專利名稱：環(huán)孢菌素a發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種環(huán)孢菌素A發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
環(huán)孢菌素A(cyclosporin A，CyA)首先由瑞士山道士公司于1970年在巴塞爾微生物研究所進(jìn)行抗真菌藥物篩選時(shí)，從美國(guó)和挪威的土壤中分離到兩種不完全真菌即光澤柱孢菌(Cylindrocarpon lucidum)和多孔木霉(Beauveria bassiana)產(chǎn)生有抗真菌活性的環(huán)孢菌素A。1974年進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)免疫活性研究，1978年首次應(yīng)用于臨床腎移植試驗(yàn)。1980年實(shí)現(xiàn)環(huán)孢菌素A的全合成。1983年美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床器官移植。其詳細(xì)的資料在Process Biochemistry 1991，26157～166文獻(xiàn)中已經(jīng)有公開(kāi)的報(bào)道。
作為一種免疫抑制劑，環(huán)孢菌素A的主要特點(diǎn)是抑制作用選擇性，即主要抑制T細(xì)胞的增殖與分化。環(huán)孢菌素A抑制T細(xì)胞的活化，抑制Th產(chǎn)生白細(xì)胞介素-2和-3，以及β干擾素等各種淋巴因子和白細(xì)胞介素-2受體的表達(dá)，從而抑制了細(xì)胞毒T細(xì)胞(Tc)的產(chǎn)生。在藥理劑量下，環(huán)孢菌素A對(duì)抑制性T細(xì)胞的產(chǎn)生沒(méi)有抑制作用，這一點(diǎn)對(duì)移植耐受性的形成很有意義。環(huán)孢菌素A對(duì)B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖和功能沒(méi)有直接的抑制作用。這些特點(diǎn)是以前任何免疫抑制劑所沒(méi)有的。從而使免疫抑制劑的研究和應(yīng)用進(jìn)入了一個(gè)新的的被稱之為環(huán)孢菌素時(shí)代。
另外，研究表明環(huán)孢菌素A對(duì)自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、牛皮癬、再生障礙性貧血、皮膚肌炎、內(nèi)源性葡萄膜炎以及腎病綜合癥的治療有效。對(duì)血吸蟲(chóng)病、瘧疾也有療效。還可以防止愛(ài)滋病病毒的擴(kuò)散，以及對(duì)某些植物病如蘋(píng)果腐爛病等有效。
目前，環(huán)孢菌素A由液體發(fā)酵生產(chǎn)。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在其生物合成過(guò)程中，所有催化反應(yīng)導(dǎo)致它的形成都是以氨基酸為前體，因此適當(dāng)調(diào)整外源氨基酸的成分可以生物合成出許多不同的同系物。這既為尋找新的環(huán)孢菌素類化合物提供了可能，但同時(shí)對(duì)生產(chǎn)出高組分的環(huán)孢菌素A造成了一定的困難，因?yàn)樗鼘?duì)培養(yǎng)基的要求比較高。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有10種以上的微生物能夠產(chǎn)生這種化合物，而工業(yè)應(yīng)用比較多的微生物包括上面提及的兩種外(光澤柱孢菌(Cylindrocarpon lucidum)和多孔木霉(Beauveriabassiana)，還有鐮刀孢霉等。
自上世紀(jì)八十年代以來(lái)，由于環(huán)孢菌素A的使用給器官移植帶來(lái)了巨大的變化，尤其是進(jìn)入九十年代，無(wú)論從數(shù)量上還是質(zhì)量上器官移植的發(fā)展都是空前的。因此提供一種新的制備環(huán)孢菌素A的方法，是有關(guān)部門(mén)所十分期望的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于公開(kāi)一種環(huán)孢菌素A的發(fā)酵生產(chǎn)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，滿足有關(guān)領(lǐng)域發(fā)展的需要。
本發(fā)明的方法包括下列步驟(1)斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基重量組成玉米粉1.0～3.0％；葡萄糖1.0～2.0％；瓊脂1.5～2.5％，余量為水；pH6.0～6.5；溫度23～28℃，培養(yǎng)時(shí)間6～8天；(2)種子培養(yǎng)然后將菌種在如下的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng)基重量組成玉米粉1.0～5.0％；葡萄糖1.0～3.0％；KH2PO40.05～0.5％；KCl 0.01～0.05％；MgSO4.7H2O 0.001～0.005％；NaNO30.01～0.05％，余量為水；pH6.0～7.0；溫度23～30℃；
