專利名稱：新的基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)、其制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的構(gòu)建基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)的方法，以及由此方法構(gòu)建的一種基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)及其應(yīng)用。確切地說是本發(fā)明涉及一種用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建并建立在真核細胞中高產(chǎn)量表達各種基因工程抗體的表達系統(tǒng)方法，以及由此方法制備的表達系統(tǒng)在多種基因工程抗體的制備和高產(chǎn)量生產(chǎn)中的應(yīng)用。
自1975年Kohler和Milstein創(chuàng)立雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體(簡稱單抗)以來，眾多單抗被研制成功并廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床的診斷和治療疾病中。但在廣泛的臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，鼠單抗用于人體治療疾病療效不佳，且出現(xiàn)嚴重的副作用，其主要原因有兩個(1)因鼠單抗對人體的異源性，用于人體會產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)。(2)抗體分子較大，難以進入腫瘤組織發(fā)揮治療作用。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)及免疫學(xué)的迅速發(fā)展，以及DNA重組技術(shù)的突起及日趨成熟，80年代初，人們可根據(jù)所需要的特性，采用基因工程技術(shù)改造鼠單抗或創(chuàng)造新的抗體及抗體片段，這些經(jīng)過基因工程技術(shù)改造或創(chuàng)造的抗體及抗體片段通稱為基因工程抗體?；蚬こ炭贵w可分成兩大類即全分子抗體和小分子抗體。到目前為止全分子抗體包括有嵌合抗體、改形抗體、全人源化抗體、雙特異性抗體及它們被修飾的類似物、衍生物、突變物和合成物。小分子抗體種類繁多，包括Fv(單域抗體)、scFv(單鏈抗體)、dsFv(雙價單鏈抗體)、Fab、Fab′、F(ab′)2、胞內(nèi)抗體以及它們與其它效應(yīng)分子的融合蛋白、衍生物等。研制基因工程抗體，無論是全分子還是小分子抗體，首先是從鼠單抗中克隆、鑒定有功能的單抗抗體基因(也可通過其它途徑獲得抗體基因，如抗體庫技術(shù))，再將抗體基因采用DNA重組技術(shù)克隆到能使其表達出蛋白質(zhì)即抗體的表達載體中(稱為抗體重組表達載體)，再將抗體重組表達載體轉(zhuǎn)導(dǎo)到特定的宿主工程細胞中，培養(yǎng)并篩選生產(chǎn)抗體的工程細胞，從而獲得所需的被改造或新創(chuàng)造的抗體。由上可見，基因工程抗體的生產(chǎn)最重要的是需要有基因工程抗體的表達系統(tǒng)，目前能表達和生產(chǎn)基因工程抗體的表達系統(tǒng)主要分為兩類一類是原核表達系統(tǒng)，在如大腸桿菌這樣的原核細胞中表達生產(chǎn)抗體；另一類是真核表達系統(tǒng)，多在哺乳動物細胞如CHO、sp2/0、NSO等細胞中表達生產(chǎn)抗體。這兩種表達系統(tǒng)具有各自的特點，原核表達系統(tǒng)成本低、表達產(chǎn)量高，但無糖基化、生物活性低、難以表達全分子抗體，因此原核表達的抗體不能用于臨床治療疾病；真核表達系統(tǒng)表達抗體有糖基化、生物活性高、既能表達全分子抗體也能表達小分子抗體，因而用于醫(yī)學(xué)臨床上治療疾病的抗體必須是真核表達系統(tǒng)表達生產(chǎn)的，但真核表達系統(tǒng)表達抗體產(chǎn)量低，因而成本高，難以獲得大量的抗體，而臨床治療疾病所需抗體量較大，因此真核表達系統(tǒng)表達抗體產(chǎn)量低嚴重阻礙了基因工程抗體應(yīng)用于臨床治療疾病。為了使有臨床應(yīng)用價值的單抗能更廣泛地用于人類疾病的治療，自90年代，科學(xué)家們和商家均致力于研制能高產(chǎn)量表達基因工程抗體的真核表達系統(tǒng)，到目前為止國外有5種能高表達基因工程抗體的真核表達系統(tǒng)構(gòu)建成功，并用于數(shù)種基因工程抗體的生產(chǎn)，而國內(nèi)尚無一例基因工程真核高效表達系統(tǒng)研制成功。美國目前已批準7種基因工程抗體產(chǎn)業(yè)化上市銷售，用于臨床治療疾病，還有數(shù)十種在II、III期臨床試用，這些基因工程抗體的生產(chǎn)多采用以上5種真核表達系統(tǒng)，因此基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)的研制成功，大大地推動了基因工程抗體的發(fā)展和產(chǎn)業(yè)化，同時以上情況也顯示出基因工程抗體在醫(yī)學(xué)臨床治療疾病中有著廣泛的應(yīng)用前景和重要的應(yīng)用價值。但目前國外研制成功的5種基因工程抗體真核表達系統(tǒng)還存在著各種問題，都不夠理想。第一種由Beidler等人(Beidler CB等人，J Immunol 1988；1414053)研制成功的抗體真核表達系統(tǒng)是采用小鼠骨髓瘤細胞sp2/0作為表達細胞，采用人抗體基因組恒定區(qū)基因序列和鼠單抗基因組可變區(qū)基因序列組成的真核表達載體，后者自帶有小鼠抗體的啟動子、增強子、分泌信號肽、剪接位點等調(diào)控表達的序列。這種表達系統(tǒng)表達抗體的產(chǎn)量可達32μg/ml，但這種系統(tǒng)的缺陷是抗體可變區(qū)基因基因組序列個體差異大，不同的抗體表達產(chǎn)量相差很大，采用這種載體系統(tǒng)只有1-2家報道可較高水平表達抗體，其余絕大多數(shù)報道其產(chǎn)量僅達2μg/ml，因此該載體系統(tǒng)缺乏通用性和普遍性，其原因可能是鼠單抗自帶的表達調(diào)控序列并非都能實現(xiàn)高表達。其次這種載體構(gòu)建操作復(fù)雜、成本高、周期長、所用的表達細胞sp2/0不適宜于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。第二種基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)由Bebbington等人報道(BebbingtonFD等人，Biotechnology 1992；10169)，該系統(tǒng)選用GS基因(谷氨酰胺合成酶基因)作為可擴增選擇標(biāo)志基因，用MSX(MethionineSulphoximine)加壓擴增表達，用小鼠骨髓瘤細胞NSO細胞作為表達細胞，其表達產(chǎn)量可達10-15μg/ml。