專利名稱：利用芳香族硫醚配體分離的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及將核酸分子，尤其是質(zhì)粒與溶液中其它組分分離的方法。該方法利用芳香族硫醚配體來吸附核酸分子并提供了一種新的脫附吸附分子的方式，大大地提高了該方法的總的分離效率。本方法優(yōu)選地為一種色譜方法。
背景技術：
在最近十年，向病人給藥治療基因已成為預防或治療各種疾病的現(xiàn)實。通常在最大限度地減少病毒感染危險的臨床應用中優(yōu)選使用非病毒載體。這增加了對用于基因治療的高度純化質(zhì)粒以及基于質(zhì)粒的疫苗的需求。衛(wèi)生管理機構提出的嚴格指南和規(guī)則要求用于臨床應用的純化超螺旋質(zhì)粒DNA的均質(zhì)制劑。
色譜法是用于小規(guī)模和大規(guī)模純化超螺旋質(zhì)粒DNA的方法(Ferreira，G.N.M.，Prazeres，D.M.F.，Cabral，J.M.S.，和Schleef，M.Plasmid manufacturing-綜述。在Schleef，M.(Ed.)Plasmidsfor therapy and vaccinationWiley Wiley-VCHWeinheim，2001，p.193-236)。基于大小排阻、離子交換和疏水作用層析(HIC)的分離方法已被證明適于純化質(zhì)粒DNA(Ferreira，G.N.M.，Monteiro，G.A.，Prazeres，D.M.F.，和Cabra ，J.M.S.Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNAvaccine applications，TIBTECH 2000；18，380-388)。基于固定化的合成寡核苷酸與質(zhì)粒DNA的一段序列之間的序列特異性作用的親和層析，也已被建議使用(Schluep，T.，和Cooney，C.L.Purifi-cation of plasmids by triplex affinity interaction，NucleicAcids Research 1998；26，4524-4528)。然而，這些技術均不能產(chǎn)生用于非分析應用的充分量的超螺旋質(zhì)粒DNA的均質(zhì)制劑。
為了解決這個問題，過去人們努力致力于開發(fā)使質(zhì)粒DNA切口形式的形成最小化的樣品制備技術。然而，這種方法難以重復且因此產(chǎn)生的質(zhì)粒DNA的品質(zhì)不能滿足終產(chǎn)品所需的嚴格要求(Levy，M.S.，0′Kennedy，R.D.，Ayazi-Shamlou，P.，和Dunnill，P.Biochemical engineering approaches to the challenges ofproducing pure plasmid DNA.Trends in Biotechnology 2000；18，296-305)。因此，發(fā)展一種顯著減少最佳化上游過程的乏味努力的新的和穩(wěn)定的分離超螺旋質(zhì)粒DNA的方案已經(jīng)成為一種公認的需求。
Oscarsson等人提出了用親硫色譜法(Oscarsson，S.，和Porath，J.Covalent chromatography and salt-promoted thiophilicadsorption. Analytical Bio-chemistry 1989；176，330-337；Porath，J.，Maisano，F(xiàn).，和Belew，M.Thiophilic adsorption-anew method for protein fractionation.FEBS Letters 1985；185，306-310)來純化蛋白。在隨后的專利申請WO95/33557中，Oscarsson和Porath公開了一種耐堿的蛋白吸附劑，其類似于1989年所討論的，但其親硫基團已與配體的其余基團距離遠以提高在堿性環(huán)境中的特性。通過感膠鹽的高濃度促進了蛋白質(zhì)的吸附，且利用疏水作用層析(HIC)中常用的條件實現(xiàn)脫附作用，疏水作用層析是用另一種較少感膠的鹽或僅僅用水代替該種感膠鹽。
