專利名稱：生長抑素基因工程體及其活載體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明生長抑素基因工程體及其活載體疫苗(激生1號疫苗)，屬于生物技術(shù)高科技研究領(lǐng)域，專用于免疫家畜，通過激素免疫調(diào)控，促進家畜生長，提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量。
神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)在調(diào)控動物生長，胴體組成和繁殖性能方面起核心作用。利用外源激素來調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，以提高家畜的生產(chǎn)性能和飼料報酬，國內(nèi)外已有許多報道。最為熟知的是用固醇類和β-激動劑類化合物用以提高家畜生產(chǎn)性能，這就是第一代促生長劑。但此類制劑由于殘留問題和對人類健康的影響，而被列為國際禁用。第二代促生長劑為生長激素(GH)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，兩者均可加速動物生長。目前已開始使用重組GH和IGF-1，但它們的半衰期短，需要連續(xù)注射，給生產(chǎn)上應(yīng)用帶來不便，且存在一定的激素殘留，而影響使用。第三代的生長促進劑是利用生長抑素(SS)免疫中和調(diào)節(jié)機理，用化學合成的SS制備的合成肽疫苗主動免疫，或用SS抗血清被動免疫均能中和體內(nèi)SS，促進內(nèi)源性GH和IGF-1釋放增加，從而促進動物生長。其增重率在5～10％左右，但因SS合成肽疫苗和SS抗血清生產(chǎn)成本都很高，難以推廣應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是研制一種能有效地促進各種家畜生長，提高飼料報酬、成本低廉而又安全性高，無激素殘留，無潛在危險又不降低畜產(chǎn)品質(zhì)量的基因工程活載體疫苗。
本發(fā)明的實施方案如下1、生長抑素基因工程體—重組痘苗病毒(vv-HBs/SS)，其構(gòu)建方法為1、1)SS基因合成 SS為14個氨基酸殘基組成的短肽，其氨基酸序列和密碼子如下1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Ala Gly Cys Lys Aan Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys5′-CCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT-3′用380型DNA自動合成儀合成A52和A23 2個兩端有酶切位點的SS基因片段A525′-GGATCCGATGGCTGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT3′-AAGTGTAGGACAATCATTCGAAA-5′A23將2條合成單鏈摩爾等混合，退火，補齊，即成兩端有粘性末端的SS基因，并將其基因克隆于pUC12，獲得帶SS基因的pUC12-SS質(zhì)粒；BamHI 12345678910 11 12 13 14 stop5′-GGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT TAG TAAGCTTT-3′CCTAGGC TAC CGA CCG ACG TTC TTG AAG AAG ACC TTC TGA AAG TGT AGG ACA ATC ATTCGAAHindIII1、2)SS基因與HBsAg融合基因的構(gòu)建從帶HBs基因的pWR13-HBs/4經(jīng)改造成PWR13-HBs/6后，從中切下7000bp的HBs基因片段，將其插入pUC12-ss質(zhì)粒，構(gòu)建成帶HBs/ss嵌合基因的pUC12-HBs/ss質(zhì)粒；1、3)HBs/ss表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將HBs/ss嵌合基因克隆到痘苗病毒表達載體pGJP-5的啟動子P7.5之后，獲得pGJP-HBs/ss質(zhì)粒；1、4)帶HBs/ss基因的重組痘苗病毒克隆將pGJP-HBs/ss轉(zhuǎn)染，經(jīng)痘苗病毒感染的CV-1細胞，由于該質(zhì)粒中外源基因插入部位的兩側(cè)帶有痘苗病毒TK基因的同源序列，可與痘苗病毒基因組同源重組而獲得帶HBs/ss基因的重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)。
2、生長抑素基因工程活載體疫苗，其配制方法如下2、1)雞胚苗的接種、收獲 取生產(chǎn)用重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)毒種，用滅菌生理鹽水稀釋1000-10000倍，取0.2ml接種于絨毛尿囊膜上，置35～37℃繼續(xù)孵育，每天照蛋1-2次，取48小時至120小時死胚及120小時活胚，無菌收集有痘斑的雞胚絨毛尿囊膜，置無菌容器內(nèi)結(jié)凍保存，用于制苗。
2.2)半成品檢驗 取樣作無菌檢查，應(yīng)無細菌生長。
2.3)配苗 將合格的絨毛尿囊膜稱重，按2.5ml/g量加入5％蔗糖脫脂奶，制成勻漿，濾過。