但該表達系統(tǒng)中GS基因?qū)δ康幕虻墓矓U增倍數(shù)有限，故產(chǎn)量不是太高，最高值能達15μg/ml，此外這種載體系統(tǒng)篩選產(chǎn)生抗體的陽性克隆的篩選條件嚴格，陽性克隆數(shù)量較少，難以獲得高產(chǎn)量陽性克隆。第三種，由Shitara等人(Shitara K等人，J Immunol Methods 1994；167271)報道的高效表達系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)是選擇大鼠骨髓瘤細胞YB2/0作為表達細胞，dhfr(二氫葉酸還原酶)基因為可擴增選擇標(biāo)志基因，用Moloney病毒的長末端重復(fù)序列為驅(qū)動目的基因表達的啟動子，該系統(tǒng)的最大優(yōu)點是采用了非常適合表達抗體類外源基因的YB2/0細胞，配合強啟動子，可實現(xiàn)較高的基礎(chǔ)表達量，但經(jīng)MTX(氨甲喋呤)加壓擴增目的基因表達的擴增倍數(shù)較少，只有10倍左右，因此該載體系統(tǒng)的產(chǎn)量表達主要依賴于基礎(chǔ)表達水平，但大多數(shù)抗體并不能在此載體系統(tǒng)實現(xiàn)高基礎(chǔ)表達水平，因此有的抗體能高產(chǎn)量表達，有的則不能高產(chǎn)量表達，其次YB2/0細胞也不適合大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。第四種是由Dorai等人(Dorai H等人，J Immunol 1987；1394232)報道的抗體真核高效表達系統(tǒng)，采用sp2/0作為表達細胞，dhfr作為可擴增選擇標(biāo)志基因，通過MTX加壓到10-5mol/L擴增目的基因拷貝數(shù)，但此高濃度MTX已達到表達細胞的毒性劑量，致使表達細胞生長緩慢、狀態(tài)差、不適宜規(guī)?；a(chǎn)，同時細胞易發(fā)生突變，退化成不產(chǎn)抗體的細胞，因而不能長期培養(yǎng)、收獲抗體，同時擴增表達的倍數(shù)也不高。第五種表達系統(tǒng)是由Page等人報道的(Page MJ等人，Biotechnology 1991；964)，該系統(tǒng)選擇dhfr缺陷型的CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)作為表達細胞，dhfr基因作為可擴增選擇標(biāo)志基因，采用受專利保護的強啟動子β-肌動蛋白基因啟動子作為表達目的基因的啟動子，采用刪除驅(qū)動dhfr的SV40啟動子中的143bp序列單弱化可擴增選擇標(biāo)志基因等措施實現(xiàn)抗體的高表達。該系統(tǒng)采用了最強的啟動子，可實現(xiàn)抗體的高產(chǎn)量表達，但僅在抗體表達的基因劑量和轉(zhuǎn)錄效率水平采取了高表達的措施，尚可通過在抗體表達的其它環(huán)節(jié)(如翻譯水平、分泌水平等)采取措施進一步提高表達產(chǎn)量。綜上所述，可知目前已研制成功的基因工程真核高效表達系統(tǒng)雖然已提高了抗體的表達產(chǎn)量，達到了能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的表達水平10μg/ml以上，但還不是理想的表達系統(tǒng)，還存在著各種問題。首先，它們僅用一種或最多3種提高抗體表達水平的措施，而對外源基因表達水平高低所涉及的因素至少包括6個方面，即表達細胞的選擇、基因劑量的擴增、基因轉(zhuǎn)錄效率的高低、翻譯水平效率的高低、加工水平的效率以及分泌水平的效率等等，目前已研制成功的5種抗體表達系統(tǒng)僅在選擇表達細胞、提高抗體基因劑量以及轉(zhuǎn)錄效率這三個方面采取某些措施來提高表達產(chǎn)量。其次，抗體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)表達細胞，整合于細胞染色體后，易缺失篩選標(biāo)志，不易獲得正確的陽性克隆。另外，現(xiàn)有的表達系統(tǒng)缺乏與之配套的通用型抗體基因克隆載體，構(gòu)建抗體重組表達載體進行抗體表達時操作復(fù)雜、耗時、耗力、成本高。
因此，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種制備本發(fā)明的基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)的方法，所述方法能進一步提高基因工程抗體的表達產(chǎn)量，進一步簡化構(gòu)建基因工程抗體重組表達載體、制備、高產(chǎn)量生產(chǎn)抗體的操作程序。
本發(fā)明的第二個目的在于提供一個能高產(chǎn)量表達各種基因工程抗體(包括全分子和小分子抗體)的真核高效表達系統(tǒng)。
本發(fā)明的第三個目的在于所述的基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)在制備和生產(chǎn)各種基因工程抗體中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，本發(fā)明提供了一種制備基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)的方法，所述的方法包括分別制備抗體可變區(qū)基因通用型配套克隆載體，抗體基因真核表達的中間表達載體以及抗體通用型真核高效表達載體以構(gòu)成基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)，所述方法的特征在于1)將選擇標(biāo)志基因和可擴增選擇標(biāo)志基因包括在同一表達載體中，2)在表達載體中同時采用弱化的啟動子驅(qū)動選擇標(biāo)志基因和可擴增選擇標(biāo)志基因的表達，3)在表達載體中應(yīng)用氨基酸序列為NH3-Met-Tyr-Phe-Ser-Ala-Ile-Val-Ser-Ala-Ser-Leu-Ser-COOH的肽作為抗體分泌信號肽，4)在表達載體中使用翻譯型增強子序列，5)在表達載體中包括強啟動子以驅(qū)動目的基因的表達，同時在表達載體中還包括人抗體恒定區(qū)基因組序列和強轉(zhuǎn)錄終止子。
本發(fā)明方法中，所述的抗體可變區(qū)基因通用型配套克隆載體包括抗體重鏈可變區(qū)基因通用型克隆載體和抗體輕鏈可變區(qū)基因通用型克隆載體，所述的兩種載體均含有翻譯型增強子序列、優(yōu)化的抗體分泌信號肽、用于克隆抗體重鏈或輕鏈可變區(qū)基因的通用克隆位點以及5′內(nèi)含子剪接位點。
