專利名稱：一種具有抑菌活性的水稻脫水素蛋白質(zhì)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種具有抑菌活性的水稻脫水素蛋白質(zhì)及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗生素能夠抑制或殺傷病原微生物，其應(yīng)用對保障人類健康發(fā)揮了重要的作用。 然而，由于抗生素的過度使用，增加了細菌的耐藥性，導致抗生素的療效下降?？咕氖?生物中存在的具有抗菌活性的小分子多肽，它們是生物抵御病原微生物入侵的一道重要防 線。抗菌肽可以作用于病原菌的細胞膜，使膜去極化或者形成“孔洞”，造成細胞內(nèi)含物外流 或者肽分子進入細胞內(nèi)部與靶標作用，進而殺死細菌。由于抗菌肽可作用于細菌的多個位 點，所以不易引起細菌的抗性，并且抗菌譜寬。因此，抗菌肽有可能成為新的抗菌藥物。另 外，除臨床應(yīng)用外，抗菌肽的應(yīng)用領(lǐng)域還包括用于食品防腐劑、飼料添加劑、化妝品領(lǐng)域以 及提高植物抗病性等。第一個報道的抗菌肽是天蠶素(cecropins) (Boman et al, 1974)，隨后，蛙皮素 (Magainins)、蜂毒素(Melitins)、防御素(Defensins)等先后被發(fā)現(xiàn)(石強等，2000)。三十 多年來，人們鑒別獲得了上千個抗菌肽，所采用的主要篩選策略大致可分為如下幾種一是 基于分離技術(shù)的篩選策略；二是利用差異顯示技術(shù)篩選抗菌肽編碼基因；三是基于同源序 列篩選抗菌肽編碼基因；四是用生物信息學方法鑒別抗菌肽；五是高通量篩選鑒別抗菌肽 的策略(王海嬌等，2007)。2006年，成雄鷹等發(fā)展了一種簡便的高通量方法，該方法基于各 種cDNA表達文庫或人工合成的oligo表達文庫，將支持物(如微孔濾膜)放在含有合適抗 性的固體培養(yǎng)基上，表達文庫按一定的密度涂在支持物上，待菌落長到一定大小后，將支持 物轉(zhuǎn)到含有誘導物的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，然后染色；鑒別克隆或細胞的活性。如果誘導表達 產(chǎn)物對宿主有害，使宿主活性降低或死亡，則死體被染料染色后著色。脫水素(Dehydrin)最早由Close等人發(fā)現(xiàn)，這是一類可被外源ABA、干旱及鹽分誘 導的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)具有很強的親水性(Close et al，1989)。此后，人們陸續(xù)報道了不 同植物中的脫水素質(zhì)白質(zhì)。按Dure對逆激蛋白質(zhì)的分類，脫水素蛋白質(zhì)屬于LEA D-II家 族，分子量從9kD到200kD不等，其結(jié)構(gòu)中一般含有以下三個保守片段Y、K和S片段(Dure et al. 1993)。其中，K片段富含賴氨酸，為所有Dehydrin家族蛋白質(zhì)所共有，其保守序列 為EKKGIMDKIKEKLPG(Close et al. 1997)。但到目前為止，還沒有脫水素蛋白質(zhì)能夠抑制細 菌生長的報道。利用高通量篩選體系，本發(fā)明人從水稻、青蛙等表達文庫中鑒別獲得了幾十個對 大腸桿菌生長有抑制作用的克隆，與未誘導培養(yǎng)基中細胞的生長相情況比較，細胞生長程 度明顯下降。為了進一步驗證水稻脫水素蛋白質(zhì)的抑菌功能，本發(fā)明利用大腸桿菌體系表 達了脫水素蛋白質(zhì)及其片段，體外合成了脫水素蛋白質(zhì)的片段，并進行了水稻脫水素蛋白 質(zhì)的抑菌活性實驗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種有抑菌活性的水稻脫水素蛋白質(zhì)及應(yīng)用于抑菌實踐。本發(fā)明的第一個目的是提供一種具有抑菌活性的水稻脫水素蛋白質(zhì)(英文名稱 為Dehydrin)，來源于水稻(Oryzae Sativa L.)是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白 質(zhì)1)序列表中的 SEQ ID NO 1 ；2)將序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸殘基經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有抑菌活性的蛋白質(zhì)；3)序列表中的SEQ ID NO=I的15個氨基酸以上片段；上述具有抑菌活性的水稻脫水素蛋白質(zhì)(Dehydrin)的編碼基因，也屬于本發(fā)明 的保護范圍，其核苷酸序列符合下述特征之一1)序列表中SEQ ID No 2的核苷酸序列；2)與序列表中SEQ ID No 2的DNA序列有85%以上同源性，且編碼相同功能蛋白 質(zhì)的DNA序列；3)序列表中SEQ ID No 2的DNA序列中長于45bp的片段，且編碼相同功能蛋白 質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明的另一個目的是水稻脫水素蛋白質(zhì)在抑菌中的應(yīng)用。