一種檢測免疫t細(xì)胞和b細(xì)胞中常見氨基酸的方法
【專利摘要】一種檢測免疫T細(xì)胞和B細(xì)胞中常見氨基酸的方法，其屬于生物化學(xué)分析檢測領(lǐng)域。該方法采用各取細(xì)胞樣品至EP管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液后，進(jìn)行脫蛋白處理，得到含有氨基酸的上清液Ⅰ。將上清液Ⅰ按照Waters AccQ?Tag方法衍生化反應(yīng)，得到衍生化產(chǎn)物Ⅱ，再利用LC/ESI?Q?TOF?MS對衍生化產(chǎn)物Ⅱ進(jìn)行分析和采集。該方法采用LC/ESI?Q?TOF?MS對免疫細(xì)胞內(nèi)常見氨基酸進(jìn)行檢測，操作簡便、靈敏度和專屬性高、結(jié)果準(zhǔn)確，彌補(bǔ)了該領(lǐng)域的空白。
【專利說明】
一種檢測免疫T細(xì)胞和B細(xì)胞中常見氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)分析檢測領(lǐng)域，涉及一種檢測免疫T細(xì)胞和B細(xì)胞中常見氨基 酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基酸是一類含有氨基和羧基的有機(jī)化合物，是構(gòu)成機(jī)體組織細(xì)胞的基本組成成 分，也是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位。人體缺乏氨基酸，將會(huì)導(dǎo)致生理功能異常，影響機(jī)體代謝 的正常進(jìn)行，導(dǎo)致疾病。因此，檢測復(fù)雜樣本中氨基酸的含量對臨床和科研等都具有重要意 義，但目前的檢測方法的應(yīng)用領(lǐng)域主要集中在血漿樣本，且檢測氨基酸數(shù)量相對較少。如專 利201410105963.8,公布了一種同時(shí)檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，采用高效液 相色譜法檢測人體血漿中可能出現(xiàn)的24種氨基酸;專利201510945747.9，公布了一種高通 量檢測人體血漿中多種氨基酸的質(zhì)譜方法，采用96孔板的樣品前處理方法，對17種氨基酸 進(jìn)行定性定量分析。
[0003] T細(xì)胞和B細(xì)胞由淋巴器官產(chǎn)生，是機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分。T細(xì)胞來源 于骨髓，外周血中占總淋巴細(xì)胞的60-80%，介導(dǎo)細(xì)胞免疫。B細(xì)胞由哺乳動(dòng)物骨髓或鳥類法 氏囊中淋巴樣前體細(xì)胞分化成熟而來，外周血中占總淋巴細(xì)胞的10-15%，介導(dǎo)體液免疫。氨 基酸是細(xì)胞正常代謝的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，T細(xì)胞和B細(xì)胞內(nèi)的氨基酸直接與其生長、發(fā)育、凋亡 及能量代謝有關(guān)，對細(xì)胞內(nèi)氨基酸的檢測分析可間接反應(yīng)T細(xì)胞和B細(xì)胞數(shù)量，提示機(jī)體的 免疫狀態(tài)。 同時(shí)，氨基酸是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的基本物質(zhì)，與免疫反應(yīng)的組織發(fā)生和免疫系統(tǒng)的 器官發(fā)育密切相關(guān)。某些氨基酸在調(diào)控免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵性作用。如精氨酸(Arg)[1]可通 過影響N0合成或直接刺激免疫細(xì)胞增殖來調(diào)控正常的免疫功能，在肝移植中，再灌注后lh 循環(huán)中精氨酸水平下降10倍，補(bǔ)充L_精氨酸可通過產(chǎn)生NO明顯減輕保存性損傷，而阻斷L-精氨酸/N0途徑明顯增加移植肝的細(xì)胞死亡和凋亡。甘氨酸(Gly) [2]具有免疫抑制效應(yīng)，Gly 可下調(diào)庫普弗細(xì)胞(KC)吞噬活性，減輕微血管損傷，Gly預(yù)處理可明顯保護(hù)移植肝的細(xì)胞活 力、防止細(xì)胞死亡和肝衰竭，從而增加肝移植的存活率。色氨酸(Trp) [3]是T細(xì)胞增殖所必需 的氨基酸，在免疫應(yīng)答中起重要作用。Trp的下游代謝產(chǎn)物喹啉酸對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 的合成是必需的，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸可提供細(xì)胞核修復(fù)酶的底物、增強(qiáng)細(xì)胞活力。因 此，對免疫T細(xì)胞和B細(xì)胞中的氨基酸進(jìn)行檢測分析，有助于評價(jià)機(jī)體的免疫狀態(tài)。
[0004] [1] Yagnik GP, Takahashi Y, Tsoulfas G, et al. Blockade of the L-arginine/N0 synthase pathway worsens hepatic apoptosis and liver transplant preservation injury. Hepatology, 2002，36: 573-581〇