所述的抗體基因真核表達的中間表達載體含有可擴增選擇標(biāo)志基因和被弱化的驅(qū)動所述選擇標(biāo)志基因表達的啟動子序列；所述的抗體通用型真核高效表達載體是基于所述的通用型克隆載體和所述的中間表達載體構(gòu)建的，所述載體包括小分子抗體真核高效表達載體和全分子抗體真核高效表達載體，其中所述的小分子抗體真核高效表達載體含有選擇標(biāo)志基因序列、驅(qū)動選擇標(biāo)志基因的表達的弱化了的啟動子序列以及驅(qū)動目的抗體基因表達的強啟動子序列、強轉(zhuǎn)錄終止子序列和用于克隆抗體基因的多克隆位點，所述的全分子抗體真核表達載體包括全分子抗體重鏈真核表達載體和全分子抗體重鏈真核表達載體，所述全分子抗體重鏈真核表達載體含有選擇標(biāo)志基因序列、驅(qū)動選擇標(biāo)志基因的表達的弱化了的啟動子序列以及驅(qū)動目的抗體基因表達的強啟動子序列、強轉(zhuǎn)錄終止子序列，用于克隆抗體基因的多克隆位點以及人抗體IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中任一種抗體重鏈的基因組恒定區(qū)序列，包括人的Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4基因組恒定區(qū)序列，所述全分子抗體輕鏈真核表達載體含有選擇標(biāo)志基因序列、驅(qū)動選擇標(biāo)志基因的表達的弱化了的啟動子序列以及驅(qū)動目的抗體基因表達的強啟動子序列、強轉(zhuǎn)錄終止子序列，用于克隆抗體基因的多克隆位點以及人抗體IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中任一種抗體重鏈的基因組恒定區(qū)序列，包括人的Cλ和Cκ基因組恒定區(qū)序列。
在本發(fā)明方法中，所述的選擇標(biāo)志基因可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的選擇標(biāo)志基因，例如，氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因、胸苷激酶(tk)基因、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hyg)基因、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)基因、天冬酰胺合成酶(AS)基因。
所述的可擴增選擇標(biāo)志基因例如為二氫葉酸還原酶(dhfr)基因或谷氨酰胺合成酶(GS)基因。
所述的弱化的啟動子優(yōu)選為弱化的SV40啟動子，所述的弱化的SV40啟動子例如是通過刪除SV40啟動子72bp大小的一段序列獲得，該72bp大小序列的核苷酸序列如下5’-ATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGC-3’(SEQ ID NO1)所述的翻譯型增強子優(yōu)選為核苷酸長度為163bp的鼠VEGF基因5’一非翻譯區(qū)的SP163序列。該163bp大小的SP163翻譯型增強子序列的核苷酸序列如下5’-AGCGCAGAGGCTTGGGGCAGCCGAGCGGCAGCCAGGCCCCGGCCCGGGCCTCGGTTCCAGAAGGGAGAGGAGCCCGCCAAGGCGCGCAAGAGAGCGGGCTGCCTCGCAGTCCGAGCCGGAGAGGGAGCGCGAGCCGCGCCGGCCCCGGACGGCCTCCGAAACC-3’(SEQ ID NO2)。
所述的強啟動子可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的強啟動子，例如人巨細胞病毒立早基因啟動子PhCMV-IE、SV40早期基因啟動子PSV40-E、Rous肉瘤病毒LTR啟動子PRSV-LTR。
本發(fā)明方法所用的強轉(zhuǎn)錄終止子例如選自牛生長激素基因聚腺苷化位點BGH polyA或SV40聚腺苷化位點SV40 polyA。所述的人抗體恒定區(qū)基因組序列選自Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4或Cκ、Cλ。
根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了采用本發(fā)明所述的方法制備的基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)命名為pYR-GKES表達系統(tǒng)，其是由克隆載體pYR-GCVH和pYR-GCVL、表達載體pYR-GSEVH、pYR-GSEVL、pYR-GCEVH和pYR-GCEVL以及中間表達載體pYR-SV2-rdhfr和pYR-SV2-meo組成。pYR-GKES表達系統(tǒng)的組成及其構(gòu)建在以下實施例中有詳細描述，但是應(yīng)理解的是本發(fā)明并非限于這一表達系統(tǒng)。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的描述可以很容易地選擇所述表達系統(tǒng)中各個載體中的弱化的啟動子以及強啟動子、翻譯增強子、抗體分泌信號肽、轉(zhuǎn)錄終止子、選擇標(biāo)志和宿主細胞等。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的第一方面的表達系統(tǒng)在制備各種基因工程抗體中的應(yīng)用，所述的基因工程抗體包括全分子抗體和小分子抗體。到目前為止全分子抗體包括有嵌合抗體、改形抗體、全人源化抗體、雙特異性抗體及它們被修飾的類似物、衍生物、突變物和合成物。小分子抗體種類繁多，包括Fv(單域抗體)、scFv(單鏈抗體)、dsFv(雙價單鏈抗體)、Fab、Fab′、F(ab′)2、胞內(nèi)抗體以及它們與其它效應(yīng)分子的融合蛋白、衍生物等。
現(xiàn)有技術(shù)中，抗人VEGF鼠單抗已被證明在體外能抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖，在體內(nèi)能阻斷腫瘤血管的形成，截斷腫瘤的血供，從而抑制腫瘤的生長，達到治療腫瘤的目的，因此該鼠單抗有著重要的醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用價值。但鼠單抗用于人體會產(chǎn)生抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA反應(yīng))不僅會有明顯的毒副作用，而且療效也差，限制了鼠單抗用于人體治療腫瘤。為了解決此困難，采用基因工程法可將VEGF鼠單抗的鼠源恒定區(qū)用人抗體的恒定區(qū)替代，從而減少HAMA反應(yīng)；鼠單抗可變區(qū)保留不變，從而保持原單抗的特異性、親和性和治療作用，這樣改造的新抗體稱為鼠-人嵌合抗體。目前國外已有這類嵌合抗體被批準上市用于治療人類疾病，國內(nèi)因無真核高效表達系統(tǒng)，尚無一例基因工程抗體包括嵌合抗體能產(chǎn)業(yè)化，一直不能用于臨床應(yīng)用。本發(fā)明中的高效表達系統(tǒng)實現(xiàn)了高產(chǎn)量表達各類基因工程抗體(包括抗人VEGF嵌合抗體)的目的，下面實施例2中以VEGF嵌合抗體真核高效表達系統(tǒng)的構(gòu)建、表達為例，說明應(yīng)用本發(fā)明中的高效表達系統(tǒng)高產(chǎn)量表達全分子基因工程抗體實施的具體方式和做法。