實驗證明，所述的水稻脫水素蛋白質(zhì)或其片段在細菌中表達后，其細菌裂解液或 純化蛋白質(zhì)能夠抑制短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、黃八疊球菌及金黃色葡萄球菌等革蘭 氏陽性細菌的生長，同時，體外合成的所述蛋白質(zhì)片段能夠抑制短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿 菌、黃八疊球菌及金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性細菌的生長。所以，該蛋白質(zhì)在細菌、真菌或植物中表達或純化的形式以及含有上述基因序列 的質(zhì)粒、菌株及轉(zhuǎn)基因植物也可應(yīng)用于對細菌生長的抑制。本發(fā)明的有益效果用篩選水稻cDNA表達文庫的方法，獲得了具有抑菌活性的脫水素(Dehydrin)克 隆，在細菌中表達Dehydrin蛋白質(zhì)，其裂解液對革蘭氏陽性菌具有抑菌活性；將Dehydrin 蛋白質(zhì)分段表達，表明De-K3片段對短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌、金黃色 葡萄球菌等有明顯的抑制效果；進一步體外合成了 Dehydrin片段，也證明具有抑菌活性。 將細菌、真菌或植物中表達的Dehydrin蛋白質(zhì)或片段摻入飼料、食品和化妝品中，可用于 對細菌的抑制；另外，將Dehydrin基因或片段轉(zhuǎn)入植物，使其編碼蛋白質(zhì)在特定生物逆境 誘導下表達，可提高植物對逆境的抵抗能力；


圖1是本發(fā)明所述的從水稻cDNA文庫中篩選獲得的RR46克隆的液體培養(yǎng)生長曲線。圖2是本發(fā)明所述的水稻脫水素蛋白質(zhì)的細菌裂解液的體外抑菌實驗結(jié)果。1為 誘導后的Dehydrin表達細菌的裂解液；2為誘導后的pET28a空載體表達細菌的裂解液；3 為未誘導Dehydrin表達的細菌裂解液；4為未誘導的pET28a空載體的細菌裂解液。圖3是本發(fā)明所述的De_K3片段裂解液的體外抑菌實驗結(jié)果。其中1為誘導后的De-K3表達細菌裂解液；2為誘導后的pET28a空載體的細菌裂解液；3為未誘導De_K3表達 的細菌裂解液；4為未誘導pET28a空載體的細菌裂解液；圖4是本發(fā)明所述的體外合成的Dehydrin片段的體外抑菌實驗結(jié)果。其中1、2、 3所用合成多肽的濃度分別為lmM、0. 5mM和0. 25mM。
具體實施例方式下述實施例中所用方法均為分子生物學實驗室所用的常規(guī)方法。生物材料、主要試劑和儀器水稻表達cDNA文庫(載體pBlueSCript，受體菌S0LR)，大腸桿菌菌株 BL21-DE3-pLysS ；表達載體pED8a，指示菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、 水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)均為本實驗室保存。細菌指示菌短小 芽孢桿菌(Bacillus pumilus,CVCC709)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis,CVCC717)、大 腸桿菌(Escherichia coli，CVCC1570)、藤黃八疊球菌(Sarcina lutea,CVCC1600)均購買 自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。DNA測序及Oligo合成由北京華大基因研究中心完 成，多肽合成由上海華大天源生物科技有限公司完成。IPTG購自北京賽百盛生物技術(shù)有限 公司；氨芐青霉素、卡那霉素購自上海生工；微孔濾膜購自北京升河膜生物技術(shù)公司；臺盼 藍(Typan Blue)和溴酚藍購自Sigma公司；限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；超聲破碎儀購 自寧波新芝生物科技股份有限公司。實施例1、脫水素克隆的獲得及細菌的生長曲線按Cheng等(Cheng et al,2009)的篩選方法，用來自水稻根的表達文庫進行篩 選，經(jīng)IPTG誘導后，挑選臺盼藍染色變藍的菌落，經(jīng)2輪誘導表達驗證后，選取35個克隆進 行了末端測序，測序結(jié)果進行BLASTX分析，發(fā)現(xiàn)有7個克隆編碼Dehydrin蛋白質(zhì)，其中4個 克隆為編碼SK3-Dehydrin蛋白質(zhì)的基因，它們的編號分別為RR46、RR51、RR142和RR306。取RR46克隆的過夜菌，按1 %比例接種IOOmL含有氨芐青霉素100 μ g/mL LB液 體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600值0. 1左右時，取出50mL加入IPTG (終濃度lmmol/L) 誘導，剩余的作為未誘導的對照，每Ih取樣一次測0D600，繪制RR46克隆菌的生長曲線，帶 pBluescript空載體的SOLR菌為負對照，從生長曲線可見，誘導后的陽性克隆生長明顯慢 于不誘導的菌株和對照菌株(圖1)。