湖泊水生植物中有機(jī)磷提取及組成分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種湖泊水生植物中有機(jī)磷提取方法，包括樣品采集、磷的基本組成測定、有機(jī)磷(Po)的提取、樣品測試預(yù)處理、液態(tài)核磁(31P?NMR)分析和計(jì)算步驟。本發(fā)明采用0.5mol/L NaOH+25mmol/L EDTA提取劑，水生植物粉末樣品與提取劑的固液比為1：60獲得最優(yōu)的Po提取效果；31P?NMR分析測試過程中，設(shè)置延遲時間(D1)為5s，掃描分析時間為15h可獲得較好的譜圖。本發(fā)明的水生植物Po的提取方法，總磷(TP)和Po的平均提取率分別在91.4％和88.1％以上，能準(zhǔn)確檢測出樣品中Po的具體種類和含量，準(zhǔn)確的反映湖泊中水生植物的Po的組成結(jié)構(gòu)特征。為研究湖泊水生植物中Po的生物地球化學(xué)特征及其在水華暴發(fā)中所起的貢獻(xiàn)提供科學(xué)依據(jù)。
【專利說明】
湖泊水生植物中有機(jī)磷提取及組成分析方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種有機(jī)磷的提取及組成分析方法，特別是一種湖泊水生植物中有機(jī) 磷提取及組成分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷是水生生態(tài)系統(tǒng)關(guān)鍵的限制性營養(yǎng)元素之一，是影響湖泊富營養(yǎng)化的重要因 素。外源輸入和內(nèi)源循環(huán)是導(dǎo)致湖泊水體磷大幅度增加的主要因素。近年來，包括生活污 水、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、土壤徑流等過程攜帶的外源磷輸入得到了一定的控制，湖泊內(nèi)源磷的釋放 成為引起湖泊水質(zhì)進(jìn)一步惡化的關(guān)鍵因素。沉積物釋放是湖泊內(nèi)源磷污染重要的來源之 一，但富營養(yǎng)化湖泊中廣泛存在的水生植物，其死亡腐爛分解后的產(chǎn)物可能是湖泊內(nèi)源磷 另一個重要的來源。例如，太湖是是中國第三大淡水湖，也是典型的富營養(yǎng)大型淺水湖泊， 位于30° 55' 40〃 ~31° 32' 58〃N，119° 52' 32〃 ~120° 36' 10〃E之間，水面面積為2250km2，湖泊 平均水深1.9m，最大水深2.6m。太湖東南部草型湖灣（東太湖)水體表面覆蓋著高達(dá)東太湖 總面積70%以上的水生植物，這些水生植物死亡腐爛后如果不及時收割，其腐解后的有機(jī) 物將會進(jìn)入水體，其中磷的釋放率遠(yuǎn)高于碳和氮，半個月內(nèi)磷的釋放量就可高達(dá)70%，這些 營養(yǎng)元素的釋放將會引起湖泊水體的二次污染，危害生態(tài)系統(tǒng)健康，進(jìn)而引起一系列環(huán)境 問題。近年來，由于人類活動強(qiáng)度的增加，太湖水質(zhì)不斷惡化，水化學(xué)環(huán)境也發(fā)生了重大的 變化。2007年5月，太湖北部梅梁灣發(fā)生大規(guī)模水華事件;2008年，太湖北部竺山灣和西部沿 岸湖區(qū)發(fā)生"黑水團(tuán)"事件;2009~2010年，監(jiān)測數(shù)據(jù)表明太湖水華暴發(fā)期間產(chǎn)生大量危害 動植物健康的藻毒素。因此，針對湖泊水生植物來源磷的研究十分重要。有機(jī)磷(Organic P，P。）是水生植物中磷的重要組成部分，例如滇池水生植物中的P?？梢哉嫉狡潴w內(nèi)總磷 (Total P，TP)的50%以上。另外，已有研究表明P。在水生生態(tài)系統(tǒng)的磷循環(huán)中扮演重要角 色，一些P。組分可通過酶水解轉(zhuǎn)化為生物可利用性活性磷酸鹽，進(jìn)而成為富營養(yǎng)化湖泊藍(lán) 藻水華持續(xù)暴發(fā)的重要磷源。