以下將參照附圖和實施例詳細描述本發(fā)明，其中


圖1是構(gòu)建實施例1所述的抗體重鏈可變區(qū)基因通用型克隆載體pYR-GCVH的示意圖。
圖2是構(gòu)建實施例1所述的抗體輕鏈可變區(qū)基因通用型克隆載體pYR-GCVL的示意圖。
圖3是構(gòu)建實施例1所述的小分子抗體真核高效表達載體pYR-GSEVH的示意圖。
圖4是構(gòu)建實施例1所述的小分子抗體真核高效表達載體pYR-GSEVL的示意圖。
圖5是構(gòu)建實施例1所述的全分子抗體重鏈真核高效表達載體pYR-GCEVH的示意圖。
圖6是構(gòu)建實施例1所述的全分子抗體輕鏈真核高效表達載體pYR-GCEVL的示意圖。
圖7是實施例2和實施例3中所用到的PCR引物的核苷酸序列。
2.抗體輕鏈可變區(qū)基因通用型克隆載體的構(gòu)建以質(zhì)粒pGEM-3Z-f(+)載體為骨架，用內(nèi)切酶Pvu II酶切該載體，分離大片段，加一平端的12bp的Hind III連接子再重新連接這一大片段，從而抹去了原載體的2個Pvu II酶切位點。篩選正確的重組克隆，獲得的重組克隆稱為pRGL。用內(nèi)切酶Hind III酶切pRGL重組載體DNA，再與一個0.76kb大小的Hind III片段(通過Over Lap PCR自行合成后酶切)連接，該片段依次含有翻譯型增強子、優(yōu)化的抗體分泌信號肽、用于克隆抗體輕鏈可變區(qū)基因的通用克隆位點Pvu II和Bgl II以及5′內(nèi)含子剪接位點。連接轉(zhuǎn)化后，篩選正確的重組克隆，所獲得的重組克隆稱為pYR-GCVL克隆載體，該載體為抗體輕鏈可變區(qū)基因通用型克隆載體，可將任何一種抗體的輕鏈可變區(qū)基因插入該載體的Pvu II和Bgl II酶切位點構(gòu)建成重組克隆載體，便于抗體輕鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列測定，并為構(gòu)建抗體輕鏈真核高效表達載體提供了抗體輕鏈可變區(qū)基因序列、翻譯型增強子、優(yōu)化的抗體分泌信號肽以及5′內(nèi)含子剪接位點(構(gòu)建示意圖見圖2)。
(二)抗體通用型真核高效表達載體的構(gòu)建1.雙選擇標(biāo)志基因的雙弱化以pSV2-dhfr質(zhì)粒載體(本申請人保存)為骨架，用內(nèi)切酶SphI酶切該質(zhì)粒載體，回收大片段后連接轉(zhuǎn)化，從而刪除了pSV2-dhfr質(zhì)粒載體中驅(qū)動dhfr基因表達的SV40啟動子中的增強子序列中72bp的重復(fù)序列，篩選不含72bp重復(fù)序列單元的正確的重組克隆，所獲得重組克隆稱為pYR-SV2-rdhfr表達質(zhì)粒載體。刪除SV40啟動子中增強子72bp序列的目的是適當(dāng)程度地弱化SV40啟動子驅(qū)動dfhr基因的表達，因此該重組表達載體是被弱化了可擴增選擇標(biāo)志基因dhfr表達的真核表達載體，這將有利于以后構(gòu)建的小分子抗體真核表達載體和全分子抗體重鏈真核表達載體提高目的抗體基因的表達產(chǎn)量。
用Hind III和BamH I內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒載體pSV2-neo(本申請人保存)，回收含有選擇標(biāo)志基因neo基因的小片段，與經(jīng)Hind III和BamH I內(nèi)切酶酶切的pYR-SV2-rdhfr表達質(zhì)粒載體回收后的大片段(不含rdhfr基因，但SV40啟動子已被弱化)連接，轉(zhuǎn)化后篩選含有neo基因的正確的重組克隆。所獲得的重組克隆稱pYR-SV2-rneo表達質(zhì)粒載體，該表達載體含有選擇標(biāo)志基因neo基因，其上游為已被刪除SV40啟動子中的增強子的72bp重復(fù)序列單元的SV40啟動子，即該載體中是被弱化了的啟動子驅(qū)動neo基因的表達，這將有利于以后構(gòu)建的小分子抗體真核表達載體和全分子抗體輕鏈真核表達載體提高目的抗體基因的表達產(chǎn)量。
2.小分子抗體真核高效表達載體的構(gòu)建用BamHI和EcoRI酶切上面被弱化了啟動子的pYR-SV2-rdhfr表達質(zhì)粒載體，分離回收大片段，再用Klenow補平其末端，與一末端為平端的片段(酶切并補平自pcDNA3，本所保存)連接，該片段含有人巨細胞病毒立早基因啟動子(PhCMV-IE)序列、多克隆酶切位點和強轉(zhuǎn)錄終止子牛生長激素基因的poly A位點(BGH poly A)。轉(zhuǎn)化后篩選插入的PhCMV-IE啟動子方向與dhfr基因方向相同的重組克隆，所獲重組克隆稱為pYR-GSEVH表達載體。該載體含有被弱化的驅(qū)動可擴增選擇標(biāo)志基因dhfr的SV40啟動子和增強子、可擴增選擇標(biāo)志基因dhfr、驅(qū)動抗體基因高表達的強啟動子PhCMV-IE，強的轉(zhuǎn)錄終止子BGH poly A以及用于克隆抗體基因于PhCMV-IE啟動子下游的多克隆酶切位點。因此任何小分子抗體基因在克隆到通用型配套克隆載體pYR-GCVH后，再用BamH I和Not I酶切該克隆載體，獲得含有翻譯型增強子、優(yōu)化的抗體分泌信號肽、小分子抗體基因以及5′-內(nèi)含子剪接位點的片段后，再插入經(jīng)BamH I和Not I酶切pYR-GSEVH表達載體中，即構(gòu)建成功小分子抗體真核高效表達重組載體，從而可在真核細胞中高產(chǎn)量表達小分子抗體(構(gòu)建示意圖見圖3)。
小分子抗體真核高效表達載體pYR-GSEVL的構(gòu)建是用BamH I和EcoR I內(nèi)切酶酶切前面構(gòu)建的表達質(zhì)粒載體pYR-SV2-meo后，分離回收大片段，用Klenow酶補平其兩個末端，再與一平端片段連接，該平端片段含有PhCMV-IE啟動子、BGH poly A、多克隆位點。轉(zhuǎn)化后篩選插入的PhCMV-IE啟動子方向與neo基因方向相同的正確重組克隆，所獲重組克隆稱為pYR-GSEVL表達載體。該載體含有被弱化的驅(qū)動選擇基因neo的SV40啟動子和增強子、選擇標(biāo)志基因neo、驅(qū)動目的抗體基因表達的強啟動子PhCMV-IE、BGH poly A以及用于克隆抗體基因于PhCMV-IE啟動子下游的多克隆酶切位點。因此，任何小分子抗體在克隆到通用型配套克隆載體pYR-GCVL后，用BamH I和Not I內(nèi)切酶酶切，獲得含有翻譯型增強子、優(yōu)化的抗體分泌信號肽、小分子抗體基因以及5′內(nèi)含子剪接位點的片段后，再插入經(jīng)BamH I和Not I酶切的pYR-GSEVL表達載體中，即構(gòu)建成小分子抗體真核高效表達重組載體，從而可在真核細胞中高產(chǎn)量表達小分子抗體(構(gòu)建示意圖見圖4)。
