專利名稱：一種用于PCR產(chǎn)物連接的pCH－T載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種用于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接的pCH-T載體(如附圖
一)，它屬于基因工程產(chǎn)品。
一般的用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的Taq DNA聚合酶都會使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物兩邊的3’端各帶有一個(gè)A堿基。基于一般PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的這種特性，本發(fā)明的pCH-T載體的兩邊的3’端各帶有一個(gè)T堿基，使得其與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的末端發(fā)生互補(bǔ)，因而就可以直接把PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pCH-T載體上。但是也有少數(shù)一些具有3’-5’外切核酸酶活性的聚合酶，如Pfu DNA聚合酶，其聚合產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段為平端，無3’端的A堿基，對于這樣的PCR產(chǎn)物就不能直接和pCH-T載體相連。
本發(fā)明的pCH-T載體在其具有TA連接功能的基礎(chǔ)上，還含有一些利于其使用的特性1.在該載體T位點(diǎn)的兩側(cè)提供了兩個(gè)常用的限制性內(nèi)切酶BamHI和NcoI的酶切位點(diǎn)(如附圖二)，在對轉(zhuǎn)化后得到的陽性質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定時(shí)，恰當(dāng)?shù)剡x取其中的一種酶就可以把插入片段切下來。這一點(diǎn)與目前世界上現(xiàn)有各公司所生產(chǎn)的T載體都是不同的，不僅僅在于該載體提供了兩個(gè)酶切位點(diǎn)，而且這兩個(gè)酶切位點(diǎn)還非?？拷黅位點(diǎn)，這也為鑒定工作提供了方便。
2.該載體是利用在實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用的pUC19載體的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)所得到，它完全保留了pUC19載體原有的特性，如高拷貝，Ampr抗性，穩(wěn)定性好等特性。
3.本發(fā)明的pCH-T載體是對pUC19載體的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行了改造，使其變成了線性分子，在兩側(cè)都引入有BamHI和NcoI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，并在兩邊的3’端各加上了一個(gè)T堿基。而且該載體如果發(fā)生自連，其多克隆位點(diǎn)的堿基排列并沒有破壞β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的閱讀框架，所以在pCH-T載體與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接后進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，就可利用藍(lán)白斑篩選體系挑選陽性白色克隆菌落。
4.對于初步酶切鑒定為陽性的質(zhì)?？梢岳肕13通用引物對其插入的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。
對于本發(fā)明的pCH-T載體可廣泛的應(yīng)用于各種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的連接，它可以使得PCR產(chǎn)物直接與之相連，更方便，更快捷地把PCR產(chǎn)物保存到質(zhì)粒中。而且本發(fā)明提供的藍(lán)白斑篩選和兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)又非常有利于對含有插入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的目的質(zhì)粒進(jìn)行初步鑒定。
權(quán)利要求
本發(fā)明為一種直接用于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接的pCH-T載體。其特征是在T位點(diǎn)兩側(cè)都含有兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BamHI和NcoI。
全文摘要
本發(fā)明為一種用于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接的pCH－T載體。該載體為線形,在其兩邊的3’端各有一個(gè)突出的T堿基,從而可以和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物兩邊的3’端帶的A堿基相連接。連接后進(jìn)行轉(zhuǎn)化,可以用藍(lán)白斑的方法進(jìn)行篩選。而且本發(fā)明的pCH－T載體的T位點(diǎn)兩側(cè)都含有BamHI和NcoI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),在鑒定過程中用其中的一種酶就可以把連接產(chǎn)物切下來。并且插入的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以用M13通用引物進(jìn)行測序。
文檔編號C12N15/63GK1362521SQ0112821
公開日2002年8月7日 申請日期2001年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月27日
發(fā)明者崔斌, 何建勇, 白秀峰, 孔祥銀 申請人:崔斌