2.4)分裝、凍干 將混合后的疫苗定量分裝，迅速進行冷凍真空干燥，按《制品冷凍真空干燥法》進行。
2.5)瓶器與包裝 按《獸醫(yī)生物制品規(guī)程》進行。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)在構(gòu)建了一株可用于生產(chǎn)生長抑素基因工程活載體疫苗的基因工程體。該工程體能在靶動物(哺乳動物)體內(nèi)復制增殖，并不斷分泌HBsAg/ss融合蛋白。此表達產(chǎn)物能組裝成大小20nm左右的病毒樣顆粒，具有良好的免疫原性，能誘導動物產(chǎn)生抗HBsAg和SS兩種抗體，后者能中和SS，促進內(nèi)源性生長激素(GH)分泌增加，進一步促使胰島素樣生長因子-1(IGF-1)分泌增加，從而加速動物生長；前者能防治近年來大量報道的動物類乙型肝炎，起到一箭雙雕的作用。
本發(fā)明首次提出應(yīng)用雞胚培養(yǎng)增殖重組痘苗病毒制備SS活載體疫苗。生產(chǎn)乙肝表面抗原(HBsAg)的重組痘苗病毒(vTH2)通常采用Vero細胞培養(yǎng)，我們對在vTH2的HBs基因上插入SS基因的新的重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)分別在Vero細胞和雞胚絨毛尿膜上培養(yǎng)，比較病毒增殖和基因表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在雞胚培養(yǎng)上vv-HBs/ss的空斑數(shù)遠遠超過Vero細胞培養(yǎng)，幾乎是細胞培養(yǎng)的100倍；HBsAg和SS的表達量也為細胞培養(yǎng)的7倍。不僅大大改進了用Vero細胞生產(chǎn)HBsAg的常規(guī)方法，并且避開了用Vero細胞制備活苗，難以通過完全性評估的難題。
vv-HBs/ss經(jīng)豚鼠角膜痕試驗和家兔皮內(nèi)接種試驗表明其毒力已較原痘苗病毒顯著減弱，接種靶動物11天后即不帶毒，在病毒增殖期內(nèi)不排毒，不引起同居感染。用以制備生長抑素活載體苗(激生1號疫苗)，免疫豬、牛、羊、兔均十分安全，未見有不良反應(yīng)，并均獲得顯著的增重效果。可用以制備能有效地促進各種家畜生長，提高飼料利用率，成本低，容易生產(chǎn)，而又安全性高，無激素殘留，無潛在危險的新型基因工程疫苗。該設(shè)苗于1999年3月和9月2次向農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)生物遺傳工程評價委員會申請生長抑素基因工程疫苗商品化生產(chǎn)評價。于2000年12月批準同意，在川、蘇2省進行商品化生產(chǎn)。


圖1 SS基因初級克隆質(zhì)粒的改造與鑒定示意2 生長抑素基因與乙型肝炎病毒表面抗原基因的融合及其克隆圖3 HBs/ss基因痘苗病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGJP-HBs/ss的構(gòu)建B，BamHI；E，EcoR I；H，HindIII；Sac I；Sal，Sal I；Acc，Acc I；Bg，Bgl II；sm，sma I；Xh，Xho I；HBs，HbsAg，ss，Somatostatin圖4 免疫家兔血清中ss含量變化及ss抗體，HbsAg抗體產(chǎn)生的動態(tài)曲線a.ss抗體的動態(tài)曲線 b.HB3Ag抗體的動態(tài)曲線 c.SS含量的動態(tài)曲線vv-ss/HBs免疫家兔 vTH2病毒陰性對照家兔 未經(jīng)任何處理的空白對照家兔圖5 免疫大鼠與對照組大鼠體增重曲線比較(a)1為免疫組，2為陰性對照組(b)1為免疫組，2為空白對照組實施例(一)基因工程體——重組痘苗病毒(vv-HBs/SS)的構(gòu)建1.SS基因合成 SS為14個氨基酸殘基組成的短肽，其氨基酸序列和密碼子如下1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Ala Gly Cys Lys Aan Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys5′-CCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT-3′用380型DNA自動合成儀合成A52和A23 2個兩端有酶切位點的SS基因片段
A525′-GGATCCGATGGCTGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT3′-AAGTGTAGGACAATCATTCGAAA-5′A23將2條合成單鏈摩爾等混合，退火，補齊，即成兩端有粘性末端的SS基因，并將其基克隆于pUC12，獲得帶SS基因的pUC12-SS質(zhì)粒。
BanHI 12 345678910 11 12 13 14 stop5′-GGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT TAG TAAGCTTT-3′CCTAGGC TAC CGA CCG ACG TTC TTG AAG AAG ACC TTC TGA AAG TGT AGG ACA ATC ATTCGAAHindIII2.SS基因與HBsAg融合基因的構(gòu)建從帶HBs基因的pWR13-HBs/4經(jīng)改造成PWR13-HBs/6后，從中切下7000bp的HBs基因片段，將其插入pUC12-ss質(zhì)粒，構(gòu)建成帶HBs/ss嵌合基因的pUC12-HBs/ss質(zhì)粒(見
