一種快速檢測(cè)中藥材中黃曲霉素b1含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分析測(cè)試技術(shù)領(lǐng)域，涉及黃曲霉素B1的檢測(cè)方法，尤其是涉及一種快速檢測(cè)中藥材中黃曲霉素B1含量的方法。本發(fā)明所述方法包括以下步驟：改進(jìn)的QuEChERS法萃?。徊捎贸咝б合嗌V?三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)待測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)；黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制；黃曲霉素B1定性定量方法的建立。待測(cè)樣品經(jīng)QuEChERS萃取、超高效液相色譜?三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC?MS/MS)分析，采用外標(biāo)法，在電噴霧離子源電離和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式條件下進(jìn)行定量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法靈敏度高、穩(wěn)定性好，適用于大量樣品中黃曲霉素B1殘留的準(zhǔn)確快速檢測(cè)，適用于中藥材中黃曲霉素B1殘留的監(jiān)測(cè)。
【專利說明】
一種快速檢測(cè)中藥材中黃曲霉素 B1含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于分析測(cè)試技術(shù)領(lǐng)域，涉及黃曲霉素B1的檢測(cè)方法，尤其是涉及一種快 速檢測(cè)中藥材中黃曲霉素B1含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素(AF)是由真菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等在高溫潮濕環(huán)境下產(chǎn)生的一 類結(jié)構(gòu)相似的有毒次生代謝物，具有極強(qiáng)的致癌性、致畸性和致突變性，其主要作用于人類 和動(dòng)物的肝臟。已經(jīng)鑒定的黃曲霉毒素有多種，比較常見的有AFB1和AFB2，其中AFB1毒性最 強(qiáng)，在1977年就被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為一類致癌物，具有較大危害?！吨腥A人民共和國藥 典》(2015版)要求對(duì)部分中藥材如遠(yuǎn)志、大率、肉豆蔻、決明子、麥芽、陳皮、使君子、柏子仁、 胖大海。蓮子、桃仁、檳榔、酸率仁、薏該仁等必需開展AFB1檢測(cè)，并規(guī)定AFB1不得過5yg/kg。
[0003] 目前，黃曲霉毒素AFB1主要的檢測(cè)手段有酶標(biāo)儀法、液相色譜法氣質(zhì)聯(lián)用法和液 質(zhì)聯(lián)用法。其中，液相色譜法靈敏度達(dá)不到要求范圍內(nèi)，檢出限較高，熒光檢測(cè)，檢測(cè)過程復(fù) 雜。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)快速，但由于其使用的酶極不穩(wěn)定，導(dǎo)致假陽性率比較高，對(duì)定性和定 量都有顯著地影響。液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法可同時(shí)提供目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和分子結(jié)構(gòu) 信息，具有雜質(zhì)影響小，不需要衍生就能夠準(zhǔn)確對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性和定量。
[0004] QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)，是近年來國際上最新發(fā) 展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)，由美國農(nóng)業(yè)部Anastassiades教授 等于2003年開發(fā)的。QuEChERS步驟可歸納為：（1)樣品粉碎；（2)單一溶劑乙腈提取分離；（3) 加入MgS0 4等鹽類除水；（4)加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)等吸附劑除雜；（5)上清液進(jìn)行 LC-MS檢測(cè)。
[0005] 本發(fā)明采用優(yōu)化QuEChERS方法，主要包括：（1)樣品粉碎；（2)單一溶劑乙腈提取分 離；（3)加入MgS04等鹽類除水；（4)加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)等吸附劑除雜；（5)上清液 進(jìn)txLC -MS檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)中藥材中黃曲霉素 B1含量的方法。
[0007] 本發(fā)明所述的快速檢測(cè)中藥材中黃曲霉素B1含量的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)QuEChERS萃取:取5.00g中藥材樣品，粉碎研磨，得粒徑為0.02mm的樣品粉末， 加入1 OOmL錐形瓶中；容量瓶中配制50mL乙腈-水(體積比為90:10)溶液，加入到所述錐形瓶 中，350r/min震蕩25min，靜置沉淀，過濾，取上清液過凈化柱，濃縮過0.22μπι濾膜后待測(cè)；