裝量10～20ml/250ml；或25～50ml/750ml；培養(yǎng)時(shí)間1～2天；所說(shuō)的菌種是鐮孢霉屬(Fusarium solan)ATCC 46829。
術(shù)語(yǔ)“裝量”指的是在一定體積的發(fā)酵容器中加入的培養(yǎng)基的體積；(3)將發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)孢菌素A的菌種接種于培養(yǎng)基中，接種量為5～15％，然后發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)的工藝條件為培養(yǎng)基重量組成玉米粉2.0～5.0％；葡萄糖1.0～3.0％；面粉1.0～4.0％；干酪素0.6～2.0％；MgSO4.7H2O 0.001～0.005％；KH2PO40.05～0.5％；NaNO30.02～0.15％；KCl 0.01～0.05％；CaCO30.1～0.5％，余量為水；優(yōu)選的組分和重量百分比含量為面粉4.0％，干酪素2.0％；MgSO4.7H2O 0.005％，KH2PO40.2％，NaNO30.15％，KCl 0.05％，余量為水；pH6.0～6.5；溫度25～28℃；裝量10～20ml/250ml；或25～50ml/750ml；培養(yǎng)時(shí)間為4～5天；(4)然后采用常規(guī)的方法，從發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中收集環(huán)孢菌素A。
進(jìn)一步，在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料采用的培養(yǎng)基的濃度為原發(fā)酵培養(yǎng)基濃度的30～40％，補(bǔ)料從發(fā)酵培養(yǎng)20～26小時(shí)開(kāi)始至96小時(shí)，全程補(bǔ)料體積為基礎(chǔ)體積的30～40％。
所述“基礎(chǔ)體積”是指發(fā)酵開(kāi)始時(shí)在發(fā)酵器中裝入的培養(yǎng)基的體積。
本發(fā)明的方法，相對(duì)于原來(lái)的生產(chǎn)配方具有較大的優(yōu)越性，使用新配方發(fā)酵時(shí)CyA產(chǎn)生菌具有菌體合成能力增強(qiáng)、菌體自溶延緩等特點(diǎn)，同時(shí)，由于采用新配方在大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)不發(fā)生泡沫現(xiàn)象，可采用補(bǔ)料工藝，由此克服了工藝中菌體合成速率過(guò)快和合成量過(guò)高而造成溶解氧不足的缺點(diǎn)，延長(zhǎng)了發(fā)酵周期。同時(shí)，由于單位菌體合成CyA的能力大大地得到提高，有效組分的含量提高7％左右、放罐體積增加27％以上、放罐總十億提高159％以上，以及發(fā)酵指數(shù)提高82％以上。成品質(zhì)量無(wú)明顯差別，規(guī)格符合標(biāo)準(zhǔn)。因此，在基本不增加每罐批提取成本的前提下，大大降低了每公斤CyA的制造成本。
分析樣品的制備和測(cè)試分析樣品的制備將待測(cè)發(fā)酵液樣品5ml置于10ml離心管內(nèi)，加入等量的甲醇，搖勻，浸泡1h。以3000r/min速度離心分離10min，上清液置于另一10ml刻度試管內(nèi)。再加入一定量(與已有的上清液相加等于10ml)的甲醇于菌絲體中，進(jìn)行第二次浸泡后以同樣方法分離。合并上清液(如少于10ml，精確加入甲醇至10ml)，搖勻，吸取1ml上清液置于2ml錐形離心管內(nèi)以1000r/min的速度高速離心1min。得到的上清液可直接用于HPLC分析。
HPLC分析測(cè)試色譜柱十八烷基硅烷鍵合反向柱(Hypersil ODS 250×4.6mm，5μm)，由大連化物所國(guó)家色譜中心提供。
分析系統(tǒng)使用Backman黃金系統(tǒng)支持，Backman125泵和Backman168檢測(cè)器。
色譜條件柱溫60℃；流速0.85ml/min；流動(dòng)相甲醇-0.1％KH2PO4緩沖液(80∶20)；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(1)將鐮孢霉屬(Fusarium solan)ATCC 46829。進(jìn)行斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)基重量組成為玉米粉3.0％；葡萄糖2.0％；瓊脂2.0％，余量為水；pH 6.5；溫度25℃，培養(yǎng)時(shí)間7天；(2)種子培養(yǎng)
