本發(fā)明涉及一種擬南芥管狀分子體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法，屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

生物質(zhì)能源的開(kāi)發(fā)是應(yīng)對(duì)能源危機(jī)的有效途徑。細(xì)胞壁成分是地球上產(chǎn)量最高的生物質(zhì)，細(xì)胞壁的主要成分有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，其中木質(zhì)素嚴(yán)重阻礙纖維素和半纖維素的有效利用，因此，對(duì)細(xì)胞壁形成的機(jī)理研究和成分改造有利于生物質(zhì)能源的高效利用。

管狀分子是植物木質(zhì)部組織的主要功能結(jié)構(gòu)——包括管胞和導(dǎo)管，負(fù)責(zé)根吸收的水分向地上部分長(zhǎng)距離的運(yùn)輸。管狀分子側(cè)壁的紋狀加厚是管狀分子的主要結(jié)構(gòu)特征，這一結(jié)構(gòu)為導(dǎo)管長(zhǎng)距離的運(yùn)輸功能提供重要機(jī)械支持作用。管狀分子是由根尖分生組織產(chǎn)生的導(dǎo)管前體細(xì)胞分化而來(lái)的，其細(xì)胞分化過(guò)程由細(xì)胞縱向伸長(zhǎng)、次生壁紋狀加厚和穿孔板形成3個(gè)連續(xù)階段組成。次生壁在管狀分子側(cè)壁有規(guī)律的紋狀加厚受到胞內(nèi)機(jī)制的精密控制，次生壁物質(zhì)的沉積只發(fā)生在側(cè)壁而不能發(fā)生在兩端(穿孔板部位)，次生壁在側(cè)壁上不是均勻累積而是呈規(guī)則的紋狀加厚，管狀分子的這一加厚模式稱(chēng)之為次生壁物質(zhì)的極性沉積。因此管狀分子是研究次生壁物質(zhì)累積的一個(gè)良好模型。

由于管狀分子位于植物體內(nèi)部，且處于正在發(fā)育過(guò)程中的管狀分子相對(duì)數(shù)量較少，對(duì)發(fā)育中的管狀分子進(jìn)行研究取材極為困難，因此對(duì)管狀分子進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)成為次生壁成分累積研究的一個(gè)重要手段。但目前關(guān)于擬南芥管狀分子體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的報(bào)道較少，而且多存在取材復(fù)雜、培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)、細(xì)胞分散性欠佳等問(wèn)題。因此，構(gòu)建新的擬南芥管狀分子體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，對(duì)于次生壁成分積累的研究具有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種擬南芥管狀分子體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法，本發(fā)明的方法在擬南芥材料上適用范圍更廣泛、取材更簡(jiǎn)易、培養(yǎng)時(shí)間縮短、獲得細(xì)胞分散性更好。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種擬南芥管狀分子體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法，步驟如下：

(1)制備擬南芥愈傷組織；

(2)在愈傷組織增殖培養(yǎng)基上對(duì)擬南芥愈傷組織進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)；

(3)將擴(kuò)繁后的擬南芥愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，獲得分散性良好的擬南芥愈傷組織懸浮培養(yǎng)系；

(4)將擬南芥愈傷組織懸浮培養(yǎng)系采用細(xì)胞篩進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后的單細(xì)胞培養(yǎng)系轉(zhuǎn)入擬南芥管狀分子體外誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)擬南芥愈傷組織單細(xì)胞進(jìn)行分化，在體外形成管狀分子。

步驟(1)中，擬南芥愈傷組織的制備方法為：將萌發(fā)后10～14天苗齡擬南芥幼苗整株切碎接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，23～25℃暗培養(yǎng)，14～16天繼代一次，共誘導(dǎo)培養(yǎng)28～32天，獲得擬南芥愈傷組織。

所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在B5基本培養(yǎng)基中添加20g/L的蔗糖、0.5mg/L的2,4-D，0.05mg/L的6-BA，6～8g/L的瓊脂，調(diào)節(jié)pH為5.8。

步驟(1)中，所述擬南芥幼苗的培養(yǎng)方法為：挑選成熟飽滿(mǎn)的擬南芥種子，用質(zhì)量濃度為2％次氯酸鈉滅菌20min，無(wú)菌水沖洗4次后，播種于MS基本培養(yǎng)基上。

步驟(2)中，所述愈傷組織增殖培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基中添加30g/L的蔗糖、1mg/L的2,4-D，6～8g/L的瓊脂，調(diào)節(jié)pH為5.8。