[0009] (2)采用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)待測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)；
[0010] 色譜條件為：采用ACQUITY UPLC BEH C18(50mmX2.1mmX1.7ym)色譜柱；流動(dòng)相 為1 %甲酸水-乙腈（10:90，V/V);進(jìn)樣體積：10.0 yL;流速:0.3mL/min;柱溫45.0°C ;樣品室 溫度:25.9°C;
[0011]質(zhì)譜條件為:采用Waters XEVO TQD三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀；電噴霧離子源為正離 子模式(ESI + )，掃描方式選用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，毛細(xì)管電壓為3.5kV，離子源溫度設(shè)為152 °C，脫溶劑氣溫度為400°C，脫溶劑氣流量1000L/h，錐孔氣流速lL/h，霧化壓力0.6MPa，碰撞 氣流速為〇. 2mL/min;
[0012] 黃曲霉素AFB1的質(zhì)譜(MS/MS)參數(shù)設(shè)置:母離子:m/z 313.2;錐孔電壓50￥;碎片離 子l:m/z 213.1，碰撞電壓45V;碎片尚子2:m/z 269.2，碰撞電壓33￥;碎片尚子3:111/2 285.2，碰撞電壓22乂；
[0013] (3)黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取500ng黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品于25.00mL棕 色容量瓶中，用乙腈定容，配制成20ng/mL的儲(chǔ)備液，密封儲(chǔ)存于-4°C冰箱中備用；
[0014] (4)黃曲霉素B1定性定量方法的建立:取出黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀 釋成質(zhì)量濃度梯度為〇 .2、1.0、3.0、5.0、10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用步驟(2)所述方法進(jìn)行 測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制出黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線;從所 述標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中求出待測(cè)樣品中黃曲霉素B1的含量。
[0015] 本發(fā)明所述的快速檢測(cè)中藥材中黃曲霉素B1含量的方法的原理是：待測(cè)樣品經(jīng) QuEChERS萃取、超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS/MS)分析，采用外標(biāo)法，在 電噴霧離子源電離和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式條件下進(jìn)行定量測(cè)定。
[0016] 本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有的QuEChERS方法進(jìn)行了優(yōu)化，將原來的五步驟優(yōu)化為四個(gè)步驟，包 括：（1)樣品粉碎；（2)混合溶劑乙腈-水提取分離；（3)凈化柱除雜；（4)上清液進(jìn)行LC-MS檢 測(cè)。與傳統(tǒng)QuEChERS法相比，本發(fā)明采用乙腈-水混合溶劑提取，省略了MgS〇4除水的步驟， 節(jié)省了藥品、簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過程和節(jié)約了時(shí)間。
[0017] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法靈敏度高、穩(wěn)定性好，適用于大量樣品中黃曲霉素B1殘留的 準(zhǔn)確快速檢測(cè)，適用于中藥材中黃曲霉素B1殘留的監(jiān)測(cè)。
【附圖說明】
[0018] 圖1是不同提取溶液對(duì)提取效果的影響。圖中，A為乙腈-水（體積比75:25) ;B為 (90:10)乙腈-水(體積比90:10) ;C為純乙腈;D為純甲醇。
[0019] 圖2是不同提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響。
[0020] 圖3是不同提取方法對(duì)提取效果的影響。圖中，A: 250r/min搖床震蕩30min ; B : 350r/min搖床震蕩30min;C:450r/min搖床震蕩30min;D:超聲提取30min;E:渦旋5min后 350r/min 搖床震蕩 30min。
[0021] 圖4是不同流動(dòng)相下AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。
[0022]圖5是黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1:本發(fā)明所述的快速測(cè)定中藥材中黃曲霉素 B1含量的方法
[0024]本發(fā)明所述的快速測(cè)定方法適用于中藥材樣品中黃曲霉素 B1含量的快速檢測(cè)，該 方法包括以下步驟：
[0025] (1)QuEChERS萃取:取5 · 00g中藥材樣品，粉碎研磨，得粒徑為0 · 02mm的樣品粉末， 加入100mL錐形瓶中；容量瓶中配制50mL乙腈-水(體積比為90:10)溶液，加入到所述錐形瓶 中，350r/min震蕩25min，靜置沉淀，過濾，取上清液過凈化柱，濃縮過0.22μπι濾膜后待測(cè)；
[0026] (2)采用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)待測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)；