實施例2、脫水素基因的克隆及蛋白質(zhì)的表達以RR46質(zhì)粒DNA為模板，擴增獲得了 dehydrin基因，克隆到pET28a表達載體中 (翟從劼等2009)，將克隆的pET28a-Dehydrin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21_DE3-pLysS菌株 中，劃線挑取單菌落接種3mL含卡那霉素50 μ g/mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。 按1 %接種量轉(zhuǎn)接IOOmL含卡那霉素50 μ g/mL LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)至0D600 = 0. 6 0.8，取出50mL加入IPTG至終濃度lmmol/L，誘導池，其余細菌培養(yǎng)相同時間。離心，棄上 清，清洗菌體3次，每次15mL無菌水。再用5mL PBS緩沖液重懸，冰上超聲破碎(開/關(guān) =5S/5S) IOmin, 12000r/min，4°C離心lOmin，上清即為Dehydrin蛋白質(zhì)細菌裂解液。收集 250mL Dehydrin誘導表達菌，離心去上清，清洗3次，每次15mL無菌水，超聲破碎后12000r/ min，4°C離心lOmin，上清用Ni柱純化，收集蛋白質(zhì)含量較高的組分。實施例3、脫水素蛋白質(zhì)對細菌生長的抑制
用文件打孔器裁打直徑約0. 7cm圓形濾紙片，滅菌后烘干，鋪到新鮮制備的含有 待試菌的培養(yǎng)基表面，將20 μ L待測的液態(tài)蛋白質(zhì)加到濾紙上，37°C培養(yǎng)過夜，第二天觀察 抑菌圈并拍照，結(jié)果表明，細菌裂解液對短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌、金黃 色葡萄球菌有明顯的抑菌效果，但對大腸桿菌、水稻白葉枯病菌沒有可見的抑菌效果(圖 2)，純化的Dehydrin蛋白質(zhì)沒有抑菌活性(數(shù)據(jù)未附)。實施例4、脫水素蛋白質(zhì)片段的表達Dehydrin蛋白質(zhì)可分為二部分，為了確定負責抑菌活性的片段，進行了 Dehydrin 基因的亞克隆實驗。擴增De-S片段所用引物為，5 ‘ -GGAATTCCATATGGAGGATGAGAGGAACACGG -3'和 5 ‘ -CGGGATCCTTAGCCGTTGTCATCGATCACC-3 ‘.，擴增 De_K3 片段所用引物為 5 ‘ -GG AATTCCATATGGAGGTGATCGATGACAAC-3‘和 5' -CGGGATCC TTAAGCGCTGCTCTTGTGC-3‘，其中 下劃線為限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I的識別位點。PCR擴增后將產(chǎn)物克隆到pET28a載 體中，測序驗證后誘導表達二個片段蛋白質(zhì)。然后分別用它們的細菌裂解液和純化的蛋白 質(zhì)對上述指示菌進行抑菌實驗，結(jié)果表明，De-K3片段裂解液對短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿 菌、藤黃八疊球菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌效果(圖幻，而De-S片段裂解液、純化的 片段蛋白質(zhì)沒有可見的抑菌效果(數(shù)據(jù)未附)。實施例5、體外合成的脫水素蛋白質(zhì)的抑菌活性為了進一步驗證De_K3的抑菌效果，體外合成了 De_K3的片段，其序列為 KKKKGLKEKIKEKLPGHK，并進行了合成多肽的抑菌實驗，結(jié)果表明，三種濃度(lmM，0. 5mM和0.25mM)的多肽溶液對短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌效果，而對 藤黃八疊球菌沒有可見抑菌效果(圖4)。實施例6、多肽的最小抑制濃度(MIC)和最小殺死濃度(MBC)檢測采用培養(yǎng)基稀釋法檢測(Woong et al，2006)，在96孔中加入不同濃度的體外合成 多肽，然后加入105CFU/mL的指示菌，使多肽與細菌總體積為200 μ L。37°C培養(yǎng)1 后，觀 察96孔板各孔的混濁度，以肉眼不可見微生物生長的最低多肽濃度為最小抑制濃度MIC， 將上述肉眼看不到細菌生長的樣品取出，涂到LB平板上37°C培養(yǎng)12h，沒有細菌生長的最 低多肽濃度即為最小殺死濃度MBC，上述試驗至少重復三次。經(jīng)檢測，體外合成多肽對短小 芽孢桿菌的最小抑制濃度為130μ g/mL，最小殺死濃度為> 400μ g/mL。參考文獻· Boman HG, Nordstrom K, Normark S. Characteristics of an inducible cell-free antibacterial reaction in hemolymph of Samia cynthia pupae. Infect Immun,1974，10(1) :136-145. 