本發(fā)明涉及類器官熒光標(biāo)記，具體涉及一種類器官熒光標(biāo)記的裝置及其使用方法。

背景技術(shù)：

1、類器官作為一種體外三維生命系統(tǒng)，具有準(zhǔn)確復(fù)制器官內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能，為研究器官發(fā)生、生理病理過程以及藥物篩選提供了實(shí)驗(yàn)平臺。這項(xiàng)前沿技術(shù)極大地推動了科學(xué)研究的深度和廣度，為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域注入了新的活力。

2、類器官為3d體外模型，在培養(yǎng)時建立在水凝膠或基質(zhì)膠中，常規(guī)免疫熒光染料難以滲透膠體進(jìn)行熒光標(biāo)記?；诖耍壳耙验_發(fā)出幾種常用的方法來解決類器官熒光標(biāo)記的問題，分別采用切片后標(biāo)記、自然沉降或反復(fù)離心方式以達(dá)到標(biāo)記靶標(biāo)的目的。然而，切片法為2d層面標(biāo)記，無法還原3d成像結(jié)果；自然沉降法在棄掉廢液時有大量丟失懸浮狀態(tài)類器官的風(fēng)險，且標(biāo)記時需要保留部分液體，會稀釋染料從而降低標(biāo)記效果；反復(fù)離心法則會耗費(fèi)大量時間，在離心過程中也會造成類器官結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞。因此，需要開發(fā)產(chǎn)品使得類器官能夠固定在液面中，同時減少類器官破壞，且染料得以直接接觸類器官。

3、為此我們提供一種類器官熒光標(biāo)記的裝置及其使用方法解決上述問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種類器官熒光標(biāo)記的裝置及其使用方法，類器官能夠固定在液面中，同時減少類器官破壞，且染料得以直接接觸類器官，便于類器官免疫熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的一種類器官熒光標(biāo)記的裝置，包括：

3、上中下三層，上層和下層均為圓形環(huán)狀玻璃，中層為尼龍濾膜；

4、其中，下層的圓形環(huán)狀玻璃厚度大于上層的圓形環(huán)狀玻璃，且下層的圓形環(huán)狀玻璃一側(cè)開口。

5、作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，上層的圓形環(huán)狀玻璃中圓環(huán)內(nèi)側(cè)直徑10mm，圓環(huán)外側(cè)直徑18mm，圓環(huán)厚度0.2mm。

6、作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，中層的尼龍濾膜直徑18mm，膜孔徑41μm。

7、作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，下層的圓形環(huán)狀玻璃中圓環(huán)內(nèi)側(cè)直徑10mm，圓環(huán)外側(cè)直徑18mm，圓環(huán)的開口4mm，圓環(huán)厚度2mm。

8、作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，上層圓形環(huán)狀玻璃和下層圓形環(huán)狀玻璃的圓環(huán)設(shè)計(jì)給中間提供圓柱形通道，上下層的圓形環(huán)狀玻璃粘合固定中層的尼龍濾膜于中間的圓柱形通道。

9、本發(fā)明還公開了一種類器官熒光標(biāo)記的裝置的組裝工藝，包括以下步驟：

10、先將下層的圓形環(huán)狀玻璃平放于底層，再向下層的圓形環(huán)狀玻璃的上表面點(diǎn)上紫外光固化膠，隨后放置中間層的尼龍濾膜貼合于涂布了紫外光固化膠的下層的圓形環(huán)狀玻璃上表面，待尼龍薄膜充分貼合下層的圓形環(huán)狀玻璃，再向貼合在下層的圓形環(huán)狀玻璃圓環(huán)上的尼龍薄膜點(diǎn)上紫外光固化膠，隨后對準(zhǔn)下層圓形環(huán)狀玻璃圓環(huán)處，將上層的圓形環(huán)狀玻璃貼合于涂布紫外光固化膠的尼龍薄膜上，最后使用波長365-400nm的uv光照射10-30秒對膠進(jìn)行固化，完成類器官熒光標(biāo)記的裝置的組裝。

11、本發(fā)明還公開了一種類器官熒光標(biāo)記的裝置的使用方法，包括：

12、將類器官熒光標(biāo)記的裝置應(yīng)用于小鼠腸道類器官中，以類器官熒光標(biāo)記的裝置作為載體，實(shí)施類器官熒光標(biāo)記程序：

13、第一步：使用連續(xù)傳代3次以上的小鼠腸道類器官進(jìn)行試驗(yàn)，將腸道類器官培養(yǎng)至第7天，獲得發(fā)育成熟的具有較多出芽結(jié)構(gòu)的腸道類器官；

14、第二步：使用冰的pbs重懸類器官，290xg、4℃離心5分鐘以充分去除基質(zhì)膠，離心結(jié)束后棄掉上清；

15、第三步：使用100μl冰的pbs輕柔地重懸類器官，隨即將類器官懸液加載到類器官熒光標(biāo)記的裝置的尼龍網(wǎng)中央；

16、第四步：開始程序性熒光標(biāo)記類器官，所有的液體添加、移除程序均從12孔板側(cè)壁進(jìn)行，首先使用4%?pfa固定類器官30分鐘，固定結(jié)束之后，使用冰的pbs清洗3次；

