專利名稱：農(nóng)藥對(duì)捕食性天敵體內(nèi)消化酶活性的快速檢測(cè)方法
專利說(shuō)明農(nóng)藥對(duì)捕食性天敵體內(nèi)消化酶活性的快速檢測(cè)方法 本發(fā)明涉及利用低劑量的農(nóng)藥(有機(jī)磷類、有機(jī)氯類、菊酯類)增強(qiáng)蜘蛛等捕食天敵的控蟲(chóng)潛能，以及蜘蛛等捕食天敵體內(nèi)消化酶活性的快速檢測(cè)方法——壓電石英阻抗分析法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。長(zhǎng)期以來(lái)，大多的人只考慮到施用農(nóng)藥對(duì)環(huán)境污染及對(duì)天敵殺害的副作用，忽視了它存在的合理性。本發(fā)明人通過(guò)多年的探索，發(fā)現(xiàn)施用低劑量的化學(xué)農(nóng)藥既增強(qiáng)了天敵的控蟲(chóng)力，同時(shí)又不會(huì)導(dǎo)致環(huán)境和糧食的污染，因?yàn)檫@些低劑量的農(nóng)藥不會(huì)超出生態(tài)系統(tǒng)的“彈性限度”，通過(guò)生態(tài)系統(tǒng)的自身調(diào)節(jié)作用，生物體的生物轉(zhuǎn)化及其生物修復(fù)作用，完全能把這些小劑量的有毒物質(zhì)分解成無(wú)毒物質(zhì)。其主要機(jī)理是低劑量農(nóng)藥增強(qiáng)了蜘蛛等天敵體內(nèi)消化酶的活性和抑制了其體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性，從而增強(qiáng)了蜘蛛的消化能力及其神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，增加了蜘蛛等天敵控制害蟲(chóng)的潛能，因此低劑量農(nóng)藥在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中具有較大的應(yīng)用潛力。同時(shí)，在生物學(xué)領(lǐng)域創(chuàng)建了一種快速檢測(cè)酶活性的新技術(shù)——壓電石英阻抗分析法，該技術(shù)與其它的壓電技術(shù)不同，不需要把酶固定在金電極上，在液相中壓電傳感器能靈敏地對(duì)溶液的粘密度有較好的響應(yīng)特性，且反應(yīng)液采用合適pH值的磷酸緩沖液配制，不受反應(yīng)過(guò)程中pH值變化的影響。與傳統(tǒng)的酶活性檢測(cè)方法相比，如分光光度法、化學(xué)發(fā)光法等，檢測(cè)靈敏、快速，不需使用有毒試劑，且能提供反映所研究體系的一些物理或化學(xué)性質(zhì)變化的多維動(dòng)態(tài)信息。本發(fā)明目的是維持農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)平衡，生產(chǎn)無(wú)公害綠色食品，配制各類農(nóng)藥的最適低劑量灑于稻田，充分挖掘和發(fā)揮蜘蛛等天敵的控蟲(chóng)潛能。同時(shí)提供一種靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，不需把酶固定在金電極上，能現(xiàn)場(chǎng)提供反映所研究體系的一些物理或化學(xué)性質(zhì)變化的多維動(dòng)態(tài)信息，能全面、實(shí)時(shí)的對(duì)變化過(guò)程進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)和分析體內(nèi)消化酶活性的快速檢測(cè)方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明人在主持國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目研究期間，發(fā)現(xiàn)低劑量的化學(xué)農(nóng)藥能大大地增強(qiáng)蜘蛛等捕食性天敵的控蟲(chóng)效能，并試圖構(gòu)建一種蜘蛛等捕食性天敵體內(nèi)酶活性的快速檢測(cè)方法，經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間的研究認(rèn)為，壓電石英阻抗分析法是一種能實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的的快速檢測(cè)法。