3.全分子抗體真核高效表達載體的構(gòu)建(1).全分子抗體重鏈真核高效表達載體的構(gòu)建用Xho I內(nèi)切酶酶切小分子抗體表達載體pYR-GSEVH，用Klenow酶補平其兩個末端，與一末端為平端的片段(酶切并補平自本所保存的質(zhì)粒)連接，該片段含人抗體恒定區(qū)Cγ1、或Cγ2、或Cγ3、或Cγ4的基因組序列，篩選含有人抗體重鏈恒定區(qū)基因組序列，并且其插入方向與PhCMV-IE啟動方向相同的正確的重組克隆，所獲重組克隆稱為pYR-GCEVH表達載體。該表達載體除含有小分子抗體載體pYR-GSEVH中含有的被弱化了的驅(qū)動可擴增選擇基因表達的SV40啟動子和增強子、可擴增選擇基因dhfr、驅(qū)動目的抗體基因表達的強啟動子PhCMV-IE、強轉(zhuǎn)錄終止子BGH poly A、用于克隆抗體重鏈可變區(qū)基因于PhcMV-IE下游的多克隆位點等序列外，還含有人抗體重鏈恒定區(qū)基因組序列。因此，任何抗體的重鏈可變區(qū)基因，包括改造后或從其它途徑獲得的人源化抗體可變區(qū)基因，克隆到通用型配套抗體重鏈可變區(qū)基因克隆載體pYR-GCVH后，再用BamH I和Not I內(nèi)切酶酶切，獲得的含有翻譯型增強子、優(yōu)化的抗體分泌信號肽、抗體重鏈可變區(qū)基因及5′內(nèi)含子剪接位點的片段可直接插入該表達載體pYR-GCEVH的BamH I和Not I酶切位點中，即構(gòu)建成功全分子抗體重鏈基因真核高效重組表達載體。與相應(yīng)的全分子抗體輕鏈基因真核高效重組表達載體共轉(zhuǎn)染真核細胞后，可在真核細胞中高產(chǎn)量表達全分子抗體(構(gòu)建示意圖見圖5)。
(2)全分子抗體輕鏈真核高效表達載體的構(gòu)建用Xho I內(nèi)切酶酶切小分子表達載體pYR-GSEVL，用Klenow酶補平其兩個末端，與一末端為平端的片段(酶切并補平自本所保存的質(zhì)粒)連接，該片段含有人抗體輕鏈恒定區(qū)Cκ或Cλ基因組序列。轉(zhuǎn)化后篩選含有與PhCMV-IE啟動子方向相同的人抗體輕鏈恒定區(qū)基因組序列的重組克隆，所獲重組克隆稱為pYR-GCEVL表達載體。該表達載體除含有小分子抗體載體pYR-GSEVL中含有的被弱化的驅(qū)動選擇標(biāo)志基因neo基因表達的SV40的啟動子和增強子、選擇標(biāo)志基因neo、驅(qū)動目的抗體基因表達的強啟動子PhCMV-IE、強轉(zhuǎn)錄終止子BGHpoly A、用于克隆抗體輕鏈可變區(qū)基因于PhCMV-IE啟動子下游的多克隆位點等序列外，還含有人抗體輕鏈恒定區(qū)基因組序列。因此，任何抗體的輕鏈可變區(qū)基因，包括改造后或從其它途徑獲得的人源化抗體可變區(qū)基因，克隆到通用型配套抗體輕鏈可變區(qū)基因克隆載體pYR-GCVL后，再用BamH I和Not I內(nèi)切酶酶切，獲得的含有翻譯型增強子、優(yōu)化的抗體分泌信號肽、抗體輕鏈可變區(qū)基因及5′內(nèi)含子剪接位點的片段可直接插入該表達載體pYR-GCEVL的BamHI和NotI酶切位點中，即構(gòu)建成功全分子抗體輕鏈基因真核高效重組表達載體。與相應(yīng)的全分子抗體重鏈基因真核高效重組表達載體共轉(zhuǎn)染真核細胞后，可在真核細胞中高產(chǎn)量表達全分子抗體(構(gòu)建示意圖見圖6)。
抗人VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)嵌合抗體在真核高效表達系統(tǒng)pYR-GKES中的高產(chǎn)量表達(一)抗人VEGF鼠單抗輕、重鏈可變區(qū)基因的克隆及核苷酸序列測定1.收集分泌抗人VEGF單抗的雜交瘤細胞(本申請人制備并保存)，PBS洗滌3次。
2.采用Trizol一步法提取雜交瘤細胞總RNA或mRNA后，用Gibco BRL公司生產(chǎn)的MMLV-反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。
3.以合成的cDNA為模板采用P1和P2引物在高精度DNA聚合酶Taq＋pfu作用下進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增VEGF抗體輕鏈可變區(qū)基因(VL)，約320bp大小；用同樣方法，采用P3和P4引物擴增VEGF抗體重鏈可變區(qū)基因(VH)，約360bp大小。
4.分別回收PCR擴增獲得的抗體VL和VH基因后，用內(nèi)切酶Pvu II和Bgl II酶切VL基因，用內(nèi)切酶PstI和BstE II酶切VH基因。
5.將酶切后的VL基因與已經(jīng)內(nèi)切酶Pvu II和Bgl II酶切過的該真核高效表達系統(tǒng)pYR-GKES中的通用型配套克隆載體pYR-GCVL的大片段在T4 DNA連接酶(New England公司)作用下連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細菌。
6.將酶切后的VH基因與已經(jīng)內(nèi)切酶Pst I和BstE II酶切過的通用型配套克隆載體pYR-GCVH大片段在T4 DNA連接酶作用下連接作用下連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細菌。
7.從VL和VH轉(zhuǎn)化后的細菌平板中分別各挑取12個細菌克隆，采用小量快速質(zhì)粒提取法，提取質(zhì)粒DNA用Pvu II和Bgl II酶切篩選鑒定分析已插入有抗體VL基因的正確的重組克隆，用PstI和BstEII酶切篩選鑒定分析已插入有抗體VH基因的正確的重組克隆。
8.用Qiagen公司的中量質(zhì)粒提取試劑盒，分別提取純化2個上一步所獲得正確的VL和VH重組克隆的質(zhì)粒DNA。
9.采用熒光標(biāo)記Sanger雙脫氧末端終止法對2個VL和2個VH重組克隆進行核苷酸序列測定，結(jié)果2個VL基因的核苷酸序列完全相同，經(jīng)與Kabat抗體數(shù)據(jù)庫對比分析發(fā)現(xiàn)屬小鼠第V亞群，證明為重排的功能性基因。2個VH基因僅在第21位核苷酸不同，但不影響推導(dǎo)出的氨基酸序列的一致。經(jīng)與Kabat抗體數(shù)據(jù)庫對比分析發(fā)現(xiàn)屬小鼠第II(B)亞群，證明為重排的功能性基因。此至獲得了正確的功能性的抗體VL和VH基因。該VL和VH基因含有翻譯型增強子、優(yōu)化的抗體分泌信號肽以及5′內(nèi)含子剪接位點序列，重組克隆載體稱為含有VEGF抗體VL和VH的通用型配套克隆重組載體。
(二)抗人VEGF鼠-人嵌合抗體的真核高效表達載體的構(gòu)建1.以上面獲得的經(jīng)核苷酸序列測定證明是含有重排的、有功能的VL基因的通用型配套重組克隆質(zhì)粒DNA為模板，采用P5和P6引物，在Taq-pfu聚合酶的作用下進行PCR擴增反應(yīng)，從含有VEGF抗體VL基因的通用型配套克隆載體中擴增含翻譯型增強子、優(yōu)化的抗體分泌信號肽、VEGF抗體VL基因以及5′內(nèi)含子剪接位點的片段，且該片段兩端分別帶有BamH I和Not I內(nèi)切酶酶切位點，大小約0.76kb。分離回收PCR擴增的該0.76kb片段，用內(nèi)切酶BamH I和NotI酶切該片段。