石強劉飛鵬.抗菌肽克隆基因的表達和轉(zhuǎn)基因研究現(xiàn)狀.生物工程進展， 2000,20(1) :37-40.# Dure L. Response of plants to eel lular dehydration during environmental stress. Rockville :American Society Physiologists,1993. 91-103.· Cheng XY, Liu GZ, Ye GY, Wang HJ, Shen XJ, Wu KC, Xie JH, Altosaar1.Screening and cloning of antimicrobial DNA sequences using a vital staining method. Gene,2009，430 :132-139.參 Woong SJ, Hong KK, Ki YL, Sun AK, Yeon SH, In HL, Antifungal activityof synthetic peptide derived from halocidin, antimicrobial peptide from the tunicate, Halocynthia aurantium. Federation of European Biochemical Societies, 2006,580 :1490-1496. 王海嬌李莉云劉國振.抗菌肽的篩選策略及其應(yīng)用研究進展.生物技術(shù)通報 2007,5 :29-33.· Close TJ, Kortt AA, Chandler PM, A cDNA-based comparison of dehydration-induced proteins (dehydrins)in barley and corn.Plant Molecular Biology,1989，13 :95-108.# Close TJ. Dehydrins -.a commonalty in the response of plants to dehydration and low temperature. Physiol Plant, 1997,100 :291-296.# Close TJ. Dehydrins :emergence of a biochemical role of a family of plant dehydration proteins.Physiol Plant, 1996,97 :795-803.· Campos F, Zamudio F, Covarrubias AA. Two different late embryogenesis abundant proteins from Arabidopsis thaliana contain specific domains that inhibit Escherichia coli growth.Biochemical and Biophysical Research Communications,2006, 342 :406-413. 翟從劼王海嬌李莉云劉國振。水稻脫水素蛋白質(zhì)的體外表達及純化研究，植 物生理與分子生物學研究，2009, 206-209.序列表<110>河北農(nóng)業(yè)大學<120> 一種具有抑菌活性的水稻脫水素蛋白質(zhì)及應(yīng)用<130><160>2<170>PatentIn version 3.5<210>1<211>196<212>PRT<213>0ryza sativa<400>1Glu Val lie Asp AspAsnGlyGluValValLysArgLysLysLysLys1 51015Gly Leu Lys Glu LyslieLysGluLysLeuProGlyHisLysAspHis202530Ala Gly Glu His AlaProProProAlaAlaThrGlyPheProAlaPro354045Ala Pro Pro Ala SerValValThrAlaAlaProThrProAlaProAla505560Pro Val Val Thr HisGlyAspHisHisHisAspThrAlaValProVal65707580Glu Lys lie GluAla Pro Glu Glu 100 GlyLeu ProGly 115 AlaGly Asp His Ala Lys 85Glu Lys Lys His Lys LysGly Phe 105 GluPro Ala 130Pro Pro Ala ThrPro 120 ProPro 145 LysSer Pro Ala Ala 135Glu ValGly lie LeuGlu 150LysAla Ser lie Met GluGly Ser Gly Lys SerGlu 180 AlaGly 165Glu Asp Lys ThrSer 195<210>2<211>591<212>DNA<213>0ryza sativa <400>2Thr90LeuAspThrSerGluAspAlaThrPro 