[0027] 色譜條件為：采用ACQUITY UPLC BEH C18(50mmX2.1mmX1.7ym)色譜柱；流動(dòng)相 為1 %甲酸水-乙腈（10:90，V/V);進(jìn)樣體積：10.0 yL;流速:0.3mL/min;柱溫45.0°C ;樣品室 溫度:25.9°C;
[0028] 質(zhì)譜條件為:采用Waters XEVO TQD三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀；電噴霧離子源為正離 子模式(ESI + )，掃描方式選用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，毛細(xì)管電壓為3.5kV，離子源溫度設(shè)為152 °C，脫溶劑氣溫度為400°C，脫溶劑氣流量1000L/h，錐孔氣流速lL/h，霧化壓力0.6MPa，碰撞 氣流速為〇. 2mL/min;
[0029] 黃曲霉素AFB1的質(zhì)譜(MS/MS)參數(shù)設(shè)置:母離子:m/z 313.2;錐孔電壓50￥;碎片離 子l:m/z 213.1，碰撞電壓45V;碎片尚子2:m/z 269.2，碰撞電壓33￥;碎片尚子3:111/2 285.2，碰撞電壓22乂；
[0030] (3)黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取500ng黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品于25.00mL棕 色容量瓶中，用乙腈定容，配制成20ng/mL的儲(chǔ)備液，密封儲(chǔ)存于-4°C冰箱中備用；
[0031] (4)黃曲霉素 B1定性定量方法的建立:取出黃曲霉素 B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀 釋成質(zhì)量濃度梯度為〇 .2、1.0、3.0、5.0、10.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用步驟(2)所述方法進(jìn)行 測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制出黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線;從所 述標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中求出待測(cè)樣品中黃曲霉素B1的含量。
[0032] 實(shí)施例2:QuEChERS萃取方法的改進(jìn)
[0033] 取樣品經(jīng)粉碎研磨后得粒徑為0.02mm粉末5.00g，加入100mL錐形瓶中，容量瓶中 配制50mL溶劑加入到錐形瓶中，提取，靜置沉淀，過濾之后取上清液過多功能凈化柱，去掉 樣品中脂肪、色素和基質(zhì)等其他檢測(cè)項(xiàng)目外的雜質(zhì)。
[0034] (1)提取溶劑選擇的優(yōu)化
[0035]分別選擇甲醇、乙腈、乙腈-水(75:25，￥/￥)以及乙腈-水(90:10，￥八)作為提取劑 考察對(duì)AFB1提取效果的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，乙腈-水(90 :10，V/V)的提取效果最 好，故本提取溶劑選擇。
[0036] (2)提取時(shí)間的優(yōu)化
[0037]以乙腈-水（90: 10，V/V)作為提取劑，以搖床震蕩提取作為提取方式，分別進(jìn)行 1〇11^11、2〇1^11、3〇1^11、4〇1^114個(gè)不同時(shí)間的震蕩提取，考察對(duì)4?81提取效果的影響，結(jié)果見 圖2。由圖2可知，隨著提取時(shí)間延長，提取率明顯增大，但當(dāng)超過30min時(shí)，提取效率反而下 降，為節(jié)約時(shí)間并達(dá)到最佳提取效果，選擇提取時(shí)間為30min。
[0038] (3)提取方式的優(yōu)化
[0039] 以乙腈-水(90:10，￥八〇作為提取劑，分別以25(^/1^11搖床震蕩3〇1^11、35(^/1^11搖 床震蕩30min、450r/min搖床震蕩30min、超聲波提取30min以及渦旋5min后350r/min搖床震 蕩30min五種不同提取方式考察對(duì)AFB1提取效果的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)提取方 式為350r/m搖床震蕩30min時(shí)，黃曲霉素AFB1提取效果最好，故提取方式選用350r/m搖床震 蕩30min。
[0040]實(shí)施例3:色譜流動(dòng)相配比優(yōu)化
[0041 ]使用體積為9:1的乙腈-水溶液作為溶劑對(duì)AFB1標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度為5.0ng/mL的標(biāo) 準(zhǔn)溶液，UPLC-MS/MS檢測(cè)，分別考察使用流動(dòng)相為70:30、80:20、90:10和100:0 %的乙腈-0.1 %甲酸水(V/V)，觀察黃曲霉素的總離子流色譜圖，結(jié)果見圖4。由圖4可知，使用90:10的 乙腈-0.1%甲酸水(V/V)作為色譜流動(dòng)相時(shí)，所得超高效液相色譜圖響應(yīng)值最高，峰型最明 顯，無出現(xiàn)的拖尾分叉等，故選用90:10的乙腈-0.1%甲酸水(V/V)作為色譜流動(dòng)相。
[0042]實(shí)施例4:線性范圍與檢出限實(shí)驗(yàn)