圖1)。
3.HBs/ss表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將HBs/ss嵌合基因克隆到痘苗病毒表達載體pGJP-5的啟動子P7.5之后，獲得pGJP-HBs/ss質(zhì)粒。此重組基因在大腸桿菌胞漿內(nèi)隨質(zhì)粒的復制而復制，不與細菌染色體DNA融合，具有良好的安全性(見圖2)。
4.帶HBs/ss基因的重組痘苗病毒克隆轉(zhuǎn)基因方法為同源重組，將pGJP-HBs/ss轉(zhuǎn)染，經(jīng)痘苗病毒感染的CV-1細胞，由于該質(zhì)粒中外源基因插入部位的兩側(cè)帶有痘苗病毒TK基因的同源序列。因而可因同源重組而獲得帶HBs/ss基因的重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)，該痘苗病毒的TK基因，因插入外源基因而失活(見圖3)。
(二)疫苗的制備(重組痘苗病毒的增殖和表達)1.在Vero細胞上增殖和表達vv-HBs/ss接種Vero細胞37℃4h后，加營養(yǎng)液培養(yǎng)72h收獲。在Vero細胞上測定空斑單位(PFU)并用ELISA測定HBsAg含量，用RIA測定SS含量。結(jié)果病毒產(chǎn)量為5×106～107PFU/106細胞。SS表達水平為19.3ng/106細胞，其中分泌液中10.9ng，細胞內(nèi)8.4ng，對照培養(yǎng)物中無SS。HBsAg表達量為5800ng/106細胞，其中分泌液中3420ng，細胞內(nèi)2380ng。表達產(chǎn)物分別用SS抗體和HBsAg抗體免疫沉淀后，作電鏡檢查，結(jié)果均測定到大小20nm左右的病毒樣顆粒，與報道的HBsAg顆粒，大小，形態(tài)完全一致。表明本基因工程體表達產(chǎn)物為顆粒性多價抗原，具有SS和HBsAg 2種抗原表位。
2.在雞胚中增殖和表達vv-HBs/ss接種11日齡雞胚絨毛尿膜，繼續(xù)孵化，120h后，收獲帶痘斑的絨毛尿膜和尿囊液，高速勻漿后，在Vero細胞上測定vv-HBs/ss空斑單位(PFU)并用RIA和ELISA測量SS，HBsAg表達水平。結(jié)果收獲114只雞胚，除4只污染外，其余的絨毛尿囊膜上均產(chǎn)生明顯痘斑，其大小為0.2～3.0nm。病毒產(chǎn)量平均為5×108～10×108PFU/胚。尿囊液中HBsAg量平均為12.0μg/胚，絨毛尿囊膜勻漿液中為24.0μg/胚，總量約36.0μg/胚。SS表達量在尿囊液中為48ng/胚，絨毛尿囊膜勻漿液中為90ng/胚，總量約138.0ng/胚。見下表重組痘苗病毒在雞胚和細胞培養(yǎng)中增殖與表達的比較<
雞胚培養(yǎng)無論病毒產(chǎn)量(PFU/胚)和HBsAg和SS表達量均顯著高于細胞培養(yǎng)，幾乎是細胞培養(yǎng)的100倍，且雞胚培養(yǎng)方法簡易，收獲絨毛尿膜上的痘斑，勻漿后即可直接配苗，成本低廉，應(yīng)可作為本疫苗生產(chǎn)的首選方法。
(三)生長抑素基因工程疫苗實驗室小試1.家兔免疫試驗家兔(新西蘭純種，雄性，1.5kg/只)皮內(nèi)注射重組病毒vv-HBs/ss，1×10-8PFU/只，分背部6點注射。只帶HBs基因的重組痘苗病毒(vTH2)免疫家兔作陰性對照。未經(jīng)任何處理的兔為空白對照。每間隔一周采血分離血清，以備測定抗體和SS水平，至第12周為止。SS抗體及SS含量測定用RIA方法，HBsAg抗體用酶標免疫法測定。
家兔免疫試驗主要用于檢測SS疫苗能否刺激SS抗體產(chǎn)生，進而使SS水平下降。本試驗只用了3只家兔進行試驗。其結(jié)果見圖4。vv-HBs/ss免疫兔在第2，5周血清中出現(xiàn)SS抗體陽性，與空白兔血清測定的cpm之比(P/N)大于2.1，其中第5周出現(xiàn)的抗體峰較為明顯。vTH2陰性對照兔和空白兔血清中未測出ss抗體的產(chǎn)生，免疫兔第2、5周出現(xiàn)HBsAg抗體峰，與SS抗體產(chǎn)生的時間極相吻合。見圖4(a、b)。
免疫兔從第2周開始出現(xiàn)SS含量下降，第4、5周出現(xiàn)第2個較明顯的SS含量下降谷，SS含量為30-40pg/ml，第7周回升到正常水平，陰性對照和空白兔血清中SS含量都在90-190pg/ml之內(nèi)波動，免疫兔SS顯著下降時期與SS抗體上升峰相符。見圖4(c)。
2.大白鼠免疫試驗大白鼠(SD品系，雄性，約100g/只)分3組，免疫組(7只)背部3點皮內(nèi)注射vv-HBs/ss。1×107PFU/只。陰性對照組9只，同樣劑量及部位注射vTH2。另10只為空白組。免疫組在第30日，用純化的HBsAg/ss雜合顆粒(9μg/只)皮下注射以強化免疫一次，每間隙5天稱重一次，第55天捕殺動物，數(shù)據(jù)以平均值標準差表示，并經(jīng)t-檢驗。
結(jié)果，vv-HBs/ss免疫組大鼠的增重比vTH2陰性對照組和空白組大鼠增重快，在第2次免疫后尤為明顯。從共觀察的55天的結(jié)果顯著，免疫組平均日增重5.20g，陰性對照組4.43g，空白組4.67g，即免疫組比陰性組增重提高17.3％(p＜0.05)，比空白組提高11.3％(p＜0.05)。見圖5。