近年來，不同配體結構物包括硫醚在適用于大規(guī)模方法的條件下結合質(zhì)粒DNA的不同同種型的能力已被人們所研究。這些公開在瑞典專利申請SE0101380.4中，然而在本申請登記的時候沒有公開。因此限定“最佳配體”與超螺旋質(zhì)粒DNA相互作用所需的特異性結構物以及對其選擇性地純化是可能的。結果，人們鑒定了一組新的親硫配體，即芳香族硫醚，其有效地辨別質(zhì)粒DNA的同種型。含有這些配體的基質(zhì)已顯示能從其同種型，即在單一色譜法步驟中的開環(huán)(oc)形式中有效地分離超螺旋(共價閉環(huán)(ccc))質(zhì)粒DNA。因此，應用這些基質(zhì)好象有可能且應該會促進用于基因治療和DNA疫苗應用的高度純化的超螺旋質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)。
然而，盡管質(zhì)粒DNA可與其同種型分離，其它的問題仍需進一步的解決。例如，含有目的核酸的細胞溶解產(chǎn)物通常也包括一種或多種蛋白質(zhì)，諸如酶，或各種降解產(chǎn)物。盡管以前所報道的方法基本上能夠分離蛋白與目的核酸，但獲得的分離度仍然不能充分地滿足有效的生產(chǎn)過程的要求。包括脫氧核酸(DNA)的細胞溶解產(chǎn)物通常也包括核糖核酸(RNA)和一些殘留的蛋白質(zhì)。然而，在上述所討論的上下文中，當質(zhì)粒DNA是用于藥用目的時，二者成為必須被除去的污染物。此外，質(zhì)粒DNA的色譜純化在大多數(shù)情況下導致內(nèi)毒素即宿主細菌的膜組分的共純化，而內(nèi)毒素毫無疑問是必須要被除去的以滿足藥用產(chǎn)品的嚴格要求。因此，人們需要改進現(xiàn)有的利用親硫色譜法分離核酸和上述污染物的純化方案。
本發(fā)明的概述本發(fā)明的一個目的是提供一種利用含有一種或多種芳香族硫醚配體的基質(zhì)從溶液中分離核酸，諸如DNA的可選擇的方法。這個目的和其它的目的可通過附加的權利要求書所公開的方法來實現(xiàn)。
本發(fā)明的更具體的目的是提供一種使與基質(zhì)結合的分子脫附的方法，該方法提供了質(zhì)粒與一種或多種不希望得到的組分，諸如蛋白質(zhì)、RNA和/或內(nèi)毒素的更有效的分離。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種如上所述的脫附方法，其也能夠?qū)⒉煌馁|(zhì)粒同種型彼此分離，更具體地分離ccc質(zhì)粒DNA與oc質(zhì)粒DNA。
定義此處應用的術語“蛋白質(zhì)”包括全部蛋白以及部分或痕量蛋白及其它含有肽結構的分子。
此處所用的術語“核酸分子”與術語“核苷酸”同義且包括DNA，例如質(zhì)粒，諸如開環(huán)(oc或切口的)質(zhì)粒DNA，超螺旋(ccc)質(zhì)粒DNA及其它DNA，諸如基因組DNA，以及RNA，諸如mRNA，tRNA和sRNA。
短語“讓溶液/洗脫液流經(jīng)基質(zhì)”是指任意的讓基質(zhì)與溶液或洗脫液接觸且在特定的一段時間后將其去除的方式。因此，該術語包括動態(tài)層析法以及批次方法。
此處所用的術語“洗脫液”為在色譜法中的常規(guī)含義，即一種能夠干擾固相(吸附基質(zhì))和產(chǎn)物(核酸分子)之間相互作用并促進產(chǎn)物從固相選擇性地解離的溶液。
術語“感膠的”是影響溶劑中疏水的相互作用特性的離子能力的大小。
附圖的簡要說明

圖1顯示了具有分離特性且因此對于本發(fā)明是有用的芳香族硫醚配體的實例。
圖2顯示了堿溶解產(chǎn)物的組分離導致質(zhì)粒DNA和RNA組分分離后獲得的色譜圖。
圖3a-d顯示了通過對插入物中描述的配體進行層析后獲得的結果。圖3e顯示了通過對芳香族硫醚配體進行層析后獲得的樣品進行激光誘導的熒光毛細管凝膠電泳后的電泳圖譜。
圖4是說明結合在芳香族硫醚配體上的澄清的堿溶解產(chǎn)物以及不同的核酸組分的洗脫色譜圖。