17、清洗結(jié)束之后添加含有0.1%?triton?x-100的滲透液，滲透類器官5-10分鐘，滲透結(jié)束使用冰的pbs清洗3次；

18、添加含有10%山羊血清的pbs，室溫封閉類器官30分鐘；

19、棄掉封閉液，使用一抗4℃過夜孵育類器官；

20、第二天棄掉一抗，pbs室溫清洗3次，添加熒光二抗室溫孵育1小時；

21、二抗孵育結(jié)束后，棄掉二抗，使用pbs室溫清洗3次，添加dapi染料標(biāo)記細(xì)胞核，室溫孵育5分鐘；

22、棄掉dapi染液，pbs室溫清洗3次；

23、第五步：通過類器官熒光標(biāo)記的裝置完成類器官的熒光標(biāo)記，將裝置倒置于含有pbs的12孔板或共聚焦皿中，置于熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察、成像、采集。

24、作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，第二步中離心的同時將類器官熒光標(biāo)記的裝置正置于12孔板中，離心結(jié)束后不能觸及管底的類器官。

25、本發(fā)明的一種類器官熒光標(biāo)記的裝置及其使用方法，具備如下有益效果：

26、本發(fā)明的一種類器官熒光標(biāo)記的裝置及其使用方法，類器官能夠固定在液面中，同時減少類器官破壞，且染料得以直接接觸類器官，便于類器官免疫熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

27、使用明場成像加熒光成像相結(jié)合的方式，將成像圖進(jìn)行3d重構(gòu)并合并于一張圖中，尼龍薄膜和類器官裝置清晰可見，類器官附著于尼龍薄膜上，腸道類器官出芽結(jié)構(gòu)明顯，實(shí)現(xiàn)了絨毛蛋白villin良好成像。

28、參照后文的說明與附圖，詳細(xì)公開了本發(fā)明的特定實(shí)施方式，指明了本發(fā)明的原理可以被采用的方式，應(yīng)該理解，本發(fā)明的實(shí)施方式在范圍上并不因而受到限制，在所附權(quán)利要求的精神和條款的范圍內(nèi)，本發(fā)明的實(shí)施方式包括許多改變、修改和等同。

技術(shù)特征：

1.一種類器官熒光標(biāo)記的裝置，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種類器官熒光標(biāo)記的裝置，其特征在于：上層的圓形環(huán)狀玻璃中圓環(huán)內(nèi)側(cè)直徑10mm，圓環(huán)外側(cè)直徑18mm，圓環(huán)厚度0.2mm。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種類器官熒光標(biāo)記的裝置，其特征在于：中層的尼龍濾膜直徑18mm，膜孔徑41μm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種類器官熒光標(biāo)記的裝置，其特征在于：下層的圓形環(huán)狀玻璃中圓環(huán)內(nèi)側(cè)直徑10mm，圓環(huán)外側(cè)直徑18mm，圓環(huán)的開口4mm，圓環(huán)厚度2mm。

5.一種類器官熒光標(biāo)記的裝置的組裝工藝，其特征在于：應(yīng)用于權(quán)利要求1-4任一一項(xiàng)所述的類器官熒光標(biāo)記的裝置，還包括以下步驟：

6.一種類器官熒光標(biāo)記的裝置的使用方法，其特征在于：應(yīng)用于權(quán)利要求1-4任一一項(xiàng)所述的類器官熒光標(biāo)記的裝置，還包括：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種類器官熒光標(biāo)記的裝置的使用方法，其特征在于：第二步中離心的同時將類器官熒光標(biāo)記的裝置正置于12孔板中，離心結(jié)束后不能觸及管底的類器官。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種類器官熒光標(biāo)記的裝置及其使用方法，涉及類器官熒光標(biāo)記領(lǐng)域，包括上中下三層，上層和下層均為圓形環(huán)狀玻璃，中層為尼龍濾膜，下層的圓形環(huán)狀玻璃厚度大于上層的圓形環(huán)狀玻璃，且下層的圓形環(huán)狀玻璃一側(cè)開口：類器官能夠固定在液面中，同時減少類器官破壞，且染料得以直接接觸類器官，便于類器官免疫熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，使用明場成像加熒光成像相結(jié)合的方式，將成像圖進(jìn)行3D重構(gòu)并合并于一張圖中，尼龍薄膜和類器官結(jié)構(gòu)清晰可見，類器官附著于尼龍薄膜上，腸道類器官出芽結(jié)構(gòu)明顯，實(shí)現(xiàn)了絨毛蛋白Villin良好成像。

技術(shù)研發(fā)人員：譚金龍,劉垠鞠,李瑤
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21