[0003] 由于分析測試方法的限制，對湖泊水生植物中P?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和形態(tài)等的研究還十分 有限，多數(shù)研究一般僅限于有機(jī)磷總量的分析。然而，自Newman [1]等將液相31P核磁共振 (31P-NMR)技術(shù)首次應(yīng)用土壤提取液中磷的分析，該分析方法很大程度上提高了我們對環(huán)境 樣品中P。組成結(jié)構(gòu)和特征的認(rèn)識。目前，該分析方法已成為表征環(huán)境中P。組成特征的強(qiáng)有力 工具，但是主要集中于土壤、沉積物及腐殖質(zhì)等物質(zhì)的研究。如文獻(xiàn)CN101339133A公開了一 種鈣質(zhì)沉積物有機(jī)磷的提取及組成分析方法，其特征是先采用偏酸性的乙二胺四乙酸溶液 對沉積物進(jìn)行沖洗并離心，再結(jié)合傳統(tǒng)提取方法NaOH加乙二胺四乙酸(EDTA)混合溶液對沉 積物進(jìn)行振蕩提取并離心，然后取部分NaOH+EDTA提取液用光譜儀測定總磷，將剩余提取液 進(jìn)行濃縮，最后用 31P核磁共振技術(shù)(31P_NMR)分析提取液中有機(jī)磷的組成。該發(fā)明公開的是 沉積物的提取方法，其缺點(diǎn)是提取率不高。CN104614331A公開了一種同時提取及分析水體 沉積物中有機(jī)磷和無機(jī)磷形態(tài)的方法解決現(xiàn)有磷形態(tài)提取法不能同時測定出水體沉積物 中有機(jī)磷和無機(jī)磷含量的問題。該發(fā)明的技術(shù)方案為:將水體沉積物樣品與第一提取液混 合、離心并過濾后，得到第一殘?jiān)偷谝涣滋崛∫?將第一殘?jiān)c第二提取液混合、離心并 過濾后，得到第二殘?jiān)偷诙滋崛∫?將第二殘?jiān)c第三提取液混合、振蕩、離心并過濾 后，得到第三殘?jiān)偷谌滋崛∫?將第三殘?jiān)c第四提取液混合、振蕩、離心并過濾后，得 到第四殘?jiān)偷谒牧滋崛∫?將第四殘?jiān)一笈c第五提取液混合、振蕩、離心并過濾，得 到第五磷提取液。該發(fā)明能準(zhǔn)確反映水體沉積物中各形態(tài)有機(jī)磷和無機(jī)磷含量。但關(guān)于湖 泊水生植物中有機(jī)磷提取及組成分析方法還鮮有報道，因此，對湖泊中的水生植物中有機(jī) 磷的提取及組分分析研究，這對探索湖泊水生植物P。在水華暴發(fā)過程中所做的貢獻(xiàn)以及湖 泊內(nèi)源磷循環(huán)及機(jī)理具有重要科學(xué)意義。
[0004] [1]Newman R,Tate K.Soil phosphorus characterization by 31P nuclear magnetic resonance[J].Communications in Soil Science&Plant Analysis,1980,11 (9):835-842.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種湖泊水生植物中有機(jī)磷提取及組成分析方法，優(yōu)化其 有機(jī)磷的提取方法和31p-nmr測定過程中的參數(shù)設(shè)置，并分析水生植物中磷的組成結(jié)構(gòu)特 征。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
[0007] -種湖泊水生植物中有機(jī)磷提取方法，包括以下步驟：
[0008] (1)樣品采集:采集湖泊水生植物全株，裝入密封袋冷藏保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行冷 凍干燥，冷干后充分研磨，過2_篩，得到水生植物粉末樣品，-20°C冷凍保存?zhèn)溆茫?br>[0009] (2)磷的基本組成測定:總磷TP、無機(jī)磷P4P有機(jī)磷P。的測定，