圖5是描述通過對芳香族硫醚配體進行層析之后的質(zhì)粒DNA、RNA以及脂多糖的分布圖。
圖6顯示了通過對芳香族硫醚配體進行免疫球蛋白層析之后獲得的結果。
圖7是說明通過增加KCl梯度洗脫質(zhì)粒DNA的色譜圖。
圖8是顯示利用Na2SO4作為感膠鹽通過芳香族硫醚配體來純化質(zhì)粒DNA的色譜圖。
圖9顯示了說明當比較漸減的鹽洗脫(附圖9a)與漸增的鹽洗脫(附圖9b)時內(nèi)毒素分布的差別的色譜圖。
本發(fā)明的具體描述更具體地，本發(fā)明的第一個方面是一種分離溶液中污染物與核酸分子的方法，該方法包括以下步驟(a)提供一種吸附水溶液，其含有核酸以及當溶解時形成感膠離子的鹽；(b)讓所述溶液流經(jīng)基質(zhì)使目的核酸吸附到該基質(zhì)上，所述基質(zhì)含有一個芳環(huán)部分和至少一個硫醚部分；(c)選擇性地洗滌所述基質(zhì)；(d)讓水相洗脫液流經(jīng)基質(zhì)來脫附其中的核酸分子，該洗脫液除了含有形成感膠離子的鹽之外，也含有來自于遞增的鹽濃度的遞增的離子強度梯度，該鹽在溶解時形成了比在吸附過程中呈現(xiàn)的離子的感膠性小的感膠離子；和
(e)分離含有所要核酸分子的組分。
在最優(yōu)選的實施方案中，步驟(a)和(d)中所指的離子為各種鹽溶解時所形成的陰離子。
本發(fā)明的方法可用于分離在細胞，例如重組細胞中表達的核酸分子。因此，其也包括破碎細胞來提供含有核酸分子的溶液的第一步驟。這種破碎可按照標準的方法通過例如裂解，諸如堿裂解法來進行(參見例如，Maniatis，T，F(xiàn)ritsch，E.F.和Sambrook，J.(1982)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press，Cold Spring Harbour，NY)。因此，上述步驟(a)中提供的溶液優(yōu)選地基本上不含細胞碎片。此外，本發(fā)明對于分析溶液中的核苷酸混合物即用于分析目的的分離也是有用的。
在本方法的有利實施方案中，按照步驟(e)分離的組分為質(zhì)粒DNA，其基本上不含RNA。正如上述所討論的，這是藥物制備中的一個嚴格要求。如下述實驗部分所顯示的，在DNA洗脫過程中RNA與基質(zhì)保持穩(wěn)固地結合。如果需要，RNA然后可通過用水或低鹽緩沖液洗滌基質(zhì)被輕易地除去，例如用于基質(zhì)的再生。然而，在一個可選擇的實施方案中，本發(fā)明是一種從也含有DNA的溶液中回收RNA，例如用于科學研究的方法。這兩個實施方案顯示出出乎意料的優(yōu)點，不僅核酸分子彼此分離，而且也與污染物諸如存在于溶液中的蛋白組分和內(nèi)毒素相分離。如實驗部分將要顯示的，與本發(fā)明中所用的基質(zhì)結合的蛋白在與核酸不同的階段被洗脫，且因此可收集在一個分離的組分中。
本發(fā)明表明了通過利用從含有芳香族硫醚配體的基質(zhì)洗脫的新原理來分離兩個蛋白組分以及將細胞溶解產(chǎn)物中的DNA和RNA分離是有可能的。此外，本方法也已被表明能有效地分離目的核酸分子與其它污染物，諸如內(nèi)毒素。因此，本發(fā)明的方法在例如純化用于基因治療的核酸、DNA疫苗和與基因治療相關的實驗室研究方面是有用的。在一個有利的實施方案中，本發(fā)明的方法將提供可接受的基因治療級的分離的超螺旋質(zhì)粒DNA。如上所述，以前描述的用于分離此種載體的方法沒有滿足此目的。
在本方法的一個實施方案中，步驟(a)的溶液含有一種溶解的堿金屬鹽，諸如硫酸銨或硫酸鈉。因此，吸附過程中存在的陰離子為強烈感膠的硫酸鹽離子。在一個特異性實施方案中，所述鹽的濃度低于大約3.0M，諸如大約為2.5M。本領域的技術人員能夠認識到，上限取決于每種鹽的溶解能力。然而，本領域的技術人員應能認識到，在不同的情況中要求不同的鹽濃度，不僅取決于基質(zhì)所應用的特異性配體，而且取決于待分離的核酸。吸附步驟中溶液的pH可不同于洗脫步驟中的pH。然而，為了確保待分離的核酸的穩(wěn)定性，pH應保持在生理學的pH，即大約6.5-8.5的范圍內(nèi)。
在一個有利的實施方案中，已被吸附的所要核酸的基質(zhì)在依照步驟(d)洗脫之前被進行洗滌。在洗滌過程中，松弛結合的污染物被除去。本領域的技術人員可以依照標準方法很容易地進行此種洗滌。