2.用BamH I和Not I內(nèi)切酶酶切全分子抗體輕鏈表達載體pYR-GCEVL質(zhì)粒DNA(該載體含PhCMV-IE強啟動子、BGH poly A強終止子、多克隆酶切位點、選擇標(biāo)志基因neo基因、被弱化的驅(qū)動選擇標(biāo)志基因neo表達的SV40啟動子和增強子以及人抗體輕鏈恒定區(qū)基因組序列Cκ，分離回收酶切后的大片段。
3.在T4 DNA連接酶的作用下，經(jīng)過BamH I和Not I酶切過的0.76kb的VL PCR片段與用同樣內(nèi)切酶酶切回收的pYR-GCEVL的DNA片段連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌。用內(nèi)切酶BamHI和Not I酶切篩選分析鑒定含有0.76kb的VL片段的重組克隆，這時所獲得正確重組克隆即為完整的VEGF鼠-人嵌合抗體輕鏈真核高效表達重組載體，稱為pYR-GCEVL-VEGF。它含選擇標(biāo)志基因neo、被弱化了的驅(qū)動選擇標(biāo)志基因表達的啟動子SV40啟動子和增強子、翻譯型增強子、優(yōu)化的抗體分泌信號肽、5′內(nèi)含子剪接位點序列、VEGF鼠單抗的VL基因、人抗體輕鏈恒定區(qū)基因組序列Cκ和3′內(nèi)含子剪接位點序列、驅(qū)動嵌合抗體輕鏈基因高表達的強啟動子PhCMV-IE、強轉(zhuǎn)錄終止子BGH poly A。提取純化該重組克隆的質(zhì)粒DNA。
4.與VEGF嵌合抗體輕鏈真核高效表達重組載體的構(gòu)建程序相同，以獲得的經(jīng)核苷酸序列測定證明是含有已重排的、具有功能的VH基因的通用型配套重組克隆載體質(zhì)粒DNA為模板，采用P7和P8引物，在Taq-pfu DNA聚合酶作用下進行PCR擴增反應(yīng)，擴增含翻譯型增強子、優(yōu)化的抗體分泌信號肽、VEGF抗體VH基因及5′內(nèi)含子剪接位點序列的約0.96kb的DNA片段，分離回收該0.96kb的片段后，用內(nèi)切酶BamHI和NotI酶切該片段。
5.用內(nèi)切酶BamH I和Not I酶切本發(fā)明的全分子抗體重鏈表達載體pYR-GCEVH質(zhì)粒DNA(該載體含有PhCMV-IE啟動子、強轉(zhuǎn)錄終止子BGH poly A、多克隆酶切位點、可擴增選擇標(biāo)志基因dhfr、被弱化的驅(qū)動dhfr基因表達的SV40啟動子和增強子以及人抗體重鏈恒定區(qū)基因組序列Cγ1，分離回收酶切后的大片段DNA。
6.用T4 DNA連接酶連接經(jīng)BamH I和Not I酶切后的0.96kb的VH PCR片段和pYR-GCEVH的大片段，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌，用內(nèi)切酶BamH I和Not I酶切篩選分析鑒定含有0.96kb大小的VH片段的重組克隆，這時所獲得的正確重組克隆即為完整的VEGF鼠-人嵌合抗體重鏈真核高效表達重組載體，稱為pYR-GCEVH-VEGF。它含有可擴增選擇標(biāo)志基因dhfr基因、被弱化的驅(qū)動dhfr基因表達的SV40啟動子和增強子、翻譯型增強子、優(yōu)化的抗體分泌信號肽、5′內(nèi)含子剪接位點序列、VEGF鼠單抗VH基因、人抗體重鏈恒定區(qū)基因組序列Cγ1和3′內(nèi)含子剪接位點序列、驅(qū)動嵌合抗體重鏈基因高表達的強啟動子PhCMV-IE、強轉(zhuǎn)錄終止子BGH poly A。提取純化該重組克隆的質(zhì)粒DNA。
(三)抗人VEGF鼠-人嵌合抗體的真核高效表達1.VEGF嵌合抗體基因轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞將含有抗人VEGF抗體VL基因以及人抗體輕鏈恒定區(qū)基因組序列Cκ的嵌合抗體輕鏈基因的真核高效表達重組克隆pYR-GCEVL-VEGF的質(zhì)粒DNA與含有抗人VEGF抗體VH基因及人抗體重鏈恒定區(qū)基因組序列Cγ1的嵌合抗體重鏈基因的真核高效表達重組克隆pYR-GCEVH-VEGF的質(zhì)粒DNA，在LipofectAMINE的作用下共轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞，然后在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中5％CO2、37℃培養(yǎng)72小時。
2.選擇性培養(yǎng)轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)72小時后的CHO-dhfr-細胞，采用含200μg/ml G418和撤除HT(H，次黃嘌呤；T，是胸腺嘧啶)的培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，以篩選neo基因和dhfr基因表型均陽性的抗性細胞。這些抗性細胞既含有帶選擇標(biāo)志基因neo的嵌合抗體輕鏈基因，也含有帶有可擴增選擇標(biāo)志基因dhfr的嵌合抗體重鏈基因，故能表達完整的嵌合抗體。待抗性細胞生長良好后，用夾心ELISA法檢測抗性克隆細胞上清中抗人VEGF嵌合抗體的表達量，結(jié)果表達產(chǎn)量可達0.19μg/ml，與用普通的抗體真核表達載體系統(tǒng)表達VEGF嵌合抗體的產(chǎn)量(20ng/ml)相比，該高效表達系統(tǒng)pYR-GKES的表達產(chǎn)量提高了9.5倍。
3.轉(zhuǎn)染后抗性細胞在遞增的MTX濃度下的加壓擴增培養(yǎng)將生長良好的抗性細胞用有限稀釋法進行亞克隆，抗性細胞按1.5個細胞/孔接種96孔培養(yǎng)板，共接種5-10塊板，在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，約2-3周長出單個抗性克隆。用夾心ELISA法檢測單個抗性克隆上清中VEGF嵌合抗體的表達量，選擇表達產(chǎn)量最高(0.25μg/ml)的單個克隆擴大培養(yǎng)，加含3×10-8mol/L的MTX(氨甲喋呤)的DMEM培養(yǎng)基進行加壓擴增培養(yǎng)，待細胞適應(yīng)3×10-8mol/L MTX的培養(yǎng)后，采用夾心ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中嵌合抗體產(chǎn)量為4.8μg/ml，擴增表達產(chǎn)量近20倍。按前述方法再進行亞克隆，選擇表達產(chǎn)量最高(9μg/ml)的克隆細胞，再加含1×10-7mol/L的MTX的培養(yǎng)基進一步加壓擴增表達培養(yǎng)，培養(yǎng)上清中嵌合抗體產(chǎn)量為20μg/ml，亞克隆后，最高表達產(chǎn)量的克隆的抗體表達量為28μg/ml。同前再進行1×10-6mol/L MTX的加壓擴增表達培養(yǎng)，培養(yǎng)上清中嵌合抗體產(chǎn)量為32g/ml，最高表達量的克隆細胞的抗體產(chǎn)量為41μg/ml，同前再進行1×10-5mol/L MTX加壓擴增表達培養(yǎng)，細胞生長變得極其緩慢，抗體表達產(chǎn)量未進一步提高，故完成了抗人VEGF嵌合抗體的高效表達。