具體步驟是1、最適低劑量農(nóng)藥的選擇所謂低劑量農(nóng)藥是指不殺死天敵也很難殺死害蟲(chóng)的小劑量的化學(xué)農(nóng)藥。首先把各類農(nóng)藥(有機(jī)磷類、有機(jī)氧類、菊酯類等)配制成系列的低劑量濃度，通過(guò)在不施農(nóng)藥時(shí)，蜘蛛的控蟲(chóng)力測(cè)定試驗(yàn)；對(duì)害蟲(chóng)施藥，蜘蛛不施藥，蜘蛛的控蟲(chóng)力測(cè)定試驗(yàn)；對(duì)蜘蛛施藥、害蟲(chóng)不施藥時(shí)，蜘蛛的控蟲(chóng)力試驗(yàn)和對(duì)蜘蛛和害蟲(chóng)同時(shí)施藥時(shí)，蜘蛛的控蟲(chóng)力測(cè)定試驗(yàn)。篩選出增強(qiáng)蜘蛛控蟲(chóng)力的最適低劑量濃度?，F(xiàn)已篩選出增強(qiáng)狼蛛類的控蟲(chóng)力的最適的甲胺磷(50％)、殺蟲(chóng)雙(18％)和烯丙菊酯(0.3％)的最適低劑量濃度分別為原藥∶水等于2∶5000、12∶5000和1∶5000。
2、酶液提取在體視顯微鏡下于冰浴中解剖已經(jīng)用低劑量農(nóng)藥和高劑量農(nóng)藥處理的蜘蛛，取其中腸和消化腺，用一定體積pH8.0的磷酸緩沖液在冰浴中研磨勻漿，勻漿液在0～4℃下用4000×g離心15min，取上清液測(cè)定消化酶的活力。也可解剖未經(jīng)農(nóng)藥處理的蜘蛛，按上述方法得到離體的酶液，然后在酶的活性檢測(cè)時(shí)，加一定量的最適低劑量濃度的農(nóng)藥，檢測(cè)農(nóng)藥對(duì)酶活力的影響。
3、酶液的總蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
4、酶液的活性檢測(cè)設(shè)備和材料的準(zhǔn)備本檢測(cè)方法所需設(shè)備是一臺(tái)網(wǎng)絡(luò)/頻譜/阻抗分析儀(型號(hào)HP4395)和一臺(tái)與之相連的電子計(jì)算機(jī)(型號(hào)IBM166MMX)、一個(gè)玻璃池及一面鍍金一面鍍銀的壓電石英晶體，該晶體鍍金的一面作為金電極沒(méi)入反應(yīng)液，接入阻抗測(cè)試架的地端作為工作電極，另一面露于空氣中的銀電極接入阻抗分析架的非地端。玻璃池內(nèi)設(shè)有一個(gè)攪拌子，玻璃池外設(shè)有控溫器，把玻璃池放入控溫器中，然后將兩者放在磁振動(dòng)器上振動(dòng)。因?yàn)榫W(wǎng)絡(luò)/頻譜/阻抗分析儀可同步測(cè)量壓電石英晶體(PQC)諧振的電導(dǎo)(G)與電納(B)譜，通過(guò)HP82341C高性能HP-IB接口卡用專用程序控制阻抗分析儀獲得導(dǎo)納數(shù)據(jù)，運(yùn)用Gauss-Newtin非線性最小二乘法實(shí)時(shí)擬合每組G與B數(shù)據(jù)并完成導(dǎo)納數(shù)據(jù)和其他等效電路參數(shù)分析。采用AT——切MHz的單面觸液壓電石英晶體，單面觸液型鍍金一面的金電極沒(méi)入反應(yīng)液，銀電極露于空氣中。用常規(guī)的合適體積的玻璃檢測(cè)池，電磁攪拌器恒速攪拌。溫控裝置為恒溫水套與超級(jí)恒溫槽以及WM2K-1型溫度自動(dòng)控制儀，檢測(cè)過(guò)程中溫度均控制在27.5～28.5℃。