[0010] 取水生植物粉末樣品兩份，一份于馬弗爐中煅燒，樣品降至室溫后加入HC1振蕩， 咼心分尚后分析其中磷濃度，即TP含量；
[0011] 另一份樣品置于離心管中，加入HC1振蕩，離心后測定磷濃度，SPPi含量；
[0012]水生植物中P。的含量由TP和Pi相減得到；
[0013] (3)P。的提?。喝∷参锓勰悠芳尤胩崛?，室溫下振蕩、離心后，留取上清 液，冷凍干燥形成粉末樣品，冷凍保存?zhèn)溆茫?br>[0014] (4)樣品測試預(yù)處理:將步驟⑶得到的粉末樣品用NaOH溶解，離心，加入D20鎖定 信號；
[0015] (5)31P-NMR分析：采用BRUKER標(biāo)準(zhǔn)腔5mm BB0探頭，31P的共振頻率為161.98Hz，測 定溫度為20°C，譜峰寬度為5Hz，獲取時間AQ為0.21028，匪1?參數(shù)中延遲時間01的設(shè)置為58， 分析測試時間為15h;
[0016] (6)計(jì)算:通過步驟(5)中得到的波譜進(jìn)行積分及對各磷組分進(jìn)行定性分析，并根 據(jù)步驟(2)得到的TP含量計(jì)算水生植物中各磷組分的含量。
[0017]優(yōu)選的，所述TP的測定具體為:準(zhǔn)確稱取0.5g水生植物粉末樣品一份，3個平行樣， 于馬弗爐中450°C煅燒3h，降至室溫后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入20mL3.5mo 1/L HC1振蕩16h，離 心分離后，上清液用0.45wii濾膜過濾得提取液，利用5 %過硫酸鉀121°C消解30min，分析其 中磷濃度，即TP含量。
[0018]優(yōu)選的，所述Pi的測定具體為:準(zhǔn)確稱取0.5g水生植物粉末樣品一份，3個平行樣， 置于離心管中，加入20mLlmol/L HC1振蕩提取16h，離心分離后，上清液用0.45wii濾膜過濾 得提取液，測定磷濃度，即Pi含量。
[0019]優(yōu)選的，所述了?和?1采用磷鉬藍(lán)法進(jìn)行測定。
[0020] 優(yōu)選的，所述(3)P。的提取具體為:取水生植物粉末樣品0.5g加入提取劑，室溫下 振蕩提取16h，4°C條件下，8000Xg離心30min后留取上清液，冷凍干燥形成粉末樣品，冷凍 保存?zhèn)溆谩?br>[0021] 優(yōu)選的，所述步驟（4)中NaOH為0.6mL 10mol/LNa0H;所述離心為8000Xg離心 151^11;所述〇2〇為0.21111。
[0022] 優(yōu)選的，所述提取劑為〇.5mol/L Na0H+25mmol/L EDTA。
[0023] 優(yōu)選的，所述步驟(3)中，水生植物粉末樣品與提取劑的固液比為1:60。
[0024] 優(yōu)選的，所述水生植物為狐尾藻、蘆葦和輪葉黑藻。
[0025]分析得到，水生植物中磷由正磷酸鹽、單酯磷、二酯磷以及焦磷酸鹽組成，P。占 TP 的34.21%~53.36%，單酯磷為水生植物中P。重要組分，其平均含量占 P。的92%，易降解的 二酯磷在水生植物較少，占 TP的0~6.65%。
[0026] 本發(fā)明應(yīng)用不同的提取劑和固液比提取湖泊水生植物中P。，并進(jìn)一步采用液態(tài)核 磁共振(31P_NMR)技術(shù)分析其組成特征。在采用〇.5mol/L Na0H+25m mol/LEDTA提取劑，并控 制水生植物粉末樣品與提取劑的固液比為1:60可獲得最優(yōu)的P。提取效果;31P-NMR分析測試 過程中，設(shè)置延遲時間D1為5s，掃描分析時間為15h可獲得較好的譜圖，出峰效果好。本發(fā)明 的的提取方法，不論是針對水生植物中的總磷還是P。，本發(fā)明的提取率均具有很高的提取 率，TP和P。的平均提取率分別在91.4%和88.1 %以上，能準(zhǔn)確檢測出樣品中P。的具體種類和 含量，準(zhǔn)確的反映水體中水生植物P。的情況。為研究水體中P。的組成結(jié)構(gòu)特征及其生物地球 化學(xué)行為提供科學(xué)依據(jù)。
