一種白背三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種白背三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]白背三七(divaricata (L.)DC.),又名白子菜、白紅菜、厚面皮等,為菊科三七屬植物。主要分布于兩廣、福建一帶，喜生于潮濕的陰地上。民間以白背三七地上部分作為食藥兩用，廣泛用于高血壓病、高血脂血癥及糖尿病等治療，具有較高的藥用價值，市場前景廣闊。
[0003]白背三七植物主要含有生物堿類，黃酮類，三萜類及一些長鏈脂肪族類化合物，具有一定的抗癌作用。由于白背三七全株含有致肝毒性吡咯里西啶生物堿(HPAs)及其氮氧化物而使其廣泛應(yīng)用受到一定制藥。因此應(yīng)用植物細(xì)胞工程技術(shù)減少甚至脫除HPAs并生產(chǎn)有用的次生代謝產(chǎn)物并生產(chǎn)有用的次生代謝產(chǎn)物具有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種白背三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，本發(fā)明以白背三七幼葉為外植體，通過白背三七愈傷組織誘導(dǎo)、胚性愈傷篩選及增殖等步驟建立了白背三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，為通過組織培養(yǎng)技術(shù)脫除白背三七吡咯里西啶生物堿(HPAs)并積累有效成分提供技術(shù)支持。進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種白背三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，包括以下的工藝步驟: (I)外植體消毒:選取白背三七嫩葉用清水洗凈，在超凈工作臺中用2%?5%的洗潔精溶液漂洗I?5min,無菌水沖洗3?5次后用75%?80%乙醇溶液浸泡10?30s, 0.1%?0.2%升萊溶液消毒5?1min, 2%?4%次氯酸鈉溶液消毒10?20min,無菌水沖洗4?6次，然后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)20?30天，然后置于每天光照12?15小時，光照強(qiáng)度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)起直至形成愈傷組織。
[0006](2)增殖培養(yǎng):挑選狀態(tài)較為一致的愈傷組織接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)7?14天，然后置于每天光照12?15小時，光照強(qiáng)度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)，15?20天轉(zhuǎn)接一次。
[0007](3)液體培養(yǎng):選取疏松易碎、有金屬光澤、生長旺盛的胚性愈傷組織用鑷子夾碎后接種于液體培養(yǎng)基中在轉(zhuǎn)速為100?150r/min，光照強(qiáng)度為800?12001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。
[0008](4)懸浮細(xì)胞系建立:用40?50目的過濾篩對懸浮初期培養(yǎng)物進(jìn)行過濾，以除去大細(xì)胞團(tuán)，保留分散程度好的小細(xì)胞及單細(xì)胞，按1:3?1:2的體積轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)液，懸浮培養(yǎng)周期為6?9天，多次繼代建立懸浮細(xì)胞系。
[0009]上述步驟(I)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1?4mg/L ΚΤ+0.2?0.8mg/L NAA+0.5?2.0mg/L 6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0010]上述步驟(2)所述的增殖培養(yǎng)基為:B5+0.1?0.5mg/L NAA+1?3.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0011]上述步驟(3)所述的液體培養(yǎng)基為:B5+0.1?0.3mg/L NAA+0.5?1.5mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(4)所述的條件為:接種密度為70?90g/L (鮮質(zhì)量)，裝液量為30?40%。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明通過植物細(xì)胞離體培養(yǎng)技術(shù)手段積累并生產(chǎn)有效成分的方法。以白背三七幼葉為外植體，通過白背三七愈傷組織誘導(dǎo)、胚性愈傷篩選及增殖等步驟建立了白背三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，為通過組織培養(yǎng)技術(shù)脫除白背三七吡咯里西啶生物堿(HPAs)并積累有效成分提供技術(shù)支持。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
[0015]實(shí)施例1:
(I)外植體消毒:選取白背三七嫩葉用清水洗凈，在超凈工作臺中用2%的洗潔精溶液漂洗Imin,無菌水沖洗3次后用75%乙醇溶液浸泡1s, 0.1%升萊溶液消毒5min,2%次氯酸鈉溶液消毒lOmin，無菌水沖洗4次，然后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后先在25°C條件下全暗培養(yǎng)20天，然后置于每天光照12小時，光照強(qiáng)度為15001x，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)31天即形成愈傷組織，誘導(dǎo)率85.3%。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+lmg/LKT+0.2mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂，pH 值為 5.8。
[0016](2)增殖培養(yǎng):挑選狀態(tài)較為一致的愈傷組織接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后先在25°C條件下全暗培養(yǎng)7天，然后置于每天光照12小時，光照強(qiáng)度為15001x，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)，15天轉(zhuǎn)接一次。所述增殖培養(yǎng)基為B5+0.lmg/L NAA+lmg/L6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂，pH 值為 5.8。
[0017](3)液體培養(yǎng):選取疏松易碎、有金屬光澤、生長旺盛的胚性愈傷組織用鑷子夾碎后接種于液體培養(yǎng)基中在轉(zhuǎn)速為100r/min，光照強(qiáng)度為800x，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。所述的液體培養(yǎng)基為B5+0.lmg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+2.5%蔗糖，pH值為5.8。
[0018](4)懸浮細(xì)胞系建立:用40目的過濾篩對懸浮初期培養(yǎng)物進(jìn)行過濾，以除去大細(xì)胞團(tuán)，保留分散程度好的小細(xì)胞及單細(xì)胞，按1:3的體積、接種密度為70g/L (鮮質(zhì)量)，裝液量為30%轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)液，懸浮培養(yǎng)周期為6天，多次繼代即可建立懸浮細(xì)胞系。