利用合適的水性洗脫液進行本發(fā)明的步驟(d)，其除了具有形成感膠離子的鹽之外也包括遞增的離子強度的梯度，例如一個連續(xù)梯度。然而，為了某種目的如大規(guī)模生產(chǎn)超螺旋質(zhì)粒DNA，人們也許希望利用逐步的梯度。
步驟(d)所用洗脫液的遞增的離子強度被通過洗脫液中鹽的遞增的濃度來提供，所述鹽能夠比溶于吸附溶液的鹽形成較少的感膠離子，諸如陰離子。本領域的技術人員眾所周知，離子的感膠特性可根據(jù)Hofmeister或感膠離子序來評價。溶解鹽將逐步改變?nèi)軇┲械臈l件，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)此種改變對于脫附易分離的組分DNA和RNA是有用的。事實上，人們發(fā)現(xiàn)對于大多數(shù)的配體來說，僅僅通過添加水就將RNA作為最后的組分中洗脫下來。蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素可僅僅通過添加水來除去，表明這些分子對基質(zhì)僅僅有疏水結合機制，完全不同于核酸展開機制。在一個實施方案中，溶于洗脫液的鹽是一種堿金屬鹽，諸如氯化鈉或氯化鉀。因此，較少感膠的陰離子是氯化物離子。在一個特異性實施方案中，鹽的最大濃度大約為3M。然而，如上所述就溶于吸附溶液的鹽來說，對于每一特異性配體和所要的核酸而言，可能需要一些常規(guī)實驗來確定最佳條件。類似于吸附步驟，洗脫過程中的pH值應保持在其中核酸是穩(wěn)定的范圍之內(nèi)。
因此，本發(fā)明基于出乎意料的發(fā)現(xiàn)，通過芳香族硫醚配體吸附于基質(zhì)上的核酸可通過上述所討論的遞增的離子強度梯度被有效地洗脫。更具體地，該洗脫液除了增加的離子強度的梯度之外，還包括形成感膠離子諸如用于吸附步驟中的緩沖液的鹽。這些與最近采用的芳香族硫醚配體基質(zhì)，例如在上述討論的WO95/33557中的完全相反，其中洗脫是通過從洗脫緩沖液中除去感膠鹽來進行的。因此，在現(xiàn)有技術中，芳香族硫醚的洗脫是通過加入水溶液(其稀釋感膠鹽)或通過加入能代替該感膠鹽的鹽來進行的。換句話說，總的鹽濃度在洗脫過程中被減少或保持在一個類似的值。然而，本發(fā)明人第一個表明了芳香族硫醚配體的洗脫可通過利用附加了漸增的離子強度梯度的吸附中所用的相同的緩沖液來進行。
至于本方法中利用的基質(zhì)，其由下面具體討論的與支持物通過硫醚鍵偶合的配體組成。每一基質(zhì)可包括一種或多種的配體結構。
在一個實施方案中，所用的配體含有一個芳香族硫醚，其中芳基基團選自吡啶基、苯基、苯甲基、甲苯?；⒈揭一?、萘基、咪唑基、吡唑基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、哌啶基、嗎啉基、哌嗪基、吲哚基、喹啉基以及嘌呤基基團。
在一個有利的實施方案中，吡啶基-S和/或苯基還含有芳基基團上的取代基，例如如圖1中所示。
附著于形成本發(fā)明基質(zhì)的載體材料上的配體可以是一個巰基-吡啶、巰基烷基吡啶。因此其是通過硫醚鍵附著于載體上的巰基基團。進一步，如上所述，配體的芳基基團形成部分可以是苯基、苯甲基、甲苯?；⒈揭一?、萘基、咪唑基、吡唑基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、哌啶基、嗎啉基、哌嗪基、吲哚基、喹啉基、嘌呤基。其它的取代基也可被添加到芳環(huán)上。通過提供具有其它取代基的芳香族硫醚配體，可設計大量不同的分離基質(zhì)。取代基可例如是一個或多個胺基、硝基、醚基、硫醇基和/或鹵素，例如氟。這些其它的取代基還可以進一步地包括碳原子，如需要的話。同樣，本領域的技術人員可以認識到，在上述討論的環(huán)狀結構中碳原子可被雜原子取代。此處的術語“芳香族硫醚配體”應被理解為包括大量的可被取代到所要程度的化合物，其中的一些被舉例說明在圖1中。配體密度可以是10-500μmol/毫升載體，優(yōu)選在10-100μmol載體的范圍內(nèi)。