[0043]在優(yōu)化條件下，采用UPLC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，以峰面積為縱 坐標(biāo)Υ，繪制出黃曲霉素AFB1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果見圖5。如圖5所示，AFB1在0.2-10.0. ng/mL 濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與AFB1質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y = 2835.5x-1513.7，相關(guān)系數(shù)為0.9991，檢出限達(dá)到 0.06ng/mL，
[0044]實(shí)施例5:精密度實(shí)驗(yàn)
[0045]取質(zhì)量濃度為5ng/mL AFB1溶液在優(yōu)化條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果如表1所示，平均 回收率在97.5 %~99.0 %之間，說明該方法測(cè)得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高。而RSD為0.57 %，表明該方 法重現(xiàn)性好，精密度高。
[0046]表1:精密度測(cè)定結(jié)果(n = 5)
[0048] 實(shí)施例6:實(shí)際樣品測(cè)定
[0049]取中藥材樣品經(jīng)粉碎研磨后得粒徑為0.02mm粉末5. OOg，采用QuEChERS優(yōu)化條件 萃取，制備待測(cè)溶液，然后進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法向其中加入一定量的AFB1 后檢測(cè)。具體方法參見實(shí)施例1。測(cè)定結(jié)果見表2。
[0050]表2:實(shí)際樣品的測(cè)量結(jié)果以及加標(biāo)回收率(單位：％)
[0051]
[0052] 由表2可知方法的回收率為88.7 %~98.9 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1 %~0.6 %。因 此，本發(fā)明所述的快速測(cè)定方法適用于大量樣品中黃曲霉素B1殘留的準(zhǔn)確快速檢測(cè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速檢測(cè)中藥材中黃曲霉素 B1含量的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1 )QuEChERS萃取:取5. OOg中藥材樣品，粉碎研磨，得粒徑為0.02mm的樣品粉末，加入 100mL錐形瓶中；容量瓶中配制50mL乙腈-水(體積比為90:10)溶液，加入到所述錐形瓶中， 350r/min震蕩25min，靜置沉淀，過濾，取上清液過凈化柱，濃縮過0.22μπι濾膜后待測(cè)； (2) 采用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)待測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)； 色譜條件為:采用ACQUITY UPLC BEH C18(50_X2.1mmX1.7ym)色譜柱;流動(dòng)相為1% 甲酸水-乙腈（10:90，V/V);進(jìn)樣體積：10.0 yL;流速:0.3mL/min;柱溫45.0°C ;樣品室溫度： 25.9〇C； 質(zhì)譜條件為:采用Waters XEVO TQD三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀；電噴霧離子源為正離子模 式(ESI+)，掃描方式選用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，毛細(xì)管電壓為3.5kV，離子源溫度設(shè)為152°C，脫 溶劑氣溫度為400°C，脫溶劑氣流量1000L/h，錐孔氣流速lL/h，霧化壓力0.6MPa，碰撞氣流 速為 0.2mL/min; 黃曲霉素 AFB1的質(zhì)譜(MS/MS)參數(shù)設(shè)置:母離子:m/z 313.2;錐孔電壓50￥;碎片離子1: 111/2 213.1，碰撞電壓45￥;碎片離子2:111/2 269.2，碰撞電壓33￥;碎片離子3:111/2 285.2，碰 撞電壓22V; (3) 黃曲霉素 B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取500ng黃曲霉素 B1標(biāo)準(zhǔn)品于25.00mL棕色容 量瓶中，用乙腈定容，配制成20ng/mL的儲(chǔ)備液，密封儲(chǔ)存于-4°C冰箱中備用； (4) 黃曲霉素 B1定性定量方法的建立:取出黃曲霉素 B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋成 質(zhì)量濃度梯度為〇 .2、1.0、3.0、5.0、10.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用步驟(2)所述方法進(jìn)行測(cè) 定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制出黃曲霉素 B1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；從所述 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中求出待測(cè)樣品中黃曲霉素 B1的含量。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK105866295SQ201610411552
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月12日
【發(fā)明人】劉艷清, 汪洪武, 姚夙, 嚴(yán)子軍, 韋壽蓮, 羅梓賢
【申請(qǐng)人】肇慶學(xué)院