(四)疫苗的中試生產(chǎn)1.種毒1.1種毒來源 由南京農(nóng)業(yè)大學生長抑素基因工程疫苗研究課題構(gòu)建，并提供成都藥械廠作為中試生產(chǎn)的種毒。
1.2種毒基本特性 本疫苗種毒為南京農(nóng)業(yè)大學構(gòu)建的遺傳工程體——重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)，是將HBsAg/ss嵌合基因插入痘苗病毒的TK基因中，構(gòu)建而成。其基本特性同痘苗病毒，能在多種細胞培養(yǎng)和雞胚絨毛尿膜上生長。人工接種能感染各種哺乳動物。病毒能在宿主體內(nèi)復制，并持續(xù)一定時間。在此期間能不斷釋放基因的表達產(chǎn)物——HBsAg/ss融合蛋白。它能聚合形成大小20nm左右的病毒樣顆粒，是一種顆粒性多價免疫原，能刺激動物產(chǎn)生抗SS和抗HBsAg抗體。前者能中和SS，從而促進GH和IGF釋放，促使動物生長；后者能防治動物的類乙型肝炎。因此本遺傳工程體是一種既能促長，又能防病的基因工程二聯(lián)活載體苗。在外界環(huán)境中不能復制、增殖，不污染環(huán)境。
1.3種毒生物學特性測定1.3.1毒價滴定1.3.1.1空斑計數(shù) 種毒原液分別用MEM溶液或生理鹽水作10倍遞進稀釋，接種10-5、10-6兩個滴度。每個滴度接種3個已長成良好單層Vero細胞中方瓶，每瓶加入0.5ml，在37℃～38℃吸附60分鐘，加入MEM營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)5～7天，進行空斑計數(shù)。計數(shù)時，用記號筆在瓶底面點數(shù)，求出同一稀釋度3瓶中平均蝕斑數(shù)，計算出每毫升種毒原液所含空斑數(shù)。對種毒及其在雞胚繼代后不同代數(shù)進行空斑(PFU)計數(shù)，結(jié)果參見1.3.4。
1.3.1.2雞胚半數(shù)感染量(EID50)滴定 取雞胚毒(收獲有痘斑的絨毛尿囊膜)按濕重用生理鹽水1∶10稀釋，研磨勻漿，置-25℃反復凍融3～5次。用生理鹽水作10-1、10-2、……等10倍系列稀釋，取其中10-3～10-84個稀釋倍數(shù)接種10～12日齡的雞絨毛尿囊膜，每胚0.2ml。每個滴度10個胚，置37℃繼續(xù)孵育，每天照蛋一次。剔除48小時內(nèi)的死胎，收獲第48小時后死胎及120小時內(nèi)活胚，置4℃冰箱過夜，打開雞蛋，觀察絨毛尿囊膜上的痘斑數(shù)量、大小、色澤、中心有無壞死；膜水腫情況。以出現(xiàn)痘斑的最大稀釋度為終點，計算EID50。
1.3.2種毒毒力及穩(wěn)定性試驗
1.3.2.1角膜劃痕試驗 將樣品以滅菌生理鹽水作1000×、2000×、5000×、10000×、20000×等稀釋度，每一稀釋各劃種體重300～500g豚鼠1只，先以2％普魯卡因滴入一側(cè)眼角膜，施以局部麻醉，以角膜鑷子夾持結(jié)合膜，用手術(shù)刀在角膜上均勻地劃出3條平行刀痕，以肉眼看出痕跡，但未將角膜劃穿為度。然后自高倍稀釋度開始，分別將稀釋病毒滴液滴在角膜上，每只2滴，涂布均勻，靜置1分鐘左右，放回飼養(yǎng)。逐日觀察，第4天判定結(jié)果。
角膜反應(yīng)判定標準+++角膜呈混濁白色，虹彩完全不見，++角膜混濁，虹彩清晰可見，+角膜輕度混濁，有2/3混濁面，±角膜有1/3以下混濁面-角膜完全透明，僅有刀痕種毒復蘇后，在雞胚連續(xù)繼代，取F1、F3、F5、F8各代毒作角膜劃痕試驗。結(jié)果見下表種毒雞胚繼毒角膜劃痕試驗結(jié)果
原痘苗病毒的毒力通常在10000×+++以上，本重組痘苗病毒毒力穩(wěn)定在1000×+++左右，表明其毒力已較痘苗病毒顯著減弱。
1.3.2.2家兔皮內(nèi)接種試驗將樣品用滅菌生理鹽水作10-1～10-5遞增稀釋，取1.8～3.0kg健康兔2只，背部剃毛后，每兔接種5點，每一稀釋度1點，每點0.1ml，觀察4d，判定結(jié)果。按痘苗病毒標準10-1及10-2接種部位壞死直徑不得超過10mm；10-3～10-5接種部位不得有壞死。5個稀釋度的浸潤直徑總和平均不得小于50mm，結(jié)果見下表種毒雞胚繼代毒家兔皮內(nèi)接種試驗結(jié)果
-為無浸潤。
結(jié)果表明，所有稀釋度均不引起壞死。在10-1、10-2均出現(xiàn)直徑2～5mm的浸潤斑，5個稀釋度的浸潤直徑總和不超過14mm。以上2項試驗均表明其毒力比較原痘苗病毒已顯著減弱，且相當穩(wěn)定，不因繼代而增強。
1.3.3種毒在靶動物體內(nèi)消長規(guī)律測定種毒復蘇后，采雞胚毒勻漿，稀釋至一定濃度，肌肉注射3月齡新西蘭兔及1月齡仔豬，每只兔或豬的接種劑量均為4×107PFU。于接種后第2、3、5、7、11、15、20天定期撲殺2只。無菌采集各組織器官樣品，用PBS研磨制成1∶10勻漿，離心后取上清，接種9日齡雞胚絨尿膜，每個樣品接種雞胚3只。逐日照蛋，于接種后96小時內(nèi)收胚，觀察記錄絨尿膜痘斑情況，并剪取接種部位絨尿膜(直徑約2cm)，加該胚絨尿液1ml研磨成勻漿后，用HBsAg ELISA試劑盒檢測HBsAg。根據(jù)痘斑和HBsAg檢測結(jié)果，綜合判定樣品中是否含有重組病毒，從而弄清重組痘苗病毒(vv-HBsAg/ss)在家兔和豬體內(nèi)各組織器官中的分布情況和消長規(guī)律。為了查明接種動物的排毒相關(guān)情況，在對其分泌、排泄物進行病毒檢測的同時，我們在豬的試驗中，還設(shè)計了同居組。于同居第6天、第8天和第11天各撲殺2只，同上采樣檢測重組病毒。