[0005] [2] Rentsch M， Puellmann K， Sirek S， et al· Benefit of Kupffer cell modulation with glycine versus Kupffer cell depletion after liver transplantation in the rat: effects on postischemic reperfusion injury, apoptotic cell death graft regeneration and survival. Transpl Int, 2005，18: 1079-1089。
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種檢測免疫T細(xì)胞和B細(xì)胞中常見氨基酸的方法，該方法采用乙腈 沉淀蛋白的方法，對T細(xì)胞和B細(xì)胞中的氨基酸進(jìn)行富集，操作簡便、富集氨基酸種類豐富； 采用LC/ESI-Q-T0F-MS可檢測細(xì)胞中的28種氨基酸，專屬性高、結(jié)果準(zhǔn)確、檢測時(shí)間短，彌補(bǔ) 目前免疫T細(xì)胞和B細(xì)胞中氨基酸檢測方法的空白。
[0008] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種檢測免疫T細(xì)胞和B細(xì)胞中常見氨基酸的方法， 檢測方法步驟為： A.免疫T細(xì)胞和B細(xì)胞中氨基酸樣品的制備:各取細(xì)胞樣品至1.5mL EP管中，加入內(nèi)標(biāo) 溶液后，進(jìn)行沉淀蛋白處理，得到含有氨基酸的上清液I。
[0009] B.樣品衍生化反應(yīng):將上清液I按照Waters AccQ·Tag方法衍生化反應(yīng)，得到衍生 化產(chǎn)物Π 。
[0010] C.利用LC/ESI-Q-T0F-MS對衍生化產(chǎn)物Π 進(jìn)行分析和采集。
[0011] 步驟中A中沉淀蛋白的具體操作為加入500yL乙腈，渦旋20s，15000g/min離心 3min〇
[0012]步驟中A中內(nèi)標(biāo)溶液為ImM L-正纈氨酸(N-Val)溶液。
[0013] 步驟中C中液相分析條件為:柱溫:50°C，進(jìn)樣室溫度：10°C，流速:0.4 mL/min，進(jìn) 樣體積:5yL，流動(dòng)相A:水(含20 mM/L甲酸銨、0.5%甲酸和1%乙腈），流動(dòng)相B:乙腈(含1.6% 甲酸），梯度洗脫。所述梯度洗脫條件為O.Olmin時(shí)流動(dòng)相A/流動(dòng)相B的體積比為95/5,逐漸 改變梯度到15min變成流動(dòng)相A/流動(dòng)相B的體積比為60/40,進(jìn)一步改變梯度到17min變成流 動(dòng)相A/流動(dòng)相B的體積比為0/100,到20min變?yōu)榱鲃?dòng)相A/流動(dòng)相B的體積比為50/50,到 20.5min變?yōu)榱鲃?dòng)相A/流動(dòng)相B的體積比為90/10，到25min變回初始比例流動(dòng)相A/流動(dòng)相B 的體積比為95/5。
[0014] 步驟中C中質(zhì)譜條件分析條件為:離子源為ESI，檢測器為四級桿串聯(lián)飛行時(shí)間檢 測器。
[0015] 所述氨基酸為L-賴氨酸（Lys)、L-纈氨酸（Val)、L-蘇氨酸（Thr)、L-天冬氨酸 (Asp)、L-甲硫氨酸(Met)、L-脯氨酸(Pro)、γ -氨基丁酸（γ -GABA)、L-異亮氨酸（11 e)、L-酪 氨酸(Tyr)、L-組氨酸(His)、?；撬?Tau)、L-精氨酸(Arg)、L-谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、 L-高胱氨酸(Horn)、L-苯丙氨酸(Phe)、肌氨酸(Sar)、L-色氨酸(Trp)、L-瓜氨酸(Cit)、L-亮 氨酸（leu)、L_丙氨酸(Ala)、L_胱氨酸(Cys-Cys)、L_半胱氨酸(Cys)、L_絲氨酸(Ser)-丙 氨酸(6 -Ala)、L_胱硫醚(Cys-s)、L_正繳氨酸(N-Val)、亞磺酸(H-Tau)。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是:該方法采用各取細(xì)胞樣品至EP管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液后，進(jìn)行 脫蛋白處理，得到含有氨基酸的上清液I。采用乙腈進(jìn)行脫蛋白處理，富集得到的氨基酸種 類更豐富。將上清液I按照Waters AccQ，Tag方法衍生化反應(yīng)，得到衍生化產(chǎn)物Π ，再利用 LC/ESI-Q-T0F-MS對衍生化產(chǎn)物Π 進(jìn)行分析和采集。以濃度為0.4mM的含28種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn) 溶液，按照本發(fā)明所述處理方法進(jìn)行衍生化等處理并分別測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，得到該方法 的重復(fù)性好。并以濃度為0.4mM的含28種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本發(fā)明所述處理方法進(jìn)行 衍生化等處理并分別測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)三天進(jìn)樣分析，計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的RSD 值，得到該方法日間精密度高。該方法采用LC/ESI-Q-TOF-MS對免疫細(xì)胞內(nèi)常見氨基酸進(jìn)行 檢測分析，操作簡便、靈敏度和專屬性高、結(jié)果準(zhǔn)確，彌補(bǔ)了該領(lǐng)域的空白。