步驟(2)中，擴(kuò)繁培養(yǎng)采用的條件為：23～25℃暗培養(yǎng)，15～20天繼代一次，共培養(yǎng)30～40天。

步驟(3)中，懸浮培養(yǎng)采用的條件為：將擴(kuò)繁后的擬南芥愈傷組織接種于MS液體培養(yǎng)基中，23～25℃，以180rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩，暗培養(yǎng)，2～3天繼代一次，共培養(yǎng)6～9天。

所述MS液體培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基中添加30g/L的蔗糖，調(diào)節(jié)pH為5.8。

步驟(4)中，采用200目的細(xì)胞篩進(jìn)行過(guò)濾。

步驟(4)中，所述擬南芥管狀分子體外誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基中添加30g/L的蔗糖、6mg/L的NAA，1mg/L的6-BA，6μM的EBL，調(diào)節(jié)pH為5.8。

步驟(4)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)采用的條件為：23～25℃，以180rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩，持續(xù)進(jìn)行暗培養(yǎng)。

本發(fā)明的有益效果：

(1)擬南芥管狀分子體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的初始培養(yǎng)采用的是擬南芥幼苗整株切碎作為外植體，材料數(shù)量多，取材容易。

(2)本發(fā)明利用擬南芥幼苗進(jìn)行短期培養(yǎng)(兩個(gè)半月至三個(gè)月)誘導(dǎo)新生擬南芥細(xì)胞系，適用于任何種子能夠萌發(fā)的擬南芥基因型，不僅材料適用范圍更加廣泛，并且不必?fù)?dān)心在繼代過(guò)程中由于細(xì)胞系污染或死亡導(dǎo)致的材料丟失問(wèn)題。

(3)本發(fā)明的擬南芥管狀分子體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法中，通過(guò)步驟(3)中愈傷組織的懸浮培養(yǎng)和步驟(4)中將愈傷組織懸浮培養(yǎng)系用200目細(xì)胞篩進(jìn)行過(guò)濾，使獲得的細(xì)胞分散性更好。

(4)擬南芥管狀分子體外培養(yǎng)誘導(dǎo)率越高，越有利于后續(xù)研究工作的開(kāi)展。本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，首先以萌發(fā)后10～14天苗齡擬南芥幼苗整株切碎作為外植體，制備得到擬南芥愈傷組織，再對(duì)愈傷組織進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)愈傷組織增殖培養(yǎng)基和擴(kuò)繁培養(yǎng)條件的優(yōu)化，提高了愈傷組織擴(kuò)繁的質(zhì)量；再對(duì)擴(kuò)繁后的愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)懸浮培養(yǎng)基和懸浮培養(yǎng)條件的優(yōu)化，提高了愈傷組織懸浮培養(yǎng)的質(zhì)量；再將懸浮培養(yǎng)后的細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞篩進(jìn)行過(guò)濾，提高了細(xì)胞的分散性；將過(guò)濾后的單細(xì)胞培養(yǎng)系進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，在體外形成管狀分子。上述各工藝步驟是一個(gè)有機(jī)的整體，互為條件，有效簡(jiǎn)化了擬南芥管狀分子體外培養(yǎng)的流程，縮短了培養(yǎng)時(shí)間，并且提高了擬南芥管狀分子體外培養(yǎng)的誘導(dǎo)率，本發(fā)明的總體誘導(dǎo)率在37％～50％。需要說(shuō)明的是，擬南芥的體外培養(yǎng)誘導(dǎo)率是一個(gè)世界性的瓶頸問(wèn)題，采用本發(fā)明的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，可以使最常見(jiàn)的擬南芥哥倫比亞野生型達(dá)到特殊的細(xì)胞系培養(yǎng)才能獲得的誘導(dǎo)率，取得了意想不到的技術(shù)效果。

綜上，本發(fā)明的擬南芥管狀分子體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法，與現(xiàn)有的培養(yǎng)體系相比，在擬南芥材料上適用范圍更廣泛、取材更簡(jiǎn)易、培養(yǎng)時(shí)間縮短、獲得細(xì)胞分散性更好，降低誘導(dǎo)培養(yǎng)基中2，4-D使用濃度，節(jié)約成本，以無(wú)激素的MS液體基本培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，更利于對(duì)后期管狀分子分化過(guò)程中相關(guān)激素試劑的影響分析研究。

附圖說(shuō)明

圖1：實(shí)施例1中萌發(fā)后的擬南芥幼苗；

圖2：實(shí)施例1中擬南芥愈傷組織擴(kuò)繁后的形貌；

圖3：實(shí)施例1中擬南芥愈傷組織懸浮培養(yǎng)后的形貌；

圖4：實(shí)施例1中體外誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的管狀分子。

具體實(shí)施方式

結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。

本發(fā)明實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基，具體如下：

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在B5基本培養(yǎng)基中添加20g/L的蔗糖、0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，0.05mg/L的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)，6g/L的瓊脂，調(diào)節(jié)pH為5.8；配制后用121℃高壓濕熱滅菌20min。