【附圖說明】
[0027] 圖1.本發(fā)明的提取方法對水生植物磷提取的31P-NMR圖譜。
[0028]圖2.湖泊水生植物TP與本發(fā)明NaOH+EDTA提取液TP關(guān)系。
[0029]其中，A廠狐尾藻，A2 -蘆葦，A3 -輪葉黑藻。
【具體實(shí)施方式】
[0030]湖泊水生植物中有機(jī)磷提取方法，包括以下步驟：
[0031 ] (1)樣品采集:采集水生植物全株，裝入密封袋冷藏保存，所采集的樣品冷凍干燥 后充分研磨，過2mm篩，得水生植物粉末樣品，4°C冷藏保存?zhèn)溆茫?br>[0032] (2)磷的基本組成測定:總磷TP、無機(jī)磷Pi和P。的測定，
[0033]準(zhǔn)確稱取0.5g水生植物粉末樣品兩份，每份3個平行樣，一份于馬弗爐中450°C煅 燒3h，降至室溫后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入20mL3.5mol/L HC1振蕩16h，離心分離后，上清液用 0.45M1濾膜過濾得提取液，利用5%過硫酸鉀121°C消解30min，分析其中磷濃度，即TP含量； [0034]另一份樣品置于離心管中，加入20mLlmol/L HC1振蕩提取16h，離心分離后，上清 液用0.45mi濾膜過濾得提取液，測定磷濃度，SPPi含量；
[0035]由TP和Pi相減獲得水生植物P。含量；
[0036] 采用磷鉬藍(lán)法在Agilent8453紫外分光光度計(jì)上測定TP和Pi;
[0037] (3)P。的提取:取水生植物粉末樣品0.5g加入提取劑，室溫下振蕩提取16h，4°C條 件下，8000 X g離心30min后留取上清液，冷凍干燥形成粉末樣品，冷凍保存?zhèn)溆茫?br>[0038] (4)樣品測試預(yù)處理:將步驟(3)得到的粉末樣品用0.6mL 10m〇l/LNa0H重新溶解， 以8000 X g離心15min，加入0 ? 2mL D20鎖定信號；
[0039] (5)31P-NMR分析:采用BRUKER標(biāo)準(zhǔn)腔5mm BB0探頭，31P的共振頻率為161.98Hz，測 定溫度為20°C，譜峰寬度為5Hz，AQ為0.21028，匪1?參數(shù)中延遲時間01的設(shè)置為58，分析測試 時間為15h;
[0040] (6)計(jì)算:通過步驟(5)中得到的波譜進(jìn)行積分及對各磷組分進(jìn)行定性分析，并根 據(jù)步驟(2)得到的TP含量計(jì)算水生植物中各磷組分的含量。
[0041] 提取劑組成和提取比例對P。提取率影響的研究。表1列出實(shí)施例1 -15的所采用的 提取劑和提取比例，按上述步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例1-6水生植物的平均提取率見表2,實(shí)施例 7-15水生植物的提取率見表3。表4為實(shí)施例14水生植物中各個磷組分的含量及占 TP的百分 比。
[0042] 表1.實(shí)施例1-15所采用的提取劑和提取比例
[0044] 表2.實(shí)施例1-6水生植物的平均提取率

[0046] 表3.實(shí)施例7-15水生植物磷的提取率
[0049] 從表2可知，實(shí)施例1-3采用1: 30提取比例，提取劑分別為0.1，0.25和0.5mol/L NaOH，TP提取率分別為41.79%，48.27 %和49.18%，P。提取率分別為34.38%，42.60 %和 47.62%。表明采用0.25mol/L和0.5mol/L NaOH作為提取劑，TP和P。提取率明顯高于 0?lmol/L〇
[0050] 實(shí)施例4-6采用1:60提取比例，提取劑分別為0.1，0.25，0.5mol/L NaOH，則TP提取 率分別高于1:30提取比例下的TP提取率，P。提取率也分別高于于1:30提取比例下的P。提取 率。尤其，實(shí)施例5-6的TP提取率明顯高于實(shí)施例2-3的TP提取率，實(shí)施例5-6的P。提取率明 顯高于實(shí)施例2-3的P。提取率。