5、消化酶的壓電阻抗分析1mol/L PH7.5的PBS緩沖液2.5ml和0.2ml 0.5％的專一性底物(如酪蛋白、淀粉、橄欖油等)注入檢測(cè)池中，一段時(shí)間后得到穩(wěn)定的信號(hào)值，分別記為初始諧振頻率(f01)、動(dòng)態(tài)電阻(R11)、動(dòng)態(tài)電感(L11)和靜態(tài)電容(C01)作為參比值。接著，同時(shí)注入0.2ml的酶液到檢測(cè)池引發(fā)反應(yīng)，記錄時(shí)間(t)并同步采集各電路參數(shù)信號(hào)值(即f0、R1、L1、C0)，得到整個(gè)過(guò)程的相應(yīng)信號(hào)變化(即Δf0＝f0-f01)、ΔR1＝R1-R11、ΔL1＝L1-L11、ΔC0＝C0-C01)隨時(shí)間的關(guān)系曲線。反應(yīng)完畢后，這些參數(shù)又會(huì)維持一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，此時(shí)被記為f02、R12、L12，則相應(yīng)的終點(diǎn)變化值分別為Δfm(＝f02-f01)、ΔRM(＝R12-R11)、ΔLm(＝L12-L11)和ΔCm(＝C02-C01)。通過(guò)其中的頻率變化就可實(shí)現(xiàn)對(duì)消化酶水解底物過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，即由Δf-t曲線即可得到酶促反應(yīng)的初速度V(Δf/t)。
6、將測(cè)定的參數(shù)信息動(dòng)態(tài)送入計(jì)算機(jī)，在專用程序控制下，經(jīng)運(yùn)算并打印出相應(yīng)的曲線圖，供研究人員分析。
本發(fā)明所用壓電石英晶體阻抗的工作原理是壓電石英晶體傳感器主要利用其諧振/振蕩體聲波在液相中的微米級(jí)距離傳播，可感電極表面納克級(jí)的質(zhì)量變化，故也稱為石英晶體微天平或壓電體聲波傳感器。在AT切壓電體聲波液相定量傳感理論中，有如下兩個(gè)重要方程，其中式(1)為Sauerbrey方程描述質(zhì)量效應(yīng)，而式(2)為Martin方程描述牛頓型液體負(fù)載導(dǎo)致的凈粘密度效應(yīng)。
Δf0=Fog2(ρQμQ)1/2·ΔmA=-2.264×10-6fog2ΔmA---(1)]]>式中fog為晶體基頻(Hz)，A為壓電活性面積(cm2)，μQ和ρQ分別為石英剪切模量和密度。
ΔR1L=-4xLQΔf01fμQ/fogC‾66≈-4πLQΔf01---(2)]]>式中Δfo1和ΔR1L分別為液相負(fù)載變化時(shí)晶體諧振頻率(f0)和動(dòng)態(tài)電阻(R1)的響應(yīng)，f為諧振區(qū)中心頻率，C66為壓電晶體的彈性常數(shù)，LQ為晶體在空氣中的動(dòng)態(tài)電感。
而消化酶對(duì)底物的水解作用是將蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪類大分子底物分解成氨基酸、單糖和脂肪酸等小分子的產(chǎn)物，溶液的粘密度在反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生明顯的變化，因此可通過(guò)壓電體聲波傳感器的諧振頻率與酶促反應(yīng)液的粘密度的關(guān)系，即基于壓電傳感器對(duì)溶液粘密度變化的實(shí)時(shí)響應(yīng)來(lái)檢測(cè)消化酶的活性大小。
本發(fā)明的有益效果是①本發(fā)明采用壓電體聲波阻抗分析法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)消化酶對(duì)底物的酶促水解過(guò)程及有毒物質(zhì)(如農(nóng)藥、有機(jī)磷類、有機(jī)氯類和菊酯類)對(duì)酶活性的影響，與傳統(tǒng)的紫外分光光度分析法相比，靈敏度高，優(yōu)勢(shì)明顯，在計(jì)算機(jī)的參與下，能反映所研究體系的一些物理和化學(xué)性質(zhì)的多維動(dòng)態(tài)信息，能全面、實(shí)時(shí)的對(duì)變化過(guò)程進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)和分析。用本發(fā)明所述方法檢測(cè)三大農(nóng)藥對(duì)生物體內(nèi)消化酶的活性影響，準(zhǔn)確、迅速的得出如下結(jié)論，即上述三大農(nóng)藥的合適低劑量可顯著地增強(qiáng)消化酶的活性，較高劑量的農(nóng)藥可顯著抑制消化酶的活性，這為人們正確使用農(nóng)藥，利用天敵控制害蟲(chóng)，充分發(fā)揮天敵的控蟲(chóng)效能，降低農(nóng)作物的生產(chǎn)成本，減少農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留量都有積極作用。