155 LeuAla 185Lys 170Ala AlaAlaLysThrPro 140 AspProAlaThr Leu lieAla 125 AlaGlyGlyThrLys 110 ValProLysTyrGly 190Pro95GluProAlaGluHis 175 GluArgLysProHisLys 160 LysHisgaggtgatcgatgacaacggcgaggtggtcaagaggaagaagaagaaggggctcaaggag60aagatcaaggagaagctgcccggccacaaggaccatgccggtgagcatgctcctccgccc120gcggcgacgggcttccccgcgccggctccgcctgcatccgtggtgacggccgcgcccacg180ccagctcctgctcccgtggtgactcacggcgatcaccaccacgacaccgccgtccccgtg240gagaagatcgagggtgatcacgccaagacggaggcgaccctgccacgtgcacccgaggag300gagaagaagggcttcctcgacaagatcaaggagaagctgcccggcggccacaagaagccg360gaagacgcaactgctgtgccgccgccggccgcctcaccggctgctcctgccactactccg420gcgccagcacacccaccgccggctacagaggaagtgagcagcccggatgg gaaggagaag480aagggtatactgggcaagatcatggagaaactgcccggttaccacaagggctccggcgag540gaagacaagaCCgCCgCCgCcgccaccggcgagcacaagagcagcgcttaa59權(quán)利要求
1.一種具有抑菌活性的水稻脫水素蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)具有下述氨基酸殘 基序列之一1)序列表中的SEQID NO 1 ；2)將序列表中SEQID NO 1的氨基酸殘基經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有抑菌活性的蛋白質(zhì)；3)序列表中的SEQID NO 1的15個氨基酸以上片段；
2.如權(quán)利要求1所述的具有抑菌活性的水稻脫水素蛋白質(zhì)的編碼基因，其特征在于其 具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID No 2的核苷酸序列；2)與序列表中SEQID No :2的DNA序列有85%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的 DNA序列；3)序列表中SEQID No 2的DNA序列中長于45bp的片段，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的 DNA序列。
3.表達權(quán)利要求1中的蛋白質(zhì)的細菌，其裂解液在抑制短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、 黃八疊球菌及金黃色葡萄球菌的用途。
4.表達權(quán)利要求1中的蛋白質(zhì)或多肽的細菌，其裂解液在抑制革蘭氏陽性細菌生長中 的用途。
5.體外合成的權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)或多肽片段，其在抑制革蘭氏陽性細菌生長中的用途。
6.含有權(quán)利要求2所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞系，其特征在于其應(yīng)用于植物對生物逆境的 抵抗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抑菌活性的水稻脫水素蛋白質(zhì)，該脫水素蛋白質(zhì)是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑菌活性的蛋白質(zhì)；3)序列表中的SEQ ID NO1的15個氨基酸以上片段；本發(fā)明體外表達的水稻脫水素蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段及體外合成的片段，均具有對特定革蘭氏陽性菌的抑菌活性，提取本發(fā)明公開的植物中的脫水素蛋白質(zhì)可用于對革蘭氏陽性菌的抑制，將本發(fā)明的水稻脫水素蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)入植物中可提高對生物逆境的抗性。
文檔編號A01P1/00GK102040656SQ200910075648
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月12日
發(fā)明者蘭金蘋, 劉麗娟, 劉國振, 成雄鷹, 李莉云, 翟從劼 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學