然后將菌種在如下的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng)基重量組成玉米粉3.0％；葡萄糖2.0％；KH2PO40.2％；KCl0.05％；MgSO4.7H2O 0.005％；NaNO30.05％，余量為水；pH6.5；溫度25℃；裝量為20ml/250ml；培養(yǎng)時(shí)間2天；(3)將發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)孢菌素A的菌種接種于培養(yǎng)基中，接種量為7％，然后發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)的工藝條件為培養(yǎng)基重量組成玉米粉3.0％；葡萄糖3.0％；面粉4.0％；干酪素1.2％；MgSO4.7H2O 0.005％；KH2PO40.2％；NaNO30.15％；KCl0.05％；CaCO30.2％，余量為水；pH6.5；溫度25℃；裝量為20ml/250ml；培養(yǎng)時(shí)間為4天。
(4)然后采用常規(guī)的方法，從發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中收集環(huán)孢菌素A。
采用前述的分析測(cè)試方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下環(huán)孢菌素A發(fā)酵單位為950μg/ml；環(huán)孢菌素A有效組分含量70％。
實(shí)施例2采用實(shí)施例1相同的方法，種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的裝量均為50ml/750ml；發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基重量組成玉米粉3.0％；葡萄糖3.0％；面粉4.0％；干酪素0.6％；MgSO4.7H2O 0.005％；KH2PO40.2％；NaNO30.15％；KCl0.05％；CaCO30.2％，余量為水；采用前述的分析測(cè)試方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下環(huán)孢菌素A發(fā)酵單位為850μg/ml；環(huán)孢菌素A有效組分含量69％。
實(shí)施例3環(huán)孢菌素A通氣培養(yǎng)的研究在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)時(shí)，首先研究了通氣對(duì)CyA生物合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通氣對(duì)CyA的生物合成量影響非常大。表1所示為25℃、培養(yǎng)時(shí)間為4d和培養(yǎng)基裝量分別為50ml/750ml、100ml/750ml、150ml/750ml和200ml/750ml條件下環(huán)孢菌素A產(chǎn)生菌生物合成CyA和其它有關(guān)參數(shù)的代謝情況。
表1不同通氣條件下CyA產(chǎn)生菌生物合成和其它有關(guān)參數(shù)的代謝情況裝 量 CyA效價(jià) CyA含量 菌絲 pH總糖 還原糖氨基酸(ml) (μg/ml)(面積％) 量 (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)50 892 86.1 355.63 1.31 0.10 31.1100963 87.7 395.47 2.32 0.29 35.1150654 83.3 455.49 2.55 0.42 35.3200321 84.7 425.87 3.74 0.44 39.2*即每100ml發(fā)酵液中菌絲體體積(ml)，以下個(gè)表同。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，中等程度的通氣條件(100ml/750ml)，有利于CyA的生物合成。過(guò)高(50ml/750ml)或過(guò)低(大于100ml/750ml)的通氣條件都將不利于CyA的生物合成。
實(shí)施例4環(huán)孢菌素A培養(yǎng)溫度的研究在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)時(shí)，接著研究了培養(yǎng)溫度對(duì)CyA生物合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度對(duì)CyA的生物合成量影響非常大。表2所示為培養(yǎng)基裝量為50ml/750ml、培養(yǎng)時(shí)間為4d和培養(yǎng)溫度分別25、28和30℃條件下CyA產(chǎn)生菌的生物合成和其他有關(guān)參數(shù)的代謝情況。