②本發(fā)明方法所用設(shè)備少，操作簡(jiǎn)便、快捷、檢測(cè)成本低，因此便于推廣應(yīng)用。③最適低劑量農(nóng)藥可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，對(duì)保護(hù)和利用天敵，充分發(fā)揮天敵控蟲(chóng)潛能，生產(chǎn)無(wú)公害食品，減少其副作用及協(xié)調(diào)生防和化防的關(guān)系，都具有積極的意義。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1是本發(fā)明所用儀器裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是沒(méi)有農(nóng)藥時(shí)四個(gè)壓電參數(shù)對(duì)時(shí)間的關(guān)系圖。
圖3是不同甲胺磷農(nóng)藥濃度下的頻率變化時(shí)間曲線。
其中農(nóng)藥濃度分別為1為2∶5000，2為0，3為4∶5000，4為5∶5000，5為8∶5000。
圖4是不同有機(jī)氯農(nóng)藥(殺蟲(chóng)雙)濃度下的頻率響應(yīng)對(duì)時(shí)間的曲線。
圖5是不同菊酯類(烯丙菊酯)濃度下的頻率響應(yīng)對(duì)時(shí)間的曲線。實(shí)施例用壓電石英阻抗分析法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)擬環(huán)紋豹蛛中腸蛋白消化酶對(duì)酪蛋白的酶促水解過(guò)程及三大類農(nóng)藥對(duì)酶活性的影響，具體步驟如下
①試驗(yàn)設(shè)備和條件的準(zhǔn)備，參照附圖1選擇一臺(tái)HP4395A網(wǎng)絡(luò)/頻譜/阻抗分析儀(1)與一臺(tái)IBM166MMx計(jì)算機(jī)(2)相連，在阻抗分析儀(1)的輸入端通過(guò)管道(9)連至玻璃池(3)內(nèi)，玻璃池內(nèi)設(shè)有反應(yīng)液(6)，反應(yīng)液中設(shè)有一面鍍金一面鍍銀的壓電石英晶體(4)，鍍金的一面金電極沒(méi)入反應(yīng)液中，鍍銀的一面電極露于空氣中，玻璃池內(nèi)的底部設(shè)有一個(gè)攪拌子(5)，玻璃池外設(shè)有控溫器(8)，玻璃池外的底部設(shè)有磁性攪拌器(7)，把玻璃池放入控溫器中，然后將兩者放在磁攪拌器上振動(dòng)。
①實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備稻田蜘蛛為擬環(huán)紋豹蛛雌成蛛，從無(wú)農(nóng)藥污染的生物防治田中采集，活體帶回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)備用。
低劑量農(nóng)藥的配制將甲胺磷按原藥與水之比配成2∶5000、4∶5000、5∶5000和8∶5000四個(gè)濃度；將殺蟲(chóng)雙按原藥與水之比配成28∶5000、14∶5000、12∶5000、10∶5000和8∶5000五個(gè)濃度；將烯丙菊脂按原藥與水之比配成6∶20、4∶20、3∶20、2∶20和1∶20五個(gè)濃度。
②實(shí)驗(yàn)方法取2-3頭已饑餓48h的擬環(huán)紋豹蛛雌成蛛，然后在體視顯微鏡下于冰浴中解剖，取其中腸，用2mlpH8.0的磷酸緩沖液在冰浴中研磨勻漿，勻漿在0～4℃下用4000×g離心15min，取上清液測(cè)定酶的活力；測(cè)定蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