本發(fā)明中所用的基質(zhì)包括可以是與支持物偶合的一個相同或不同的化學結構的配體。支持物可以為任意合適的形式，諸如基本上球狀的顆粒、膜、濾紙、微量滴定板等等。支持物可以是任意合適的，眾所周知的無機或有機材料。
無機支持物材料的實例為玻璃、硅石或其它惰性的顆粒狀礦物質(zhì)。有機支持物的實例為瓊脂糖、右旋糖酐、二乙烯基苯等等。許多可利用的市售的產(chǎn)品基于不同的樹脂或聚合物，例如瓊脂糖或交聯(lián)的瓊脂糖(諸如瓊脂糖TM，Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)、右旋糖酐(諸如SephadexTM，Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)、聚苯乙烯/二乙烯基苯(MonobeadsTM，SOURCETM，AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)、包被的聚苯乙烯、丙烯酸聚合物、右旋糖酐丙烯酸聚合物(SephacrylTM，amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)、乙烯接枝聚合物或乙烯聚合物，基于硅石的不同樹脂諸如硅石-右旋糖酐、硅石-丙烯酸聚合物以及硅石-聚乙烯亞胺。在一個有利的實施方案中，基質(zhì)是交聯(lián)的瓊脂糖，其例如利用環(huán)氧基活化可以被配體功能化。
本發(fā)明的方法可以用以膨脹床或填充床的形式排列的基質(zhì)來實施，且可以是動力學的即層析分離或以批次的方式進行。在填充床吸附中，基質(zhì)被填充在色譜柱中且所有在純化過程中使用的溶液流過，通常以相同的方向流經(jīng)柱。然而在膨脹床吸附中，通過讓液體流過柱，通過通常從下面施加液體流通過柱來使基質(zhì)膨脹和平衡。當在應用樣品和洗滌步驟過程中在粒子沉降或上升速率和流速之間有一種平衡時，形成了穩(wěn)定的流化膨脹床。在膨脹床的洗脫步驟中，基質(zhì)被沉淀且表現(xiàn)如同一種填充床的基質(zhì)。
在一個實施方案中，基質(zhì)粒子的平均大小在大約10-300μm的范圍內(nèi)，例如，在10-20、20-50、50-100、100-200或200-300μm的范圍內(nèi)。然而，粒子可以被有利地制備為用于有效的市售濾網(wǎng)篩子設備的任意大小，諸如250、212、180、150、125、106、90、75、63、45、37、30、25、20、15μm。
附圖的詳細說明圖1顯示了各種與瓊脂糖TM6速流(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)反應的芳香族硫醚化合物的實例。如此附圖所顯示的，芳香族硫醚化合物可以具有不同的取代基，每一個都可以產(chǎn)生能證明有利于不同目的的結合和洗脫的特性。
圖2說明了質(zhì)粒DNA的制備。將堿溶解產(chǎn)物加載到在2.0M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCI，pH7.0中預處理的瓊脂糖TM6速流(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)柱中。在30cm/h下層析后，質(zhì)粒DNA被與RNA分離開。此外，質(zhì)粒DNA可立即收集在緩沖液中用于進一步的親硫芳香族層析分離實驗。
圖3a和3b說明了通過用本發(fā)明的芳香族硫醚配體在不同的柱上純化超螺旋質(zhì)粒DNA。如圖2所述制備質(zhì)粒DNA樣品并加載到用2.0M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-Cl，pH7.0預處理的柱中。用在相同緩沖液中的2M NaCl的梯度獲得了超螺旋質(zhì)粒DNA的脫附。在這些條件下，開環(huán)質(zhì)粒DNA不與基質(zhì)結合，而超螺旋質(zhì)粒DNA結合且可通過漸增的NaCl-濃度洗脫。圖3c和3d為類似配體的比較實例，其然而，要么不是芳香族(附圖3c)，要么沒有硫醚的存在(附圖3d)。實驗使用與圖3a和3b中相同的樣品和緩沖液進行。從色譜圖可清楚地看出這些最后提到的配體都不適合圖3a和附圖3b描述的層析分離類型。圖3e描述了在對類似于附圖3a的實驗中獲得的樣品進行激光誘導熒光毛細管凝膠電泳后的電泳圖譜。通過芳香族硫醚配體，質(zhì)粒DNA的開環(huán)形式?jīng)]有保留，而質(zhì)粒的超螺旋形式被吸附并在線性梯度的早期被洗脫。