[0051 ]另外，固液比為1:30的提取比例會導(dǎo)致提取液過于黏稠，固液分離效果差，當(dāng)提取 比例為1:70，1:100時，稀釋倍數(shù)過大導(dǎo)致樣品濃度過低，提取效果不好，而提取比例為1:60 時，提取液既能充分與樣品粉末融合又不會過于黏稠且易分離，提取率更高，這表明采用固 液比為1:60的提取比例更適合磷組分的提取。因此，湖泊水生植物P。的提取固液比例為1: 60 〇
[0052]另外，從表3可知，實(shí)施例7-9表明NaOH與EDTA作為提取劑對水生植物的TP和P。的 提取率明顯高于NaOH單獨(dú)作為提取劑對水生植物TP和P。的提取率。
[0053] 進(jìn)一步地，實(shí)施例10-15表明，當(dāng)提取劑為0.5mol/L Na0H+25mmol/L EDTA時，水體 中水生植物的TP和P。的提取率最高，分別高達(dá)91.4%和88.1 %。
[0054] 如圖1所示，采用本發(fā)明的提取方法，得到水生植物中磷組分的組成特征，表明水 生植物由正磷酸鹽、單酯磷、二酯磷以及焦磷酸鹽組成，其中，P。以單酯磷為主要組成部分。
[0055] 表4.實(shí)施例14水生植物中各個磷組分的含量(mg/kg)及占總磷的百分比（％ )
[0057] 從表4中可以得出，水生植物Pi占 TP的46.64%~65.79%，P。可達(dá)TP總量的34.21% ~53.36 %。其中，水生植物中單酯磷占 TP的31.05%~49.74%，平均含量占 P。的92%。因 此，單酯磷是水生植物中P。的主要組分。焦磷酸鹽占水生植物TP的0.91 %~2.08%。
[0058] 如圖2所示，采用本發(fā)明的方法對水生植物中TP和P。進(jìn)行提取，NaOH-EDTA提取液 中的TP和水生植物中的TP呈線性關(guān)系（R2 = 0.997，P〈0.01)。這表明本發(fā)明的提取方法結(jié) 合31P-NMR表征可以反映樣品的實(shí)際情況，進(jìn)而探討湖泊水生植物中P。的分布和變化規(guī)律。 NaOH-EDTA可提取植物樣品中TP的提取率可達(dá)82.9%至98.2 %，平均為91.4%。研究結(jié)果表 明本發(fā)明的方法所用提取液、提取比例以及適合的測試參數(shù)后，液態(tài)31P_NMR技術(shù)可以有效 且可靠的分析湖泊水生植物P。，對于后續(xù)研究富營養(yǎng)化湖泊水生植物P。的動力學(xué)過程和生 物可利用性有重要意義。
[0059]以上對本發(fā)明實(shí)施例所提供的湖泊水生植物中有機(jī)磷提取及組成分析方法，進(jìn)行 了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個例對本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例 的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員， 依據(jù)本發(fā)明的思想，在【具體實(shí)施方式】及應(yīng)用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi) 容不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種湖泊水生植物中有機(jī)磷提取方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 樣品采集:采集湖泊水生植物全株，裝入密封袋冷藏保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行冷凍干 燥，冷干后充分研磨，過2_篩，得到水生植物粉末樣品，-20°c冷凍保存?zhèn)溆茫? (2) 磷的基本組成測定:總磷TP、無機(jī)磷PjP有機(jī)磷P。