【附圖說明】
[0017] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0018] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例所述的含28種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的TIC色譜圖。
[0019]圖2是本發(fā)明實(shí)施例所述的含28種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的XIC色譜圖。
[0020] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例所述的檢測T細(xì)胞內(nèi)氨基酸的XIC色譜圖。
[0021] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例所述的檢測B細(xì)胞內(nèi)氨基酸的XIC色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] T細(xì)胞和B細(xì)胞中常見氨基酸的具體檢測方法如下： 1.氨基酸樣本的制備:分別采用以下兩種方法對T細(xì)胞和B細(xì)胞進(jìn)行蛋白沉淀和氨基酸 富集 方法1:取1X107個(gè)細(xì)胞樣品至1.5mL EP管中，依次加入10yL ImM N-Val溶液，500yL乙 臆，禍旋 20s，15000g/min 離心 3min; 方法2:取1\107個(gè)細(xì)胞樣品至1.5!111^?管中，依次加入1(^1^1111]\11^^1溶液，50(^1^甲 醇，禍旋 20s，15000g/min 離心 3min; 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(如下圖），方法1富集得到的氨基酸種類豐富，故選擇方法1作為細(xì)胞樣 本氨基酸富集的處理方法。
2 .氨基酸的衍生化：取離心后的上清液10yL，按照Waters AccQ· Tag方法衍生，所用 Waters AccQ·Tag衍生劑試劑盒可購買得到，衍生結(jié)果如下表。
[0024] Waters AccQ·Tag衍生劑試劑盒對28種氨基酸衍生后的質(zhì)荷比變化結(jié)果表

3.標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)液的配置： 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:精確稱取28種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)品，并用0. lmol/L鹽酸溶液稀釋，配制濃度 為10 mM的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水將儲(chǔ)備液稀釋，配制成含2 8種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度均為 0.4mM〇
[0025]內(nèi)標(biāo)溶液配制：將L-正纈氨酸(N-Val)儲(chǔ)備液，用水稀釋配成ImM的N-Val內(nèi)標(biāo)溶 液，然后將配制好的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液和N-Val內(nèi)標(biāo)溶液置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?[0026] 4.優(yōu)化質(zhì)譜條件：
5. 優(yōu)化液相條件：
色譜柱：Waters XBridge Peptide BEH C18, 3·5μηι，2.1X100mm 預(yù)柱：Phenomenex C18, 4 X 20mm 柱溫：50°C 進(jìn)樣室溫度：10 °C 流速:〇.4mL/min 進(jìn)樣體積:5yL 流動(dòng)相：A:水(含20 mM甲酸銨、0.5%甲酸和1%乙腈） B:乙腈(含1.6%甲酸）
6. 方法的重復(fù)性 取濃度為〇. 4mM的含28種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本發(fā)明所述處理方法進(jìn)行衍生化等 處理并分別測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的RSD值，結(jié)果見下表。