③消化酶的壓電阻抗分析用前述的壓電阻抗分析法，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)擬環(huán)紋豹蛛中腸蛋白的酶促水解過(guò)程及三大類農(nóng)藥(有機(jī)磷類、有機(jī)氯類和菊酯類)對(duì)酶活性的影響，并將動(dòng)態(tài)過(guò)程中的變化信息送入計(jì)算機(jī)，在專用程序處理下，輸出相應(yīng)的圖象或曲線。下面是經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后輸出的分析結(jié)果曲線圖2所示，曲線顯示了在酪蛋白溶液(0.5％)中滴加一定量蜘蛛中腸蛋白消化酶后(無(wú)農(nóng)藥作用)PQC等效電路參數(shù)(Δf0、ΔR1、ΔC1、ΔL1)隨時(shí)間的變化情況?？梢?jiàn)，酶的加入導(dǎo)致了Δf0的急劇上升，然后慢慢的繼續(xù)上升，最后達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的值(Δfm)，然而與此同時(shí)，ΔR1與ΔL1則呈現(xiàn)出相反的變化態(tài)勢(shì)，ΔC1卻有一個(gè)較小的上升趨勢(shì)。Δf0主要由酪蛋白與蜘蛛中腸蛋白消化酶作用后產(chǎn)生的粘密度效應(yīng)所引起；ΔR1的變化暗示了隨著蛋白消化酶的加入，酪蛋白被分解為小分子的氨基酸，即溶液粘密度的減少而導(dǎo)致R1變?。沪1主要由蛋白消化酶的滴入把酪蛋白分解為兩性電解質(zhì)的氨基酸，增大了溶液的介電性質(zhì)而引起。在后續(xù)在三大類殺蟲(chóng)劑的系列低劑量農(nóng)藥作用下，其PQC等效電路參數(shù)(Δf0、ΔR1、C1和ΔL1)隨時(shí)間的變化情況類同。
圖3所示，在蛋白水解酶——酪蛋白體系中加入系列低劑量的有機(jī)磷類甲胺磷殺蟲(chóng)劑后，PQC的Δf0-t響應(yīng)曲線發(fā)生了顯著的變化在原藥∶水＝2∶5000的作用下，響應(yīng)曲線向左移，斜率與幅度明顯增加，加速了頻率上升，增大了酶的反應(yīng)速度；在4∶5000農(nóng)藥濃度的作用下，在0～8min時(shí)間內(nèi)，曲線左移，曲線斜率增大，加速了頻率上升，但在反應(yīng)8min以后，曲線明顯右移，上升的斜率和幅度明顯減少，酶促反應(yīng)速度明顯減慢。這說(shuō)明合適低劑量的有機(jī)磷農(nóng)藥能提高蜘蛛中腸蛋白消化酶的活性，稍大劑量則抑制其活性，并隨農(nóng)藥濃度的增大，抑制程度相應(yīng)增強(qiáng)，蛋白消化酶的作用是蛋白質(zhì)+蛋白消化酶→蛋白質(zhì)-酶復(fù)合物→小肽或氨基酸。最適低劑量的甲胺磷(2∶5000)能提高酶促反應(yīng)速度，有機(jī)理可能是，低劑量的甲胺磷促進(jìn)了蛋白酶的構(gòu)象變化，使酶的活性中心更易于接近底物，易于蛋白質(zhì)-酶復(fù)合物的形成，同時(shí)也提高了蛋白酶水解蛋白質(zhì)的能力；稍大劑量的甲胺磷(4∶5000)在反應(yīng)前期(0～8min)與前者類似，酶促反應(yīng)速度也得到了提高，但在后期卻受到了抑制，其主要原因是該劑量的甲胺磷農(nóng)藥抑制了酶-蛋白復(fù)合物的降解。而更大劑量的甲胺磷(5∶5000和8∶5000)農(nóng)藥導(dǎo)致了酶的構(gòu)象變得更加緊湊，活性中心與底物的結(jié)合更困難，導(dǎo)致酶促反應(yīng)速度減慢。
圖4是低劑量的有機(jī)氯類殺蟲(chóng)雙農(nóng)藥對(duì)蛋白水解酶活性的影響曲線從圖4中可知在酶-酪蛋白體系中加入系列低劑量濃度的有機(jī)氯農(nóng)藥——?dú)⑾x(chóng)雙后，酶促反應(yīng)曲線發(fā)生了顯著的變化。在原藥∶水為8∶5000至14∶5000范圍內(nèi)時(shí)，酶促反應(yīng)曲線都有不同程度的左移，斜率和幅度都有不同程度的增加，頻率上升的速度均不同程度的大于未有農(nóng)藥刺激的情形，說(shuō)明在該范圍內(nèi)的殺蟲(chóng)雙能有效的提高蜘蛛中腸消化酶的活力。在原藥∶水為8∶5000至12∶5000范圍內(nèi)時(shí)，隨農(nóng)藥濃度的遞增，酶促反應(yīng)速度也隨之增大，直對(duì)原藥∶水為12∶5000時(shí)，酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值，在原藥∶水為12∶5000至14∶5000范圍內(nèi)時(shí)，隨農(nóng)藥濃度的增加，酶促反應(yīng)速度減慢，但仍大于未施藥的情形，但當(dāng)殺蟲(chóng)雙農(nóng)藥濃度達(dá)一定量(28∶5000)時(shí)，酶促反應(yīng)曲線明顯右移，曲線斜率和幅度明顯減少，頻率上升速度減慢，酶的活性受到明顯抑制。