1.3.3.1種毒在兔體內(nèi)的分布動態(tài)重組痘苗病毒在兔體檢測結(jié)果見表1。
表1 家兔各組織器官重組痘苗病毒檢測結(jié)果
—表示未檢出病毒和HBsAg，/表示未做。
由表1可見，在接種后7天后，血液及絕大多數(shù)組織器官內(nèi)均有重組病毒檢出，到第11天，肝、肺、腎仍有檢出，第15天后的所有樣品均為陰性。尿樣、腦和胸腺組織始終未檢出病毒。
重組病毒在豬體內(nèi)的分布和消長情況與兔體非常相似，在第15天和20天的所有樣品中均未分離和檢出到重組病毒。
1.3.3.3豬的同居感染試驗6只受試豬的所有樣品均未檢出到重組痘苗病毒。
1.3.4種毒表達水平及其穩(wěn)定性試驗本疫苗的基因工程體其表達產(chǎn)物為SS和HBsAg的融合蛋白(HBsAg/ss)，能組裝成病毒樣顆粒，在顆粒表面可檢出HBsAg和SS兩種抗原，HBsAg可用測HBsAg的ELISA試劑檢測。方法按試劑盒說明書進行。并用已知含量的標準品HBsAg倍比稀釋后作ELISA檢測。各稀釋之間呈良好的線性關(guān)系。用HBsAg含量為橫座標，OD450值為縱座標，作成標準曲線。其回歸曲線的公式為Y＝0.349+0.05X。
將HBsAg測定的OD450值代入回歸曲線公式，即可求得各樣品的HBsAg含量(μg/ml)。測SS目前主要用放射免疫分析(RIA)，但因檢測試劑價格昂貴，并需特定的脈沖計數(shù)器和防務(wù)設(shè)備，非常規(guī)實驗室所能做到。由于HBsAg和SS系在同一工程體上聯(lián)鎖表達，二者之比值是一定的。我們用多個樣品同時測定HBsAg和在上海第二軍醫(yī)大學用RIA測定SS含量，發(fā)現(xiàn)二者之比值衡定在210∶1。在本試驗中我們用HBsAg的含量按上述比值測算SS含量。
將低溫冰箱中保存的凍干種毒取出，在雞胚絨毛尿膜上連續(xù)繼代8代，收獲F1～F8各代的絨毛尿膜，按常規(guī)制苗方法勻漿后，分別作空斑滴定，進行HBsAg測定和SS測定。結(jié)果見下表激生1號疫苗空斑數(shù)表達水平和穩(wěn)定性試驗結(jié)果
，平均為3.13×108，完全符合制苗標準。HBsAg的表達量亦均以F1代最低，F(xiàn)2次之。其余各代均穩(wěn)定在較高水平，OD450最高達1.61，平均為1.47。代入回歸曲線公式求得其含量，最高為25.22μg/ml，最低為18.62μg/ml，平均22.42μg/ml。并求得SS含量，最高為120.09ng，最低88.67ng，平均106.76ng。
我們已建立用捕捉法ELISA檢測本疫苗中HBs/ss雜合顆粒中SS含量的專用方法，此法，正在進一步完善和試劑標準化及穩(wěn)定性的測試。用新建的方法測定一部分疫苗中SS含量，檢測結(jié)果與上述推算結(jié)果基本符合。
1.4種毒鑒定和保存1.4.1空斑數(shù)測定1.4.2表達水平測定1.4.2.1 HBsAg含量測定 在一般成品檢驗時測HBsAg的表達水平用OD450表示即可，但在種毒鑒定時最好能測到具體表達量。參見1.3.4。
1.4.2.2 SS含量測定 通常用RIA測定，但此法不能在一般實驗室，我們按表達產(chǎn)物中SS與HBsAg的衡定比例測算SS含量。參見1.3.4。
1.4.3毒力測定 同1.3.2.11.4.4無菌檢驗 按常規(guī)方法進行1.4.5支原體檢驗 按常規(guī)方法進行1.4.6外源病毒檢驗 按常規(guī)方法進行1.4.7結(jié)果 種毒測定結(jié)果見表1表1種毒鑒定結(jié)果*
*本表中的ml系指雞胚絨毛尿囊膜的勻漿原液。
表1結(jié)果表明，3代毒種完全符合毒種標準，可作生產(chǎn)用毒種。
1.4.8凍干保存 所有被測毒均符合予定指標要求，選擇其中空斑數(shù)高，表達水平穩(wěn)定者，凍干后-70℃冷凍保存，作為種毒批，生產(chǎn)中應(yīng)用時，在雞胚復壯繼代3代后應(yīng)用作為生產(chǎn)用種毒。
2.疫苗制造和半成品檢驗2.1生產(chǎn)用毒的制備2.1毒種繁殖 取冷凍保存的毒種，接種雞胚絨毛尿囊膜，無菌收膜，傳2～3代，加入保護劑，分裝小瓶中，封口，保存于-20℃低溫冰柜中，注明收獲日期、毒種代數(shù)及PFU數(shù)等。
2.2制苗材料的選擇 選發(fā)育良好的10-11日齡SPF雞胚作制苗材料。
2.3制苗用毒液的繁殖2.3.1雞胚苗的接種、收獲取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水稀釋成10-4，取0.2ml接種于絨毛尿囊膜上，接種后封閉針孔，置35℃～37℃繼續(xù)孵育，不必翻蛋，每天照蛋2次。將48小時前死亡的雞胚棄之，取48小時后至120小時死胚及120小時活胚，每若干個胚為一組，無菌收集有痘斑的雞胚絨毛尿囊膜，置無菌容器內(nèi)結(jié)凍保存，用于制苗。
2.4半成品檢驗每組分別取樣作無菌檢查，應(yīng)無細菌生長。
2.5配苗及分裝凍干2.5.1配苗 將合格的絨毛尿囊膜稱重，按2.5ml/g膜濕重量加入5％蔗糖脫脂奶，制成勻漿，濾過。
2.5.2分裝、東干 將混合后的疫苗定量分裝，迅速進行冷凍真空干燥，按《制品冷凍真空干燥法》進行。按凍干后的空斑數(shù)確定對各種家畜接種的頭份。