的測定， 取水生植物粉末樣品兩份，一份于馬弗爐中煅燒，樣品降至室溫后加入HCl振蕩，離心 分離后分析其中磷濃度，即TP含量； 另一份樣品置于離心管中，加入HCl振蕩，離心后測定磷濃度，SPP1含量； 水生植物中P。的含量由TP和Pi相減得到； (3) P。的提取:取水生植物粉末樣品加入提取劑，室溫下振蕩、離心后，留取上清液，冷凍 干燥形成粉末樣品，冷凍保存?zhèn)溆茫? (4) 樣品測試預(yù)處理:將步驟(3)得到的粉末樣品用NaOH溶解，離心，加入D2O鎖定信號； (5) 31P-NMR分析:采用BRUKER標(biāo)準(zhǔn)腔5mm BBO探頭，31P的共振頻率為161.98Hz，測定溫度 為20°C，譜峰寬度為5Hz，獲取時間AQ為0.2102s，NMR參數(shù)中延遲時間Dl的設(shè)置為5s，分析測 試時間為15h; (6) 計(jì)算:通過步驟(5)中得到的波譜進(jìn)行積分及對各磷組分進(jìn)行定性分析，并根據(jù)步 驟(2)得到的TP含量計(jì)算水生植物中各磷組分的含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述TP的測定具體為:準(zhǔn)確稱取0.5g 水生植物粉末樣品一份，3個平行樣，于馬弗爐中450°C煅燒3h，降至室溫后轉(zhuǎn)移至離心管 中，加入20mL3.5mol/L HCl振蕩16h，離心分離后，上清液用0.45μπι濾膜過濾得提取液，利用 5 %過硫酸鉀121°C消解30min，分析其中磷濃度，即TP含量。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述P1的測定具體為:準(zhǔn)確稱取0.5g水 生植物粉末樣品一份，3個平行樣，置于離心管中，加入20mLlmol/L HCl振蕩提取16h，離心 分離后，上清液用0.45μπι濾膜過濾得提取液，測定磷濃度，SPP1含量。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述的提取方法，其特征在于，所述TP和?1采用磷鉬 藍(lán)法進(jìn)行測定。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(3)Ρ。的提取具體為:取水生 植物粉末樣品0.5g加入提取劑，室溫下振蕩提取16h，4°C條件下，8000 X g離心30min后留取 上清液，冷凍干燥形成粉末樣品，冷凍保存?zhèn)溆谩?. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(4)中NaOH為0.6mL IOmol/ LNaOH;所述離心為8000 X g離心15min;所述D2O為0.2ml。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或5或6所述的提取方法，其特征在于，所述提取劑為0.5mol/LNa0H+ 25mmol/L EDTA08. 根據(jù)權(quán)利要求1或5或6所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(3)中，水生植物粉末 樣品與提取劑的固液比為1:60。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述水生植物為狐尾藻、蘆葦和輪葉 黑藻。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，分析得到，水生植物中磷由正磷酸 鹽、單酯磷、二酯磷以及焦磷酸鹽組成，P。占 TP的34.21%~53.36%，單酯磷為水生植物中P。 重要組分，其平均含量占 P。的92%，易降解的二酯磷在水生植物較少，占 TP的0~6.65 %。
【文檔編號】G01N21/33GK105928964SQ201610289392
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月4日
【發(fā)明人】馮偉瑩, 吳豐昌, 朱元榮, 張琛
【申請人】中國環(huán)境科學(xué)研究院