圖5是低劑量的菊酯類殺蟲(chóng)劑對(duì)蛋白水解酶活性的影響曲線從圖5可知，在原藥∶水為1∶20至3∶20的濃度范圍內(nèi)時(shí)，PQC的Δf0-t響應(yīng)曲線都不同程度的左移，其上升幅度也均大于沒(méi)有農(nóng)藥的情形，但隨農(nóng)度的增加，上升幅度逐次減少，即酶被激活的程度也依次減少。在較高劑量農(nóng)藥農(nóng)度(4∶20和6∶20)的作用下，PQC的Δf0-t響應(yīng)曲線明顯右移，曲線斜率和幅度明顯減少，頻率上升速度減慢，且農(nóng)藥濃度越高，其右移幅度越大，曲線斜率和幅度就越少，酶的活性受到明顯的抑制。
總之，用本發(fā)明方法對(duì)有機(jī)磷類、有機(jī)氯類和菊酯類三大類農(nóng)藥的檢測(cè)結(jié)果表明，這三大類農(nóng)藥的合適低劑量可顯著地增強(qiáng)蛋白消化酶的活性，較高劑量的農(nóng)藥可顯著抑制蛋白消化酶的活性。證實(shí)壓電石英阻抗分析法比傳統(tǒng)的紫外分光光度分析法優(yōu)勢(shì)明顯。這對(duì)探討低劑量殺蟲(chóng)劑增強(qiáng)蜘蛛控蟲(chóng)力的生物化學(xué)機(jī)制和對(duì)合理使用殺蟲(chóng)劑，減少其副作用及協(xié)調(diào)生防和化防的關(guān)系，都具有積極的意義。
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)藥對(duì)捕食性天敵體內(nèi)消化酶活性影響的快速檢測(cè)方法——壓電石英阻抗分析法。其特征是該檢測(cè)方法包括如下步驟①最適低劑量農(nóng)藥的選擇首先把各類農(nóng)藥(有機(jī)磷類、有機(jī)氧類、菊酯類等)配制成系列的低劑量濃度，通過(guò)在不施農(nóng)藥時(shí)，蜘蛛的控蟲(chóng)力測(cè)定試驗(yàn)；對(duì)害蟲(chóng)施藥，蜘蛛不施藥，蜘蛛的控蟲(chóng)力測(cè)定試驗(yàn)；對(duì)蜘蛛施藥、害蟲(chóng)不施藥時(shí)，蜘蛛的控蟲(chóng)力試驗(yàn)和對(duì)蜘蛛和害蟲(chóng)同時(shí)施藥時(shí)，蜘蛛的控蟲(chóng)力測(cè)定試驗(yàn)，篩選出增強(qiáng)蜘蛛控蟲(chóng)力的最適低劑量濃度，現(xiàn)已篩選出增強(qiáng)狼蛛類的控蟲(chóng)力的最適的甲胺磷(50％)、殺蟲(chóng)雙(18％)和烯丙菊酯(0.3％)的最適低劑量濃度分別為原藥∶水等于2∶5000、12∶5000和1∶5000；②酶液提取在體視顯微鏡下于冰浴中解剖已經(jīng)用低劑量農(nóng)藥和高劑量農(nóng)藥處理的蜘蛛，取其中腸和消化腺，用一定體積PH8.0的磷酸緩沖液在冰浴中研磨勻漿，勻漿液在0～4℃下用4000×g離心15min，取上清液測(cè)定消化酶的活力，也可解剖未經(jīng)農(nóng)藥處理的蜘蛛，按上述方法得到離體的酶液，然后在酶的活力檢測(cè)時(shí)，加一定量的最適低劑量濃度的農(nóng)藥，檢測(cè)農(nóng)藥對(duì)酶活力的影響；③酶液的總蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；④酶液的活性檢測(cè)設(shè)備和材料的準(zhǔn)備本檢測(cè)方法所需設(shè)備是一臺(tái)網(wǎng)絡(luò)/頻譜/阻抗分析儀(型號(hào)HP4395)和一臺(tái)與之相連的電子計(jì)算機(jī)(型號(hào)IBM166MMX)，在阻抗分析儀的輸入端通過(guò)管道連至一個(gè)玻璃池內(nèi)，玻璃池內(nèi)設(shè)有反應(yīng)液，反應(yīng)液中設(shè)有一面鍍金另一面鍍銀的壓電石英晶體，玻璃池內(nèi)的底部設(shè)有一個(gè)攪拌子，玻璃池外設(shè)有溫控器，玻璃池外的底部設(shè)有磁性攪拌器，把玻璃池放入溫控器中，然后將兩者放在磁攪拌器上振動(dòng)；⑤消化酶的壓電阻抗分析1mol/L