圖4說明了堿溶解產(chǎn)物對親硫芳香族層析基質(zhì)的吸附及解吸附。用4M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCI，pH7.0稀釋澄清的堿溶解產(chǎn)物樣品來獲得終濃度為2.25M的(NH4)2SO4，。在2.25M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mMTris-HCI，pH7.0，所有的核酸分子均吸附于基質(zhì)。然而不同核酸的脫附是不同的。質(zhì)粒DNA的同種型可通過2.25M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0緩沖液(以較高放大率加入)中的3M NaCl的梯度來分離，而RNA僅僅用較少的(NH4)2SO4梯度就可從基質(zhì)洗脫，結果產(chǎn)生了不同類型核酸分子的完全和有力的分離。
圖5描述了質(zhì)粒DNA和脂多糖(LPS)之間的分離。質(zhì)粒DNA用RNA和熒光LPS摻料并加載于2-巰基吡啶瓊脂糖TM6速流柱(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)上，用2.25M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0平衡。質(zhì)粒DNA同種型是通過將平衡緩沖液中的電導梯度增加到3M NaCl進行洗脫的，而RNA和LPS的洗脫通過將電導梯度減少到水來進行。
圖6顯示了免疫球蛋白如何可吸附于在1.0M(NH4)2SO4，10mMEDTA，100mMTris-HCl，pH7.0中的2-巰基吡啶瓊脂糖TM6速流柱(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)上。然而它們不能通過用NaCl增加電導來洗脫。為了脫附蛋白質(zhì)，電導率應通過降低(NH4)2SO4-濃度來減小。這些表明存在疏水結合原理，不同于核酸分子與本發(fā)明所用的芳香族硫醚型配體的結合機制。
圖7表明了其它用于洗脫質(zhì)粒DNA分子的鹽可代替NaCl。如附圖2中所制備的將質(zhì)粒DNA加載在2.0M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0中的2-巰基吡啶瓊脂糖TM6速流柱(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)上并用在加樣緩沖液中梯度洗脫到1M KCl。
圖8說明了如何將質(zhì)粒DNA加載在用3.0M Na2SO4，10mM EDTA，100mMTris-HCl，pH7.0預處理的柱中并在用于預處理的緩沖液中梯度洗脫到1M NaCl。因此，附圖證明了用于將核酸分子結合到親硫芳香族色譜基質(zhì)的疏水鹽的替換。
圖9a和b說明了當利用遞減的或遞增的鹽濃度從本發(fā)明的芳香族硫醚配體上洗脫的內(nèi)毒素分布的差異。將如附圖2中制備的質(zhì)粒DNA加載在2.0M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0下的2-巰基吡啶瓊脂糖TM6速流柱(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)上，然后在加樣緩沖液中梯度洗脫到1M KCl。因此將超螺旋質(zhì)粒DNA梯度洗脫到水(附圖9a)或到2M NaCl，2.0M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0然后到水(附圖9b)。利用標準的LAL-試驗來測定一些組分的內(nèi)毒素的含量。從實驗可清楚地看出，當減少電導率時大部分的內(nèi)毒素被洗脫。因此，超螺旋質(zhì)粒DNA被優(yōu)選地通過增加傳導率來洗脫。通過此方式，超螺旋質(zhì)粒DNA被洗脫并可被收集而不與內(nèi)毒素一起共洗脫。