2.6瓶器與包裝 按《獸醫(yī)生物制品規(guī)程》進行。
3.成品檢驗3.1物理性狀 本品為微紅色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后，迅速溶解。
3.2無菌檢驗 按《無菌檢驗規(guī)程》進行。應(yīng)無菌。
3.3病原體檢驗 按《病原體檢驗法》進行。應(yīng)無病原體生長。
3.4外源病毒檢驗 按《獸醫(yī)生物制品標準》進行，應(yīng)無外源病毒污染。
3.5安全檢驗用18g小白鼠10只，每只皮內(nèi)注射0.5ml，觀察15天。應(yīng)健活。
3.6表達產(chǎn)物測定 每瓶疫苗加適量生理鹽水，恢復成凍干前勻漿原液容積。按1.3.4方法測定HBsAg。每ml勻漿原液OD450≥1.2，含量≥17.02μg/ml為合格。
3.7空斑計數(shù) 每批疫苗抽樣3瓶，按1.3.1.1作空斑計數(shù)。根據(jù)空斑單位確定使用頭份，牛等大動物用108PFU/頭左右，豬、羊等中動物用107PFU/頭左右。
3.8表達水平測定 按3.4.2.1和3.4.2.2法進行。
3.9剩余水分測定 按《凍干制品剩余水分測定法》進行。應(yīng)符合規(guī)定。
3.10真空度測定 應(yīng)符合規(guī)定。
9批疫苗成品檢驗結(jié)果見表2
表2 9批疫苗生產(chǎn)檢驗結(jié)果*<
>*本表中的ml數(shù)系指絨毛尿膜勻漿原液。
4.作用與用途 用于促進豬、牛、羊動物生長。
5.用法與用量 使用時按瓶簽注明頭份，用生理鹽水稀釋，肌注。
6.貯藏 在-15℃以下保存，有效期不超過2年。2～8℃保存不超過3個月。
(五)疫苗田間試驗1.免疫途徑試驗 痘苗病毒疫苗(牛痘苗)在人通常用皮膚劃種。對家畜我們也曾試用劃種，但操作困難，容易引起皮膚感染，效果也不確實。故改用多點皮內(nèi)注射。我們比較了皮內(nèi)注射與肌肉注2種免疫途徑的免疫增重效果。
1.1預備試驗 用三元雜交公豬35日齡斷奶6頭去勢后，分成3組，第1組皮內(nèi)注射，劑量1ml/頭(1.05×107PFU)，分5點注射，第2組肌肉注射1ml/頭(1.05×107PFU)，第3組注射生理鹽水皮內(nèi)注射對照。免疫后，皮內(nèi)組在注射部位出現(xiàn)丘疹、水皰、化膿等出痘反應(yīng)，第9天消退，2周后結(jié)痂脫落，局部形成白色凹陷疤痕，肌肉組和對照組均無可見反應(yīng)，以后于接種后3、6、9、12、15、17周稱重，并計算飼料消耗，結(jié)果見下表免疫途徑試驗增重與飼料消耗表
1*最小二乘均數(shù)皮內(nèi)組織和肌肉組日增重均顯著高于對照組，增重提高率分別為10.3％和12.1％，凈增重分別為6.6kg/頭和8.2kg/頭，飼料利用率均提高5.5％。
1.2 55～60日齡豬免疫途徑試驗取58日齡左右的架子豬23頭，分為皮內(nèi)注射組，劑量8.4×107PFU/頭；大劑量肌肉注射組，劑量1.2×109PFU/頭和生理鹽水對照組，觀察、稱重4個月。結(jié)果見下表。
50～60日齡豬不同途徑免疫增重結(jié)果
結(jié)果皮內(nèi)組免疫后可持續(xù)增重4個月，提高增重15.3％，凈增重7.3kg/頭，本試驗未設(shè)同樣劑量的肌肉注射組，而設(shè)了一個大劑量肌注組是個錯誤，但卻因此發(fā)現(xiàn)大劑量免疫不僅不能提高免疫增重效果，反而出現(xiàn)負增重(-5.2％)這一值得重視的現(xiàn)象。
1.3 85～90日齡肥豬不同途徑免疫試驗 取85～90日齡的肥育豬30頭，分成4組，第1組為皮內(nèi)注射組，第2組為肌注組，劑量均為8.4×107/頭，第3組先肌肉注射后于130日齡時用大劑量(8.4×108PFU/頭)加強免疫，第4組為鹽水對照組，觀察、稱重12周，結(jié)果見下表85～90日齡豬不同途徑免疫增重結(jié)果
>結(jié)果皮內(nèi)和肌肉組增重效果不相上下，分別提高8.8％和9.1％，凈增重為3.6kg/頭和3.7kg/頭，大劑量加強免疫組在加注前均高于以上2組，加強注射后至12周稱重體重時顯著落后，增重提高為6.9％，凈增重2.8kg/頭，再一次說明大劑量免疫反而抑制增重。
1.4小結(jié) 從以上3次試驗看，皮內(nèi)注射和肌肉注射增重效果無顯著差異，前2次試驗提高增重率和凈增均高于第3次試驗。這主要由于觀察、稱重的時間不同，前二者均為4個月，而后者為3個月，與免疫日齡關(guān)系不大。由于皮內(nèi)注射操作麻煩，且獸醫(yī)習慣用肌肉注射，因此確定以后免疫途徑一律采用肌肉注射。至于免疫日齡建議在出欄前3～4個月免疫為佳。加大免疫劑反而影響生長，這是一個重大發(fā)現(xiàn)是應(yīng)用激素免疫調(diào)控時應(yīng)該注意的。
3.安全試驗3.1家兔安全試驗 在重組痘苗病毒在動物體內(nèi)消化規(guī)律研究中，我們用4×107PFU/頭的劑量(豬的1免疫劑量)給14只家兔免疫，均未見有不良反應(yīng)，在最適免疫量試驗中，用108、107、106、105PFU/頭劑量，分別免疫10只家兔，亦均未見有不良反應(yīng)。其中108PFU/頭已是家兔最適免疫劑量的100倍。免疫兔不排毒，不引起同居感染，說明本疫苗對家兔是十分安全的。