表2不同溫度下CyA產(chǎn)生菌生物合成和其它有關(guān)參數(shù)的代謝情況溫度CyA效價(jià) CyA含量 菌絲 pH總糖 還原糖 氨基酸(℃)(μg/ml)(面積％) 量 (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)25 892 86.1 35 5.63 1.31 0.10 31.128 653 82.1 43 6.13 3.07 0.48 42.030 321 83.7 31 6.23 3.07 0.58 49.0根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，25℃發(fā)酵條件有利于CyA的生物合成，而培養(yǎng)溫度偏高不利于CyA的生物合成。
實(shí)施例5環(huán)孢菌素A發(fā)酵培養(yǎng)基的研究在培養(yǎng)基試驗(yàn)中所用的不同來(lái)源和不同加工方法的有機(jī)和天然氮源包括干酪素、豆粉、棉籽餅粉、蠶蛹粉、玉米漿、花生粉、麩皮粉、玉米胚芽粉、麩質(zhì)粉、奶粉、酵母粉、蛋氨酸、硝酸鈉、硫酸銨等30余種。
在培養(yǎng)基試驗(yàn)中所用的不同來(lái)源和不同加工方法的有機(jī)和天然碳源包括玉米粉、面粉、米粉、豆油、菜油、豬油、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、糊精、β-環(huán)糊精和甘油等近20種。
在培養(yǎng)基試驗(yàn)種所用的無(wú)機(jī)鹽和微量元素包括氯化鈉、氯化銨、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂、硝酸鈉、硝酸銨、磷酸鹽等10余種。
以上培養(yǎng)基試驗(yàn)采用單因子或多因子添加法以及正交試驗(yàn)等方法來(lái)觀察對(duì)CyA生物合成量和有效組分含量的影響。
采用培養(yǎng)溫度為25℃、培養(yǎng)基裝量為50ml/750ml或20ml/250ml的條件來(lái)進(jìn)行各種有關(guān)培養(yǎng)基成分及其濃度的優(yōu)化試驗(yàn)，并將獲得的高單位培養(yǎng)基配方進(jìn)一步作培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基裝量和pH等試驗(yàn)以保證產(chǎn)生菌在新的培養(yǎng)基環(huán)境下發(fā)揮最大的能力。
經(jīng)過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室收集到的30余種不同來(lái)源和不同加工方法的有機(jī)和天然的氮源，近20種不同來(lái)源和不同加工方法的有機(jī)和天然的碳源以及10余種無(wú)機(jī)鹽和微量元素進(jìn)行了4000多次的培養(yǎng)基配方篩選試驗(yàn)，最終獲得了目前在實(shí)驗(yàn)室水平發(fā)揮最佳的新配方。用原始配方和新配方培養(yǎng)CyA產(chǎn)生菌時(shí)的各種參數(shù)變化(培養(yǎng)溫度為25℃、培養(yǎng)基裝量為50ml/750ml，用原始配方時(shí)的發(fā)酵周期為4d，用新配方的培養(yǎng)基裝量為50ml/750ml，發(fā)酵周期為5d)的結(jié)果見(jiàn)表3所示。
新配方的組成(％)面粉4.0；干酪素(加熱自制)2.0；MgSO4.7H2O0.005；KH2PO40.2；NaNO30.15；KCl 0.05；pH6.5。
表3用原始配方和新配方(括號(hào)內(nèi)數(shù)據(jù))培養(yǎng)CyA產(chǎn)生菌的各種參數(shù)變化發(fā)酵時(shí) CyA效價(jià)CyA含量 菌絲量 pH 總糖 還原糖 氨基酸間(h)(μg/ml) (面積％) (mg/ml) (mg/ml (mg/ml))0 0(0) 0(0) 5.345.61 1.3832.1(35.7)(5.73) (6.40) (2.56)2442(35)95.1(96.3) 16 5.275.13 0.8645.3(42.1)(19)(5.82) (6.20) (2.27)48127 91.3(94.2) 18 5.414.31 0.5143.4(46.2)(135)(25)(5.66) (4.68) (1.07)72296 88.7(89.5) 30 5.513.63 0.3642.1(44.8)(338)(37)(5.65) (4.26) (0.66)96683 85.4(87.7) 33 5.72 2.15 0.2737.8(41.7)(937)(39)(5.47) (2.85) (0.53)120 896 86.1(87.2) 31 5.63 1.31 0.1036.3(38.0)(1623)(34)(5.41) (2.17) (0.38)實(shí)施例6根據(jù)實(shí)施例3和實(shí)施例5的結(jié)果，采用實(shí)施例的方法進(jìn)一步比較在不同通氣條件下，用新老發(fā)酵配方培養(yǎng)CyA產(chǎn)生菌時(shí)的影響，其結(jié)果如表4所示。