實驗部分下面將通過實施例的方式來公開本發(fā)明，其僅僅用于說明的目的且不應被理解為對如附加的權利要求書所定義的本發(fā)明的限制。下面所提及的或本申請其它地方的所有的參考文獻均通過參考文獻引入。
層析介質(zhì)原型將所有的配體(圖2a到2d中的插入物)通過已知的方法偶合于環(huán)氧基活化的瓊脂糖TM6速流柱(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)(Hermanson，G.T.，Mallia，A.K.& Smith，P.K.Immobilised affinity ligand techniques.Academic PressLimited，London，1992，p.51-132)上。配體濃度被選擇為過量的，超過有效的結合部位且洗滌后，通過元素分析(硫或氮)檢查偶合配體的量。
質(zhì)粒DNA由具有代表蛋白A的部分插入序列的pUC19質(zhì)粒(在這里插入物的同一性是不重要的)組成的6125個堿基對的質(zhì)粒被用于此研究。通過已確立的方法，質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染并在E.coli TG1α中生長(Sambrook，J.，和Russel，D.W.Molecular cloninga laboratory manual，ColdSpring Harbor，New York，2001)。根據(jù)Horn等人的方法(Horn，N.A.，Meek，J.A.，Budahazi，G.，和Marquet，M.Cancer genetherapy using plasmid DNApurification of DNA for humanclinical trials.Human Gene Therapy 1995；6，565-573)制備澄清的堿溶解產(chǎn)物。粗的質(zhì)粒DNA制品(含有開環(huán)的和超螺旋同種型兩種)被制備并應用在附圖2中。
將1升的澄清的堿溶解產(chǎn)物以30cm/h加載于裝填在INdEX 100柱(Amersham Bio-sciences)上的瓊脂糖6速流柱(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)以便將緩沖液改變?yōu)樵?0mM EDTA，100mM Tris-HCI，pH7.0中的期望的SO42-濃度(在圖3，7和9中為2.0M(NH4)2SO4；在圖4和6中為2.25M(NH4)2SO4；在圖8中為3.0MNa2SO4)。同時，此方法也除去了RNA和其它的污染物(沒有顯示)。
色譜方法用KTATM探索者(Amersham Biosciences)以75cm/h進行柱層析。將樣品加載于以在10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0中的合適的SO42-濃度預處理的柱上(在圖5中為1.0M(NH4)2SO4；在圖3、7和9中為2.0M(NH4)2SO4；在圖4和6中為2.25M(NH4)2SO4；在圖8中為3.0M Na2SO4)以及在相同的緩沖液中梯度洗脫到鹽(在圖3a-d中為2M NaCl，在圖4、5、6、8和9b中為3M NaCl，在圖7中為1M KCl)或洗脫到在10(附圖3，5和6)或5(附圖4，7，8和9a-b)柱體積的水(附圖9a)。在圖4、5、6、8和9b中，鹽梯度繼之以水梯度來完全除去污染物。
熒光脂多糖為了評估層析法中內(nèi)毒素的洗脫分布圖，在5ml的包含不同質(zhì)粒DNA的同種型的樣品中摻入RNA和2.5μg/ml的熒光標記的來自大腸桿菌的10,000Da的脂多糖同種型(同種型055:B5，Molecular Probes，Leiden，The Netherlands)。收集組分并根據(jù)廠商的說明記錄熒光。
