固定步驟；在固定了前述單鏈核酸探針的電極上添加前述單鏈基因樣品，形成前述核酸探針與前述基因樣品雜交的雙鏈核酸的雙鏈核酸形成步驟；在形成前述雙鏈核酸的電極上添加具有電化學(xué)活性并且通過光照射能共價(jià)結(jié)合前述雙鏈核酸的插入劑的插入劑添加步驟；通過進(jìn)行光照射使前述插入劑與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的光照射步驟；清洗未與前述雙鏈核酸反應(yīng)的插入劑的清洗步驟；和前述清洗步驟后通過電化學(xué)測(cè)定檢測(cè)與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的插入劑的測(cè)定步驟。
2.權(quán)利要求1中記載的基因檢測(cè)方法，其特征在于前述電化學(xué)測(cè)定是對(duì)前述電極外加電壓，通過與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的插入劑測(cè)定電化學(xué)發(fā)光量的測(cè)定。
3.權(quán)利要求1中記載的基因檢測(cè)方法，其特征在于前述插入劑包含具有特異性插入前述雙鏈核酸中并且通過光照射與該雙鏈核酸形成共價(jià)結(jié)合的雙鏈核酸結(jié)合部位、具有電化學(xué)活性的電化學(xué)活性部位、連結(jié)前述雙鏈核酸結(jié)合部位和前述電化學(xué)活性部位的連結(jié)部位的化合物。
4.權(quán)利要求3中記載的基因檢測(cè)方法，其特征在于所述插入劑是前述雙鏈核酸結(jié)合部位具有感光性的插入劑。
5.權(quán)利要求4中記載的基因檢測(cè)方法，其特征在于前述具有感光性的插入劑是呋喃香豆素衍生物。
6.權(quán)利要求5中記載的基因檢測(cè)方法，其特征在于前述呋喃香豆素衍生物是補(bǔ)骨脂內(nèi)酯衍生物。
7.權(quán)利要求3中記載的基因檢測(cè)方法，其特征在于前述電化學(xué)活性部位是具有氧化還原性的化合物。
8.權(quán)利要求7中記載的基因檢測(cè)方法，其特征在于前述具有氧化還原性的化合物是顯示電化學(xué)發(fā)光的化合物。
9.權(quán)利要求8中記載的基因檢測(cè)方法，其特征在于前述顯示電化學(xué)發(fā)光的化合物是在配體上具有雜環(huán)類化合物的金屬配合物、紅熒烯、蒽、六苯并苯、芘、熒蒽、、菲、苝、聯(lián)二萘、辛四烯。
10.權(quán)利要求9中記載的基因檢測(cè)方法，其特征在于前述在配體上具有雜環(huán)類化合物的金屬配合物是在配體上具有吡啶部位的金屬配合物。
11.權(quán)利要求10中記載的基因檢測(cè)方法，其特征在于前述在配體上具有吡啶部位的金屬配合物是金屬二吡啶配合物，金屬二氮雜菲配合物。
12.權(quán)利要求9中記載的基因檢測(cè)方法，其特征在于前述在配體上具有雜環(huán)類化合物的金屬配合物的中心金屬是釕，鋨。
13.一種基因檢測(cè)裝置，其特征在于該裝置是檢測(cè)樣品中具有特定序列的基因的基因檢測(cè)裝置，其裝備有固定了具有與前述待檢測(cè)基因序列互補(bǔ)的堿基序列的單鏈核酸探針的電極；固定在前述電極上的核酸探針和與前述樣品中的待檢測(cè)基因被變性為單鏈的基因樣品雜交形成雙鏈核酸的雙鏈核酸形成槽；在前述電極上添加具有電化學(xué)活性并且通過光照射能共價(jià)結(jié)合前述雙鏈核酸的插入劑，然后光照射使前述插入劑與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的插入劑添加槽；通過清洗液除去未與前述雙鏈核酸反應(yīng)的插入劑的清洗槽；通過電化學(xué)測(cè)定檢測(cè)與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的插入劑的檢測(cè)槽；以及使前述電極在前述雙鏈核酸形成槽，前述插入劑添加槽，前述清洗槽和前述檢測(cè)槽的各槽內(nèi)按順序移動(dòng)的電極移動(dòng)部。
14.一種基因檢測(cè)裝置，其特征在于該裝置是檢測(cè)樣品中具有特定序列的基因的基因檢測(cè)裝置，其裝備有固定了具有與前述待檢測(cè)基因序列互補(bǔ)的堿基序列的單鏈核酸探針的電極；通過將前述待檢測(cè)基因變性為單鏈制備基因樣品的基因樣品制作部；容納具有電化學(xué)活性并且通過光照射共價(jià)結(jié)合前述雙鏈核酸的插入劑的插入劑槽；容納除去未與前述雙鏈核酸反應(yīng)的插入劑的清洗液的清洗液槽；容納用于檢測(cè)與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的插入劑的電解液的電解液槽；和與前述基因樣品制作部、前述插入劑槽、前述清洗液槽、前述電解液槽連接的處理槽，前述處理槽使固定在前述電極上的核酸探針與前述基因樣品形成雙鏈核酸，通過光照射使所述插入劑與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合，用前述清洗液清洗未與前述雙鏈核酸反應(yīng)的插入劑，通過電化學(xué)測(cè)定檢測(cè)與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的插入劑。
全文摘要
提供了一種以高靈敏度檢測(cè)樣品中具有特定序列的基因的基因檢測(cè)方法及其裝置。其包括通過將檢測(cè)樣品中具有特定序列的待檢測(cè)的基因變性成單鏈制備基因樣品的基因樣品制備步驟；將具有與該基因樣品的序列互補(bǔ)的堿基序列的單鏈核酸探針固定在電極上的固定步驟；通過在固定了前述核酸探針構(gòu)成的電極上添加前述基因樣品，在電極上形成前述核酸探針與前述基因樣品雜交而成的雙鏈核酸形成步驟；添加具有電化學(xué)活性并且通過光照射能共價(jià)結(jié)合前述雙鏈核酸的插入劑的插入劑添加步驟；通過進(jìn)行光照射使前述插入劑與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的光照射步驟；清洗未與前述雙鏈核酸反應(yīng)的插入劑的清洗步驟；和通過電化學(xué)測(cè)定檢測(cè)與前述雙鏈核酸共價(jià)結(jié)合的插入劑的測(cè)定步驟。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1947013SQ20058001275
公開日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2005年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月23日
發(fā)明者前田瑞夫, 秋元克美, 堀淳一, 村山隆亮, 田畑仁平, 板東克彥 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社, 株式會(huì)社微細(xì)技工·日音