愈傷組織增殖培養(yǎng)基：在MS基本培養(yǎng)基中添加30g/L的蔗糖、1mg/L的2,4-D，8g/L的瓊脂，調(diào)節(jié)pH為5.8；配制后用121℃高壓濕熱滅菌20min。

MS液體培養(yǎng)基：在MS基本培養(yǎng)基中添加30g/L的蔗糖，調(diào)節(jié)pH為5.8；配制后用121℃高壓濕熱滅菌20min。

擬南芥管狀分子體外誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基：在MS基本培養(yǎng)基中添加30g/L的蔗糖、6mg/L的NAA，1mg/L的6-BA，6μM的24-表油菜素內(nèi)酯(EBL)，調(diào)節(jié)pH為5.8。

實(shí)施例1：擬南芥哥倫比亞野生型株系管狀分子體外誘導(dǎo)

具體方法如下：

(1)無(wú)菌接種：挑選成熟飽滿(mǎn)的擬南芥哥倫比亞野生型種子，用2％次氯酸鈉滅菌20min，無(wú)菌水沖洗4次后，播種于MS基本培養(yǎng)基上。

(2)愈傷組織制備：將萌發(fā)后10天苗齡擬南芥幼苗(如圖1)整株切碎接入上述配制好的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，23℃暗培養(yǎng)，14天繼代一次，共誘導(dǎo)培養(yǎng)28天，獲得擬南芥愈傷組織。

(3)愈傷組織擴(kuò)繁：將誘導(dǎo)出的擬南芥愈傷組織轉(zhuǎn)入上述配制好的愈傷組織增殖培養(yǎng)基中，23℃暗培養(yǎng)，15天繼代一次，共培養(yǎng)30天，使擬南芥愈傷組織進(jìn)行快速增殖，結(jié)果如圖2所示。

(4)愈傷組織懸浮培養(yǎng)：將擴(kuò)繁后的擬南芥愈傷組織接種于MS液體培養(yǎng)基中，23℃，以180rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩，暗培養(yǎng)，2天繼代一次，共培養(yǎng)6天，獲得分散性良好的擬南芥愈傷組織懸浮培養(yǎng)系，結(jié)果如圖3所示。

(5)管狀分子體外誘導(dǎo)培養(yǎng)：將擬南芥愈傷組織懸浮培養(yǎng)系以200目細(xì)胞篩進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后的單細(xì)胞培養(yǎng)系轉(zhuǎn)入擬南芥管狀分子體外誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基中，23℃，以180rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩，暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)擬南芥愈傷組織單細(xì)胞進(jìn)行分化形成管狀分子，結(jié)果如圖4所示，總體誘導(dǎo)率為50％。整個(gè)培養(yǎng)周期為75天。

實(shí)施例2：擬南芥轉(zhuǎn)RABG3f-RFP基因株系管狀分子體外誘導(dǎo)

具體方法如下：

(1)無(wú)菌接種：挑選成熟飽滿(mǎn)的擬南芥轉(zhuǎn)RABG3f-RFP基因株系種子，用2％次氯酸鈉滅菌20min，無(wú)菌水沖洗4次后，播種于MS基本培養(yǎng)基上。

(2)愈傷組織制備：將萌發(fā)后12天苗齡擬南芥幼苗整株切碎接入上述配制好的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25℃暗培養(yǎng)，15天繼代一次，共誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，獲得擬南芥愈傷組織。

(3)愈傷組織擴(kuò)繁：將誘導(dǎo)出的擬南芥愈傷組織轉(zhuǎn)入上述配制好的愈傷組織增殖培養(yǎng)基中，25℃暗培養(yǎng)，15天繼代一次，共培養(yǎng)30天，使擬南芥愈傷組織進(jìn)行快速增殖。

(4)愈傷組織懸浮培養(yǎng)：將擴(kuò)繁后的擬南芥愈傷組織接種于MS液體培養(yǎng)基中，25℃，以180rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩，暗培養(yǎng)，2天繼代一次，共培養(yǎng)6天，獲得分散性良好的擬南芥愈傷組織懸浮培養(yǎng)系。

(5)管狀分子體外誘導(dǎo)培養(yǎng)：將擬南芥愈傷組織懸浮培養(yǎng)系以200目細(xì)胞篩進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后的單細(xì)胞培養(yǎng)系轉(zhuǎn)入擬南芥管狀分子體外誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基中，25℃，以180rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩，暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)擬南芥愈傷組織單細(xì)胞進(jìn)行分化形成管狀分子，總體誘導(dǎo)率在37％，整個(gè)培養(yǎng)周期為80天。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)的技術(shù)人員在本發(fā)明批露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。