PH7.5的PBS緩沖液2.5ml和0.2ml 0.5％的專一性底物，如酪蛋白、淀粉、橄欖油等注入檢測(cè)池中，一段時(shí)間后得到穩(wěn)定的信號(hào)值，分別記為初始諧振頻率(f01)、動(dòng)態(tài)電阻(R11)、動(dòng)態(tài)電感(L11)和靜態(tài)電容(C01)作為參比值，接著，同時(shí)注入0.2ml的酶液到檢測(cè)池引發(fā)反應(yīng)，記錄時(shí)間(t)并同步采集各電路參數(shù)信號(hào)值(即f0、R1、L1、C0)，得到整個(gè)過(guò)程的相應(yīng)信號(hào)變化(即Δf0＝f0-f01)、ΔR1＝R1-R11、ΔL1＝L1-L11、ΔC0＝C0-C01)隨時(shí)間的關(guān)系曲線，反應(yīng)完畢后，這些參數(shù)又會(huì)維持一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，此時(shí)被記為f02、R12、L12，則相應(yīng)的終點(diǎn)變化值分別為Δfm(＝f02-f01)、ΔRM(＝R12-R11)、ΔLm(＝L12-L11)和ΔCm(＝C02-C01)，通過(guò)其中的頻率變化就可實(shí)現(xiàn)對(duì)消化酶水解底物過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，即由Δf-t曲線即可得到酶促反應(yīng)的初速度V(Δf/t)。它是在一臺(tái)網(wǎng)絡(luò)/頻譜/阻抗分析儀和一臺(tái)計(jì)算機(jī)及其專用程序控制下，對(duì)一塊單面觸液型的壓電石英晶體，該晶體噴金一面電極沒(méi)入待測(cè)液，接入阻抗測(cè)試架的地端作為工作電極，另一面露于空氣中的銀電極接入阻抗測(cè)試架的非地端，用常規(guī)玻璃檢測(cè)池，池中加入反應(yīng)液，電磁攪拌器恒速攪拌，溫控裝置為恒溫水套與超級(jí)恒溫槽以及溫度自動(dòng)控制儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程中溫度均控制在27.5～28.5℃之間；⑥將測(cè)定的參數(shù)信息動(dòng)態(tài)送入計(jì)算機(jī)，在專用程序控制下，經(jīng)運(yùn)算并打印出相應(yīng)的曲線圖，供研究人員分析。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種農(nóng)藥對(duì)捕食性天敵體內(nèi)消化酶活性影響的快速檢測(cè)方法，即壓電石英阻抗分析法。該方法是一個(gè)由網(wǎng)絡(luò)/頻譜/阻抗分析儀、電子計(jì)算機(jī)和金電極等組成的檢測(cè)架，在農(nóng)藥的影響下，對(duì)捕食性天敵體內(nèi)消化酶活性進(jìn)行快速檢測(cè)。利用本方法實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)擬環(huán)紋豹蛛中腸蛋白消化酶對(duì)酪蛋白的酶促水解過(guò)程及三大類農(nóng)藥對(duì)酶活性的影響，結(jié)果表明這三大類農(nóng)藥的合適低劑量可顯著地增強(qiáng)蛋白消化酶的活性，較高劑量地農(nóng)藥可顯著抑制蛋白酶的活性，且水解過(guò)程穩(wěn)態(tài)頻移值可準(zhǔn)確地反映酶活性與農(nóng)藥濃度的關(guān)系，證實(shí)該法比傳統(tǒng)的紫外光光度分析法優(yōu)勢(shì)明顯，可廣泛用于生物酶的活性檢測(cè)。同時(shí)低劑量農(nóng)藥對(duì)天敵的保護(hù)與利用及害蟲(chóng)防治上有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK1841058SQ200510031399
公開(kāi)日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2005年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月28日
發(fā)明者王智 申請(qǐng)人:湖南文理學(xué)院