抗人VEGF嵌合抗體用本發(fā)明的真核高效表達系統(tǒng)pYR-GKES表達，其抗體產(chǎn)量達41μg/ml，較用普通載體系統(tǒng)表達的產(chǎn)量20ng/ml高約2000倍，也遠高于國際公認的基因工程抗體產(chǎn)業(yè)化表達水平的標(biāo)準10μg/ml。
(四)該表達系統(tǒng)表達的抗人VEGF嵌合抗體生物活性鑒定為證明應(yīng)用本發(fā)明中的真核高效表達系統(tǒng)pYR-GKES表達的基因工程抗體仍具有良好的生物活性，對該系統(tǒng)所表達的抗人VEGF嵌合抗體的各種生物活性進行以下分析鑒定。
1.夾心ELISA法分析抗人VEGF嵌合抗體的人源性用羊抗人κ鏈多抗包被96孔酶標(biāo)板，用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG Fc片段作為二抗檢測表達的抗人VEGF嵌合抗體是否含有人抗體輕、重鏈恒定區(qū)，結(jié)果轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清中所表達抗人VEGF嵌合抗體發(fā)生陽性結(jié)合反應(yīng)，而未轉(zhuǎn)染抗人VEGF嵌合抗體基因的CHO-dhfr-細胞上清陰性。證明所表達的抗體確實是含有人抗體恒定區(qū)的鼠-人嵌合抗體。
2.間接ELISA法分析所表達的抗體的特異性和人源性用人VEGF抗原包被96孔酶標(biāo)板，用HRP-羊抗人IgG Fc片段為二抗，采用間接ELISA法檢測所表達的抗體是否能與相應(yīng)的抗原人VEGF特異結(jié)合。結(jié)果所表達的抗體即能與人VEGF抗原特異結(jié)合，又能與抗人IgG Fc結(jié)合，呈陽性反應(yīng)，而未轉(zhuǎn)染抗人VEGF鼠-人嵌合抗體基因的CHO-dhfr-細胞上清則呈陰性反應(yīng)，表明所表達的抗體是既能特異識別人VEGF又含有人抗體恒定區(qū)的抗人VEGF嵌合抗體。
3.競爭抑制實驗分析所表達的抗體的抗原結(jié)合特異性為進一步證明表達抗體與原來的VEGF鼠單抗有相同的抗原結(jié)合活性，將用基因工程法改造了的、用本發(fā)明的真核表達系統(tǒng)pYR-GKES表達的抗人VEGF嵌合抗體與原親本鼠源的VEGF單抗按不同比例混合后，再與人的VEGF抗原反應(yīng)，再用ELISA分析嵌合VEGF抗體對其親本鼠源VEGF單抗結(jié)合人VEGF抗原的抑制作用，結(jié)果顯示嵌合VEGF抗體可競爭抑制親本鼠源VEGF單抗與VEGF的結(jié)合，這是因為嵌合VEGF抗體已與人VEGF抗原結(jié)合后，鼠單抗就不能再與人VEGF結(jié)合，因而結(jié)合受到嵌合抗體的競爭抑制。這表明嵌合VEGF抗體與原親本鼠單抗與人VEGF抗原具有相同的特異結(jié)合能力，而無關(guān)抗體則不影響鼠VEGF單抗與人VEGF結(jié)合，從而證明所表達的抗體具有與人VEGF特異結(jié)合的能力。
4.所表達的抗體對血管內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用抗人VEGF鼠單抗被證明具有抑制血管內(nèi)皮細胞增殖的生物活性，為了證明所表達的抗體是否仍有此活性，采用MTT法測定，首先培養(yǎng)牛血管內(nèi)皮細胞或人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細胞于96孔培養(yǎng)板中，再分別加入所表達的抗體、親本鼠單抗、無關(guān)抗體以及不加任何抗體培養(yǎng)液(均含人VEGF)培養(yǎng)4天后，加0.5mg/ml MTT，再培養(yǎng)4小時，再加DMSO溶解細胞，測OD570，計算對血管內(nèi)皮細胞增殖的抑制率。結(jié)果所表達的抗體在3μg/ml濃度能抑制血管內(nèi)皮細胞增殖23％，27μg/ml濃度時完全抑制其增殖，鼠VEGF單抗在3μg/ml濃度抑制率為10.2％，在27μg/ml濃度是抑制率95％，略低于表達的嵌合VEGF抗體。這表明所表達的VEGF嵌合抗體仍保持原來的生物活性。證明本發(fā)明的真核高效表達系統(tǒng)pYR-GKES能在真核細胞中高產(chǎn)量表達全分子抗體，所表達的抗體具有良好的生物活性，具有可用性。
(一)抗人CEA鼠單抗VL和VH基因的克隆及核苷酸序列測定采用與實施例2相同的方法步驟分離克隆抗CEA鼠單抗C50的VL和VH基因，用熒光標(biāo)記Sanger雙脫氧末端終止法對2個VL和VH重組克隆的質(zhì)粒DNA進行核苷酸序列測定，結(jié)果2個VL和2個VH基因序列完全相同，并證明為重排的功能性抗體可變區(qū)基因。
(二)抗CEA F(ab)′2的通用性配套輕鏈重組克隆載體的構(gòu)建1.在抗CEA抗體VL基因的3′-端連接人抗體輕鏈恒定區(qū)Cκ基因，構(gòu)建抗CEA F(ab)′2通用型配套輕鏈重組克隆載體。
2.在抗CEA抗體VH基因的3′-端連接人抗體重鏈恒定區(qū)CH1-鉸鏈區(qū)片段基因，構(gòu)建抗CEAF(ab)′2通用型配套重鏈重組克隆載體。
(三)抗CEA F(ab)′2真核高效表達載體的構(gòu)建1.從抗CEA F(ab)′2通用型配套輕鏈重組克隆載體中用內(nèi)切酶BamHI和NotI切下含翻譯型增強子、優(yōu)化的抗體分泌信號肽、抗CEAF(ab)′2輕鏈基因的一個片段，與本發(fā)明中的小分子抗體真核高效表達載體pYR-GSEVL(經(jīng)過BamH I和Not I酶切)在T4 DNA連接酶作用下連接，再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌，采用與全分子抗體構(gòu)建相同的方法篩選鑒定正確的重組載體克隆，提取純化篩選分離的重組克隆的質(zhì)粒DNA準備轉(zhuǎn)染真核細胞。
2.從抗CEA F(ab)′2通用型配套重鏈重組克隆載體中用BamH I和Not I酶切切下含翻譯型增強子、優(yōu)化的抗體分泌信號肽、抗CEAF(ab)′2重鏈基因的一個片段，與本發(fā)明中的小分子抗體真核高效表達載體pYR-GSEVH(經(jīng)過BamH I和Not I酶切)在T4 DNA連接酶作用下連接，再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌，采用與全分子抗體構(gòu)建相同的方法篩選鑒定正確的重組載體克隆，提取純化篩選分離的重組克隆的質(zhì)粒DNA準備轉(zhuǎn)染真核細胞。