分析方法圖4和5中的峰1、2、3和4被通過其260nm/280nm的吸收比率和在1％瓊脂糖凝膠電泳上的電泳遷移圖以及溴化乙錠染色鑒定分別為非核酸、開環(huán)的質(zhì)粒DNA、超螺旋質(zhì)粒DNA和RNA(Sambrook，J.，和Russel，D.W.Molecular cloninga laboratory manual，ColdSpring Harbor，New York，2001)(沒有顯示)。
利用標準的LAL-試驗根據(jù)廠商的說明測定內(nèi)毒素的值。
如Schmidt等所述的方法進行激光誘導的熒光毛細管凝膠電泳(Schmidt，T.，F(xiàn)riehs，K.，and Flaschel，E.(2001)Structuresof plasmid DNA，在M.Schleef(Ed.)“Plasmids for therapyand vaccination”，pp.29-43，Wiley-VCH，Weinheim)。
權利要求
1.一種分離溶液中的核酸分子與污染物的方法，其包括下列步驟(a)提供一種吸附水溶液，其含有核酸以及當溶解時形成感膠離子的鹽；(b)讓所述溶液流經(jīng)基質(zhì)以使所要的核酸吸附到該基質(zhì)上，所述基質(zhì)含有一個芳環(huán)部分和至少一個硫醚部分；(c)任選地洗滌基質(zhì)；(d)讓水性洗脫液流經(jīng)基質(zhì)來脫附其中的核酸分子，該洗脫液除了包含形成感膠離子的鹽之外，也含有來自于漸增的鹽濃度漸增加的離子強度梯度，該鹽在溶解時形成了比在吸附過程中呈現(xiàn)的離子的感膠性小的感膠離子；和(e)分離含有所要的核酸分子的組分。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中所分離的組分是質(zhì)粒DNA，其基本上不含蛋白質(zhì)組分和/或RNA和/或內(nèi)毒素。
3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中在步驟(a)和(d)中所引用的感膠的和較小感膠的離子是由各自的鹽形成的陰離子。
4.根據(jù)前述任意一項權利要求的方法，其中步驟(a)中所述的鹽為硫酸銨或硫酸鈉。
5.根據(jù)權利要求4的方法，其中在吸附溶液中的所述鹽濃度低于大約3M。
6.根據(jù)前述任意一項權利要求的方法，其中溶于洗脫液中的所述鹽為一種堿金屬鹽，諸如氯化鈉或氯化鉀。
7.根據(jù)權利要求6的方法，其中在洗脫液中的所述鹽的最大濃度為大約3M。
8.根據(jù)前述任意一項權利要求的方法，其中所述基質(zhì)由已與一種芳香族硫醚配體偶合的載體組成，其中該配體的芳基基團選自由吡啶基、苯基、苯甲基、甲苯甲?；⒈揭一?、萘基、咪唑基、吡唑基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、哌啶基、嗎啉基、哌嗪基、吲哚基、喹啉基和嘌呤基組成的組。
9.根據(jù)權利要求8的方法，其中所述的配體已通過硫醚部分與載體偶合。
全文摘要
本發(fā)明為一種將核酸分子，尤其是質(zhì)粒DNA與溶液中的污染物，諸如蛋白質(zhì)分離的方法，該方法包括下列步驟，(a)提供一種吸附水溶液，其含有核酸以及當溶解時形成感膠離子的鹽；(b)讓所述溶液流經(jīng)基質(zhì)使所要的核酸吸附到該基質(zhì)上，所述基質(zhì)含有一個芳環(huán)部分和至少一個硫醚部分；(c)任選地洗滌基質(zhì)；(d)讓水相洗脫液流經(jīng)所說的基質(zhì)來脫附其中的核酸分子，該洗脫液除了含有形成感膠離子的鹽之外，也含有來自于漸增的鹽濃度漸增的離子強度梯度，該鹽在溶解時形成了比在吸附過程中呈現(xiàn)的離子的感膠性小的感膠離子；和(e)分離含有所要的核酸分子的組分。
文檔編號C12N15/09GK1639336SQ03804384
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月14日 優(yōu)先權日2002年2月21日
發(fā)明者R·萊門斯 申請人:阿默森生物科學有限公司