3.2豬的安全試驗 先后在四川地區(qū)近百個豬場和部分農(nóng)戶中試用，共免疫豬20700頭，無一例出現(xiàn)精神異常、食欲降低等不良反應(yīng)。其中有16頭豬用10倍以上劑量接種，亦無不良反應(yīng)。在進行不同途徑免疫試驗中，亦曾用1.2×109PFU/頭(10頭份)和8.4×108PFU/頭(8頭份)大劑量免疫豬，亦均無不良反應(yīng)，免疫豬不排毒，不引起同居感染，說明本疫苗對豬是十分安全的。
3.3牛、羊的安全試驗 在江蘇、安徽、四川、新疆等地區(qū)免疫肉牛938頭，綿羊和山羊7304頭，均無任何不良反應(yīng)。表明本疫苗對牛、羊都是十分安全的。
3.4懷孕動物的安全性試驗 取健康懷孕豚鼠10只，飼養(yǎng)觀察1周后，接種激生1號疫苗107PFU/只(兔的10倍劑量)。觀察10天，未見有任何不良反應(yīng)，也不引起流產(chǎn)。繼續(xù)飼養(yǎng)，直至各豚鼠均安全分娩，表明本疫苗對懷孕動物是安全的。
4.免疫豬屠宰試驗 在對豬85～90日齡段的免疫豬，在用本疫苗肌肉注射及皮內(nèi)注射，免疫后4個月的豬及對照，各選3頭體重在84～90kg的豬進行屠宰測定，屠宰前空腹12～24h，宰后的胴右片進行膘厚、眼肌面積、胴體長、pH值、肉色等測量。其左半胴體取第3～5腰椎處背最長肌中心部分各取樣100g作肉脂化學成分的常規(guī)分析，測定水份、粗脂肪、粗蛋白等成分。
結(jié)果對照、肌注和皮內(nèi)各組宰前平均活重為85.9kg、89.3kg和85.7kg、屠宰率對照為72.9％、肌肉組為73.4％、皮內(nèi)組為72.4％。差異不顯著，平均膘厚分別為2.53cm、2.57cm和2.48cm、瘦肉率分別為52.9％、48.2％和52.4％，肌肉組屠宰體重大，瘦肉率低，但因個體差異大，差異不顯著，試驗豬皮、脂、骨、肉的比例均與對照相近。只是板油重和板油率，對照組為2.22kg和2.57％，而肌肉組和皮內(nèi)組分別為1.70kg和1.9％，1.93kg和2.20％，均低于對照組。各組肉質(zhì)的物理分析；pH值均在6.4～7.0之間，其他嫩度、大理石紋、系水力，肉色均無明顯的差異。對肉質(zhì)的化學成分進行分析；對照組水分、蛋白質(zhì)、粗脂肪分別占72.2％，19.4％，8.1％；肌注組分別占73.3％，19.8％，6.7％；皮主組分別占73.5％，20.3％，5.5％。各組間差異不大。屠宰測定的結(jié)果說明激生I號促進肉豬的增重并不影響豬肉的質(zhì)量，它是一種安全的疫苗。
5.田間試驗和區(qū)域試驗 本疫苗至1999年已試生產(chǎn)疫苗5萬頭劑(豬)，發(fā)出進行田間試驗和區(qū)域試驗4萬余頭劑。經(jīng)返回信息，豬20700頭，羊7304頭，牛938頭。結(jié)果表明免疫增重效果顯著，茲分別敘述于下5.1豬的田間試驗和區(qū)域試驗 豬一次免疫可持續(xù)增重3～4個月，提高增重率最低1.3％，最高51.6％，平均10％以上。每頭豬凈增重則視免疫日齡、氣候和飼料管理條件、疾病干擾以及觀察稱重時間，而有很大差異。平均在5kg/頭左右。以四川都江堰市的區(qū)域示范試驗為例，試驗在該市畜牧局下屬17個豬場進行，共參試豬677頭，其中免疫組383頭，對照組294頭。免疫后觀察、稱重99～143天，結(jié)果免疫組比對照組日增重平均提高12.15％，平均凈增重6.35kg/頭，四川省及重慶市等地區(qū)使用本疫苗后的情況見表3表3四川省及重慶市等部分地區(qū)使用生長抑素基因工程活載體疫苗情況
5.2肉牛的田間試驗和區(qū)域試驗 共免疫肉牛938頭，其中每月稱重，共返饋稱重紀錄的3個肉牛場共免疫牛49頭。對照組38頭。觀察、稱重83和116天。結(jié)果稱重至83天者提高增重44.8％和31.9％，凈增重分別為20.2kg/頭和14.4kg/頭。稱重至116天者提高增重27.8％和17.5％，凈增重為11.93kg/頭和7.27kg。如后者按95天稱重統(tǒng)計，則提高增重率為32.96％和28.98％。也就是說第4個月免疫增重效力顯著降低，有一個組甚至出現(xiàn)負增重。結(jié)果顯示牛一次免疫可持續(xù)增重3個月。如需繼續(xù)飼養(yǎng)，應(yīng)加強免疫，但本疫苗因系活載體苗不適于再次免疫。對于生長期的大家畜和乳用家畜，如乳牛、乳羊用于促進泌乳，增加乳產(chǎn)量，則需研究其他激生系列疫苗，以期更上一層樓。目前對肉牛來說以在出欄前3個月時免疫為宜。
5.3羊的田間試驗和區(qū)域試驗 綿羊田間試驗返回按月稱重記錄的有A、B1、B2三個，羊群A群參試羊共63頭，免疫31頭，對照32頭，稱重3個月，結(jié)果試驗組比對照組增重提高33.6％，凈增重4.7kg，B1群參試羊60頭，免疫和對照各30頭，稱重63天，結(jié)果增重提高僅7.4％，凈增重0.67kg/頭，但如將公母羊分開計算，則母羊增重提高11％，公羊4.2％，凈增重母羊0.87kg/頭，公羊0.36kg/頭，存在明顯性別差異。B2群參試羊16頭，免疫、對照各8頭，均為不去勢公綿羊，稱重63天。結(jié)果提高增重24.9％，凈增重1.92kg/頭，3個組之間有明顯差異，這可能是由于后二者觀察稱重時間短(少1個月)有一定影響。另外對公羊去勢比不去勢的效果要好。山羊田間試驗做得較少，只有四川成都郊區(qū)麻羊的一次試驗共5個羊群，共參試羊188頭，免疫組96頭，試驗組92頭，增重率最低11.7％，最高37.4％，凈增重最低0.33kg/頭，最高1.46kg/頭，平均0.66kg/頭，其中最高的一組始重最高。這是一條重要的經(jīng)驗，本疫苗給山羊的時間適當推遲更好。從免疫劑量看，其免疫量以降低至107PFU/頭為宜。