[0019]實(shí)施例2:
(I)外植體消毒:選取白背三七嫩葉用清水洗凈，在超凈工作臺中用3%的洗潔精溶液漂洗5min，無菌水沖洗3次后用78%乙醇溶液浸泡10s，0.15%升汞溶液消毒5min，3%次氯酸鈉溶液消毒15min，無菌水沖洗4次，然后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后先在25°C條件下全暗培養(yǎng)20天，然后置于每天光照14小時，光照強(qiáng)度為20001χ，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)28天即形成愈傷組織，誘導(dǎo)率89.8%。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.5mg/L KT+0.5mg/L NAA+0.7mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂，pH 值為 5.8。
[0020](2)增殖培養(yǎng):挑選狀態(tài)較為一致的愈傷組織接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后先在25°C條件下全暗培養(yǎng)10天，然后置于每天光照12小時，光照強(qiáng)度為15001x，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)，18天轉(zhuǎn)接一次。所述增殖培養(yǎng)基為B5+0.4mg/L NAA+1.2mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂，pH 值為 5.8。
[0021](3)液體培養(yǎng):選取疏松易碎、有金屬光澤、生長旺盛的胚性愈傷組織用鑷子夾碎后接種于液體培養(yǎng)基中在轉(zhuǎn)速為130r/min，光照強(qiáng)度為ΙΟΟΟχ，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。所述的液體培養(yǎng)基為Β5+0.3mg/L NAA+0.9mg/L 6-BA+3.5%蔗糖，pH值為5.8ο
[0022](4)懸浮細(xì)胞系建立:用50目的過濾篩對懸浮初期培養(yǎng)物進(jìn)行過濾，以除去大細(xì)胞團(tuán)，保留分散程度好的小細(xì)胞及單細(xì)胞，按1:2的體積、接種密度為80g/L (鮮質(zhì)量)，裝液量為35%轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)液，懸浮培養(yǎng)周期為8天，多次繼代即可建立懸浮細(xì)胞系。
【主權(quán)項】
1.一種白背三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下工藝步驟: (1)外植體消毒:選取白背三七嫩葉用清水洗凈，在工作臺中用2%?5%的洗潔精溶液漂洗I?5min，無菌水沖洗3?5次后用75%?80%乙醇溶液浸泡10?30s，0.1%?0.2%升萊溶液消毒5?1min, 2%?4%次氯酸鈉溶液消毒10?20min,無菌水沖洗4?6次，然后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)20?30天，然后置于每天光照12?15小時，光照強(qiáng)度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)起直至形成愈傷組織； (2)增殖培養(yǎng):挑選狀態(tài)較為一致的愈傷組織接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)7?14天，然后置于每天光照12?15小時，光照強(qiáng)度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)，15?20天轉(zhuǎn)接一次； (3)液體培養(yǎng):選取疏松易碎、有金屬光澤、生長旺盛的胚性愈傷組織用鑷子夾碎后接種于液體培養(yǎng)基中在轉(zhuǎn)速為100?150r/min，光照強(qiáng)度為800?12001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)； (4)懸浮細(xì)胞系建立:用40?50目的過濾篩對懸浮初期培養(yǎng)物進(jìn)行過濾，以除去大細(xì)胞團(tuán)，保留分散程度好的小細(xì)胞及單細(xì)胞，按1:3?1:2的體積轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)液，懸浮培養(yǎng)周期為6?9天，多次繼代建立懸浮細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白背三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(I)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1?4mg/L ΚΤ+0.2?0.8mg/L ΝΑΑ+0.5?2.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂，pH 值為 5.4 ?5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白背三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(2)所述的增殖培養(yǎng)基為:B5+0.1?0.5mg/L NAA+1?3.0mg/L 6-BA+2.5%?3.5%蔗糖+0.35% ?0.5% 瓊脂，pH 值為 5.4 ?5.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白背三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(3)所述的液體培養(yǎng)基為:B5+0.1 ?0.3mg/L ΝΑΑ+0.5 ?1.5mg/L 6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖，pH值為5.4?5.8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白背三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(4)所述的條件為:接種密度為70?90g/L，裝液量為30?40%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種白背三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，涉及白背三七（Gynura divaricata(L.)DC.）通過植物細(xì)胞離體培養(yǎng)技術(shù)手段積累并生產(chǎn)有效成分的方法。本發(fā)明以白背三七幼葉為外植體，通過白背三七愈傷組織誘導(dǎo)、胚性愈傷篩選及增殖等步驟建立了白背三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，為通過組織培養(yǎng)技術(shù)脫除白背三七吡咯里西啶生物堿（HPAs）并積累有效成分提供技術(shù)支持。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104686340
【申請?zhí)枴緾N201510085930
【發(fā)明人】楊業(yè)容
【申請人】楊業(yè)容
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月22日