表4不同通氣條件下使用新發(fā)酵配方對(duì)CyA產(chǎn)生菌生物合成和其它有關(guān)參數(shù)的影響裝量 CyA效價(jià) CyA含量(面 菌絲 pH總糖 還原糖 氨基酸(ml) (μg/ml) 積％) 量 (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)501623 87.2 345.41 2.170.38 38.0100 1597 88.2 426.62 2.200.36 39.2150 1120 83.5 346.93 2.170.22 38.7200 510 81.8 366.43 1.890.10 40.6根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用新配方后通氣程度應(yīng)該適當(dāng)提高，否則CyA的生物合成量有所下降。
實(shí)施例7
根據(jù)實(shí)施例5和實(shí)施例5的結(jié)果，采用實(shí)施例的方法進(jìn)一步比較在不同溫度條件下，用新老發(fā)酵配方培養(yǎng)CyA產(chǎn)生菌時(shí)的影響，其結(jié)果如表5所示。
表5不同溫度下使用新發(fā)酵配方對(duì)CyA產(chǎn)生菌生物合成和其它有關(guān)參數(shù)的影響溫 度 CyA效價(jià)CyA含量 菌絲 PH 總糖 還原糖 氨基酸(℃) (μg/ml) (面積％) 量 (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)251623 87.2 345.41 2.17 0.3838.02886585.4 405.43 2.13 0.3846.23072185.7 375.21 2.63 0.1037.8根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用新配方培養(yǎng)時(shí)的溫度仍然采用25℃為好，其不僅發(fā)酵單位有了很大的提高，且有效組分含量也有所提高，相反菌絲量有所下降，這都有利于下游的分離純化。
實(shí)施例8環(huán)孢菌素A在20噸發(fā)酵罐上的研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果，可知用于CyA發(fā)酵的新配方相對(duì)于原來(lái)的生產(chǎn)配方具有較大的優(yōu)越性。工廠在中試放大過(guò)程中根據(jù)使用新配方發(fā)酵時(shí)CyA產(chǎn)生菌具有菌體合成能力增強(qiáng)、菌體自溶延緩等特點(diǎn)，做了大量工藝條件優(yōu)化工作，重點(diǎn)對(duì)新配方進(jìn)行了進(jìn)一步的調(diào)整。
同時(shí)，由于采用實(shí)驗(yàn)室得到的新配方在大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)不發(fā)生泡沫現(xiàn)象，從而采取了補(bǔ)料工藝。由此克服了工藝中菌體合成速率過(guò)快和合成量過(guò)高而造成溶解氧不足的缺點(diǎn)，延長(zhǎng)了發(fā)酵周期。同時(shí)，由于單位菌體合成CyA的能力大大地得到提高，因此，在基本不增加每罐批提取成本的前提下，大大降低了每公斤CyA的制造成本。表6為采用新老發(fā)酵工藝生產(chǎn)CyA的生物效價(jià)、CyA的組分含量、放罐體積、放罐總億和發(fā)酵指數(shù)的比較。
補(bǔ)料工藝為原基礎(chǔ)發(fā)酵配方2倍稀釋，并從發(fā)酵至24小時(shí)開(kāi)始流加至96小時(shí)結(jié)束。整個(gè)補(bǔ)料體積為基礎(chǔ)體積的三分之一。
表6新老工藝發(fā)酵生產(chǎn)CyA的有關(guān)參數(shù)比較(評(píng)均)參數(shù) CyA效價(jià) CyA含量 放罐體積 放罐總億 發(fā)酵指數(shù)(μg/ml) (面積％) (L)(十億)老工藝1028.771.6 11155 11.106 0.0496新工藝2023 76.5 14198 28.74 0.0906提高％96.66 6.84 27.28 158.88 82.66*為20t罐8批數(shù)據(jù)的平均值。
實(shí)施例9為了使在實(shí)驗(yàn)室所獲得的新配方能夠放心地應(yīng)用于中試和生產(chǎn)規(guī)模試驗(yàn)，對(duì)用新舊配方培養(yǎng)CyA產(chǎn)生菌地的產(chǎn)物(在相同的HPLC條件下出現(xiàn)的峰)進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描比較，結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有任何變化，證明用新、舊配方培養(yǎng)CyA產(chǎn)生菌的產(chǎn)物相同。因此可進(jìn)行中試和工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模試驗(yàn)。
權(quán)利要求