根據(jù)四川內(nèi)江市對大耳綿羊的區(qū)域試驗，共參試綿羊4800頭，觀察3個月，平均提高增重22.2～34.5％，每頭凈增重2.3～3.3kg。共參試山羊1800頭。觀察3個月，平均提高增重18.9％，每頭凈增重1.5～3.0kg。
權(quán)利要求
1.用于生長抑素(SS)基因工程活載體疫苗的基因工程體——重組痘苗病毒(vv-HBs/SS)，其構(gòu)建方法為1、1)SS基因合成和克隆SS為14個氨基酸殘基組成的短肽，其氨基酸序列和密碼子如下123456789 10 11 12 13 14Ala Gly Cys Lys Aan Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys5′-CCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT-3′用380型DNA自動合成儀合成A52和A23 2個兩端有酶切位點的SS基因片段A525′-GGATCCGATGGCTGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT3′-AAGTGTAGGACAATCATTCGAAA-5′A23將2條合成單鏈摩爾等混合，退火，補齊，即成兩端有粘性末端的SS基因，并將其基因克隆于pUC12，獲得帶SS基因的pUC12-SS質(zhì)粒BamHI 1 23456789 10 11 12 13 14 stop5′-GGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT TAG TAAGCTTT-3′CCTAGGC TAC CGA CCG ACG TTC TTG AAG AAG ACC TTC TGA AAG TGT AGG ACA ATC ATTCGAAHindIII1、2)SS基因與HBsAg融合基因的構(gòu)建 從帶HBs基因的pWR13-HBs/4經(jīng)改造成PWR13-HBs/6后，從中切下7000bp的HBs基因片段，將其插入pUC12-ss質(zhì)粒，構(gòu)建成帶HBs/ss嵌合基因的pUC12-HBs/ss質(zhì)粒；1、3)HBs/ss表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將HBs/ss嵌合基因克隆到痘苗病毒表達載體pGJP-5的啟動子P7.5之后，獲得pGJP-HBs/ss質(zhì)粒；1、4)帶HBs/ss基因的重組痘苗病毒克隆 將pGJP-HBs/ss轉(zhuǎn)染，經(jīng)痘苗病毒感染的CV-1細胞，由于該質(zhì)粒中外源基因插入部位的兩側(cè)帶有痘苗病毒TK基因的同源序列，因同源重組而獲得帶HBs/ss基因的重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)。
2.用權(quán)利要求1所述生長抑素基因工程體制成的基因工程活載體疫苗(激生1號疫苗)，其配制方法如下2、1)雞胚苗的接種、收獲 取生產(chǎn)用重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)毒種，用滅菌生理鹽水稀釋1000-10000倍，取0.2ml接種于絨毛尿囊膜上，置35℃～37℃繼續(xù)孵育，每天照蛋1-2次，取48小時至120小時死胚及120小時活胚，無菌收集有痘斑的雞胚絨毛尿囊膜，置無菌容器內(nèi)結(jié)凍保存，用于制苗；2.2)半成品檢驗 取樣作無菌檢查，應(yīng)無細菌生長；2.3)配苗 將合格的絨毛尿囊膜稱重，按2.5ml/g量加入5％蔗糖脫脂奶，制成勻漿，濾過；2.4)分裝、凍干 將混合后的疫苗定量分裝，迅速進行冷凍真空干燥，按《制品冷凍真空干燥法》進行；2.5)瓶器與包裝 按《獸醫(yī)生物制品規(guī)程》進行。
全文摘要
本發(fā)明生長抑素基因工程體及其活載體疫苗,屬于生物技術(shù)高科技研究領(lǐng)域。將合成的SS基因連接于乙肝表面抗原(HBsAg)基因上,構(gòu)建成HBs/ss融合基因。然后將其克隆到痘苗病毒表達載體(pGJP－5)中,與痘苗病毒同源重組,篩選出能表達HBsAg/ss融合蛋白的重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)。將此基因工程體在雞胚絨毛尿膜上增殖后,制成生長抑素基因工程活載體疫苗。經(jīng)農(nóng)業(yè)部審批為安全等級Ⅰ級,同意進行中間試驗。試驗結(jié)果表明,本疫苗生產(chǎn)工藝簡便,不造成環(huán)境污染,免疫豬、牛、羊等家畜安全有效。于1999年月12月經(jīng)農(nóng)業(yè)部審批。同意在川、蘇2省商品化生產(chǎn)(農(nóng)基安審定99B－03—09)。
文檔編號C12N15/62GK1267724SQ0010729
公開日2000年9月27日 申請日期2000年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月9日
發(fā)明者杜念興, 楊宏, 吉傳義, 龔文波, 徐文忠, 王林云, 申詠紅, 黃吉風, 張益民, 楊京平, 李汝儉 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學, 中牧實業(yè)股份有限公司成都藥械廠