[0027]氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液峰面積和保留時(shí)間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

7.日間精密度 取濃度為〇. 4mM的含28種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本發(fā)明所述處理方法進(jìn)行衍生化等 處理并分別測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)三天進(jìn)樣分析，計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的RSD值，結(jié)果 見下表。
[0028]氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液峰面積和保留時(shí)間的日間精密度試驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例1 T細(xì)胞中氨基酸的測定 根據(jù)前述的細(xì)胞前處理方法，取IX 1〇7個(gè)Τ細(xì)胞樣品進(jìn)行蛋白沉淀和氨基酸富集，按照 優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件對Τ細(xì)胞中的氨基酸進(jìn)行分析，計(jì)算保留時(shí)間和峰面積如下表所示， XIC色譜圖如附圖3。
[0029] 實(shí)施例2 B細(xì)胞中氨基酸的測定 根據(jù)前述的細(xì)胞前處理方法，取IX 1〇7個(gè)B細(xì)胞樣品進(jìn)行蛋白沉淀和氨基酸富集，按照 優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件對B細(xì)胞中的氨基酸進(jìn)行分析，計(jì)算保留時(shí)間和峰面積如下表所示， XIC色譜圖如附圖4。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測免疫T細(xì)胞和B細(xì)胞中常見氨基酸的方法，其特征在于步驟如下： (1) 免疫T細(xì)胞和B細(xì)胞中氨基酸樣品的制備 取細(xì)胞樣品至EP管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液后，再加入乙腈、禍旋、離心進(jìn)行沉淀蛋白處理，得 到含有氨基酸的上清液I;所述內(nèi)標(biāo)溶液為ImM L-正纈氨酸溶液； (2) 樣品衍生化反應(yīng) 將上清液I按照Waters AccQ'Tag方法衍生化反應(yīng)，得到衍生化產(chǎn)物Π ; (3) 利用^：/^31-〇-1'0?-1^對衍生化產(chǎn)物11進(jìn)行分析和采集 液相分析條件為:柱溫:50°C，進(jìn)樣室溫度：10°C，流速:0.4mL/min，進(jìn)樣體積:5yL，流動(dòng) 相A:含20 mM/L甲酸銨、體積分?jǐn)?shù)0.5%甲酸和體積分?jǐn)?shù)1%乙腈的水，流動(dòng)相B:含體積分?jǐn)?shù) 1.6%甲酸的乙腈，梯度洗脫；質(zhì)譜條件分析條件為:離子源為ESI，檢測器為四級桿串聯(lián)飛行 時(shí)間檢測器。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測免疫T細(xì)胞和B細(xì)胞中常見氨基酸的方法，其特征在 于:所述氨基酸為L-賴氨酸、L-纈氨酸、L-蘇氨酸、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、γ-氨基丁酸、L-異亮氨酸、L-酪氨酸、L-組氨酸、牛磺酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-高胱 氨酸、L-苯丙氨酸、肌氨酸、L-色氨酸、L-瓜氨酸、L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨 酸、L-絲氨酸、β-丙氨酸、L-胱硫醚、L-正纈氨酸、亞磺酸中的一種或多種。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測免疫Τ細(xì)胞和Β細(xì)胞中常見氨基酸的方法，其特征在 于：所述梯度洗脫條件為O.Olmin時(shí)流動(dòng)相Α/流動(dòng)相Β的體積比為95/5,逐漸改變梯度到 15min變成流動(dòng)相A/流動(dòng)相B的體積比為60/40，進(jìn)一步改變梯度到17min變成流動(dòng)相A/流動(dòng) 相B的體積比為0/100,到20min變?yōu)榱鲃?dòng)相A/流動(dòng)相B的體積比為50/50,到20.5min變?yōu)榱?動(dòng)相A/流動(dòng)相B的體積比為90/10,到25min變回初始比例流動(dòng)相A/流動(dòng)相B的體積比為95/ 5〇
【文檔編號】G01N30/02GK106093226SQ201610380843
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】曹云峰, 趙福榮, 房中則, 高鵬, 葛廣波, 孫曉宇, 洪沫, 董軍, 劉明莉
【申請人】遼寧潤生康泰生物醫(yī)藥科技有限公司