1.一種環(huán)孢菌素A發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，包括下列步驟(1)斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基重量組成為玉米粉1.0～3.0％；葡萄糖1.0～2.0％；瓊脂1.5～2.2％，余量為水；(2)種子培養(yǎng)然后將菌種在如下的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng)基重量組成為玉米粉1.0～3.0％；葡萄糖1.0～2.0％；KH2PO40.1～0.2％；KCl 0.01～0.05％；MgSO4.7H2O 0.001～0.005％；NaNO30.01～0.05％，余量為水；所說(shuō)的菌種是鐮孢霉屬(Fusarium solan)ATCC 46829。(3)將發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)孢菌素A的菌種接種于培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；培養(yǎng)基重量組成為玉米粉1.0～3.0％；葡萄糖1.0～3.0％；面粉2.0～4.0％；干酪素0.6～2.5％；MgSO4.7H2O 0.001～0.005％；KH2PO40.05～0.2％；NaNO30.05～0.15％；KCl 0.01～0.05％；CaCO30.1～0.2％；余量為水；pH6.0～6.5；溫度23～28℃；培養(yǎng)時(shí)間為4～5天；(4)然后采用常規(guī)的方法，從發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中收集環(huán)孢菌素A。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，斜面培養(yǎng)時(shí)pH6.0～6.5；溫度23～28℃，培養(yǎng)時(shí)間6～8天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，種子培養(yǎng)時(shí)的pH6.0～6.5；溫度23～28℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，種子培養(yǎng)時(shí)的裝量為10～20ml/250ml或25～50ml/750ml；培養(yǎng)時(shí)間1～2天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)的pH6.0～6.5；溫度23～28℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)的裝量為10～20ml/250ml或25～50ml/750ml；培養(yǎng)時(shí)間為4～6天。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料采用的培養(yǎng)基的濃度為原發(fā)酵培養(yǎng)基濃度的30～40％，補(bǔ)料從發(fā)酵培養(yǎng)20～26小時(shí)開(kāi)始至90～100小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，全程補(bǔ)料體積為基礎(chǔ)體積的30～40％。
9.一種環(huán)孢菌素A原料發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，組分和重量百分比含量為面粉4.0％，干酪素2.0％；MgSO4.7H2O 0.005％，KH2PO40.2％，NaNO30.15％，KCl 0.05％，余量為水。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域微生物藥物技術(shù)。本發(fā)明提供了一種環(huán)孢菌素A原料發(fā)酵生產(chǎn)新工藝。本發(fā)明的工藝采用了新的培養(yǎng)基成分和濃度，以及新的培養(yǎng)條件，使環(huán)孢菌素A產(chǎn)生菌的生物合成周期延長(zhǎng)，克服了大生產(chǎn)過(guò)程中出現(xiàn)的泡沫問(wèn)題，從而能夠采用補(bǔ)料工藝，最終在20t生產(chǎn)規(guī)模使發(fā)酵液中環(huán)孢菌素A的發(fā)酵單位上升100％、有效組分的含量提高7％左右、放罐體積增加27％以上、放罐總十億提高159％以上，以及發(fā)酵指數(shù)提高82％以上。成品質(zhì)量無(wú)明顯差別，規(guī)格符合標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號(hào)C12PGK1570130SQ20041001817
公開(kāi)日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2004年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月9日
發(fā)明者陳代杰, 吳暉, 李繼安, 戈梅, 吳萍, 吳飛, 夏云飛 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院