(四)抗人CEA F(ab)′2小分子抗體的真核高效表達及活性鑒定采用與全分子抗體相同的方法步驟，將抗人CEA F(ab)′2輕、重鏈基因的共轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞，對轉(zhuǎn)染細胞進行選擇培養(yǎng)、MTX遞增濃度梯度的加壓擴增表達，ELISA測定抗體表達產(chǎn)量，以及采用ELISA，競爭抑制ELISA、Western Blot等方法鑒定所表達的小分子抗體的人源性、與CEA抗原結(jié)合的特異性、親和性等。結(jié)果抗人CEA F(ab)′2小分子抗體的最終表達產(chǎn)量可達20μg/ml，超過國際公認的產(chǎn)業(yè)化表達水平，而且具有人源性，能與CEA抗原特異性結(jié)合，其特異性與原鼠單抗相同。該小分子抗體標(biāo)記放射核素111In或99Tc后，可用于臨床放射顯像診斷多種腫瘤，為臨床腫瘤診斷提供一種新的手段。
為證明本發(fā)明中真核高效表達系統(tǒng)pYR-GKES的廣泛通用性，用該表達系統(tǒng)還表達了抗人癌蛋白HER2抗原的鼠-人嵌合抗體，抗人CEA鼠-人嵌合抗體。其具體操作方法與抗人VEGF鼠-人嵌合抗體完全相同，抗人HER2鼠-人嵌合抗體的最終表達產(chǎn)量(在1×10-6mol/L MTX加壓擴增表達后)為40-60μg/ml?？谷薈EA鼠-人嵌合抗體的最終表達產(chǎn)量(在1×10-6mol/L MTX加壓擴增表達后)為50-60μg/ml，而且均有很好的生物活性。這進一步證明本發(fā)明的基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)pYR-GKES有著顯著的、廣泛的通用性，其產(chǎn)量達國際水平，在國內(nèi)屬領(lǐng)先水平。
權(quán)利要求
1.一種制備基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)的方法，所述的方法包括分別制備抗體可變區(qū)基因通用型配套克隆載體，抗體基因真核表達的中間表達載體以及抗體通用型真核高效表達載體以構(gòu)成基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)，所述方法的特征在于1)將選擇標(biāo)志基因和可擴增選擇標(biāo)志基因包括在同一表達載體中，2)在表達載體中同時采用弱化的啟動子驅(qū)動選擇標(biāo)志基因和可擴增選擇標(biāo)志基因的表達，3)在表達載體中應(yīng)用氨基酸序列為NH3-Met-Tyr-Phe-Ser-Ala-Ile-Val-Ser-Ala-Ser-Leu-Ser-COOH的肽作為抗體分泌信號肽，4)在表達載體中使用翻譯型增強子序列，5)在表達載體中包括強啟動子以驅(qū)動目的基因的表達，同時在表達載體中還包括人抗體恒定區(qū)基因組序列和強轉(zhuǎn)錄終止子。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的選擇標(biāo)志基因選自氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因或胸苷激酶(tk)基因、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hyg)基因、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)基因、天冬酰胺合成酶(AS)基因，所述的可擴增選擇標(biāo)志基因選自二氫葉酸還原酶(dhfr)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的弱化的啟動子為弱化的SV40啟動子。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的弱化的SV40啟動子是通過刪除SV40啟動子72bp大小的一段序列獲得，該72bp大小的序列的核苷酸序列如下所示5’-ATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGC-3’(SEQ ID NO1)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的翻譯型增強子為核苷酸長度為163bp的鼠VEGF基因5’—非翻譯區(qū)的SP163序列，該翻譯型增強子核苷酸序列如下所示5’-AGCGCAGAGGCTTGGGGCAGCCGAGCGGCAGCCAGGCCCCGGCCCGGGCCTCGGTTCCAGAAGGGAGAGGAGCCCGCCAAGGCGCGCAAGAGAGCGGGCTGCCTCGCAGTCCGAGCCGGAGAGGGAGCGCGAGCCGCGCCGGCCCCGGACGGCCTCCGAAACC-3’(SEQ ID NO2)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的強啟動子選自人巨細胞病毒立早基因啟動子PhCMV-IE或SV40早期基因啟動子PSV40-E、Rous肉瘤病毒LTR啟動子PRSV-LTR，強轉(zhuǎn)錄終止子選自牛生長激素基因聚腺苷化位點BGH polyA或SV40聚腺苷化位點SV40 polyA，人抗體恒定區(qū)基因組序列選自Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4或Cκ、Cλ。
7.由權(quán)利要求1—6任一項所述的方法制得的基因工程抗體真核高效表達載體系統(tǒng)。
8.如權(quán)利要求1所述的基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)，其為pYR-GKES表達系統(tǒng)，其包括克隆載體pYR-GCVH、pYR-GCVL、中間表達載體pYR-SV2-rdhfr、pYR-SV2-rneo和表達載體pYR-GSEVH、pYR-GSEVL、pYR-GCEVH、pYR-GCEVL，各載體具有
圖1-圖6所示的結(jié)構(gòu)。
9.權(quán)利要求7或8所述的基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)在制備和生產(chǎn)各種基因工程抗體中的應(yīng)用，其中所述的基因工程抗體包括各種類型的嵌合抗體、改形抗體、全人源化抗體、小分子抗體、胞內(nèi)抗體、雙特異性抗體及其它的類似物、突變物、合成物以及衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng)的方法,以及由此方法構(gòu)建的一種基因工程抗體真核高效表達系統(tǒng),稱為pYR－GKES表達系統(tǒng),包括8個獨立的克隆載體和表達載體,本發(fā)明還涉及由該方法制備的表達系統(tǒng)在制備和高產(chǎn)量生產(chǎn)嵌合抗體、改形抗體、全人源化抗體、小分子抗體、胞內(nèi)抗體、雙特異性抗體及其它的類似物、突變物、合成物以及衍生物中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/13GK1328157SQ0010806
公開日2001年12月26日 申請日期2000年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月9日
發(fā)明者楊治華, 冉宇靚 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所