一種蛇床子中主要成分含量測定的hplc方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蛇床子藥材中花椒毒素、異虎耳草素、歐前胡素和蛇床子素含量測定方法，包括：分別制備花椒毒素對照品溶液、異虎耳草素對照品溶液、歐前胡素對照品溶液、蛇床子素對照品溶液和制備蛇床子提取物供試品溶液。色譜柱：Agilent-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈—磷酸緩沖鹽溶液（pH=3.5），梯度洗脫；檢測溫度：40℃；流速：1.0ml/min；檢測器：紫外檢測器；分別在250nm和324nm波長下測定對照品溶液和供試品溶液并記錄色譜圖。該方法具有檢測靈敏度高，準確可靠，分離效果好，分析簡便快捷等技術(shù)特點。
【專利說明】一種蛇床子中主要成分含量測定的HPLC方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥藥材領(lǐng)域，具體涉及一種蛇床子中主要成分含量測定的HPLC方法。
[0002]蛇床子為傘形科植物蛇床(Cnidium monnieri L.Cuss.)的干燥成熟果實，具有溫腎壯陽、祛風(fēng)、散寒、燥濕、殺蟲、止癢功效，用于濕痹腰痛，帶下，陰癢，陰道滴蟲病，皮膚瘙癢，濕疫，宮冷不孕。蛇床子果實中主要含花椒毒素(xanthotoxin)、異虎耳草素(isopimpinellin)、歐前胡素(imperatorin)和蛇床子素(osthole)等具有生物活性的香豆素類化合物，結(jié)構(gòu)式見附圖1-4?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蛇床子中香豆素類成分具有抗骨質(zhì)疏松，抗心律失常，擴張血管、降低血壓的作用，免疫抑制作用和抗腫瘤等方面均有作用。臨床上蛇床子素軟膏治療嬰兒濕疹，起效快、不良反應(yīng)少。此外，蛇床子素還具有鎮(zhèn)痛、局部麻醉和免疫調(diào)節(jié)等作用。有關(guān)蛇床子素含量測定的相關(guān)報道很多，《中國藥典》2000版一部采用薄層色譜熒光掃描法測定蛇床子藥材中蛇床子素的含量；孟凡浩，李遇伯，楊正毅等人，HPLC法同時測定蛇床子中蛇床子素和歐前胡素含量測定-沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2004,21，(5);羅維早，譚瑤，陽勇在專利申請?zhí)?01010527673.4專利中研究一種從中藥蛇床子中提取蛇床子素的方法；連其深發(fā)表的蛇床子的化學(xué)成分及藥理作用研究進展-中藥材，2003，26 (2);翁德新，李天傲等關(guān)于蛇床子中5種成分的HPLC測定法-中國中藥雜志，2007,32 (18)中對蛇床子中花椒毒素、異虎耳草素、香柑內(nèi)酯、歐前胡素和蛇床子素這5種成分進行同時測定，但該文獻中采用乙腈-0.1%的醋酸水溶液作為系統(tǒng)檢測的流動相，進行梯度洗脫時，檢測靈敏度低，分離效果差，存在一定的缺陷。而本發(fā)明中，采用HPLC法同時對蛇床子中的花椒毒素、異虎耳草素、歐前胡素和蛇床子素這4種香豆素類成分進行測定，采用乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH=3.5)作為系統(tǒng)檢測的流動相，進行梯度洗脫，檢測靈敏度高，4種香豆素類成分分離效果好，分析方法簡便快捷，易于操作，重現(xiàn)性好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種蛇床子中主要成分含量測定的HPLC方法，所述測定方法采用HPLC法在雙波長下對蛇床子提取物中花椒毒素、異虎耳草素、歐前胡素和蛇床子素4種香豆素類成分進行同時測定，方法操作簡便快捷、分離效果好、靈敏度高。為達上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
一種蛇床子提取物中主要成分含量測定的HPLC方法，其特征在于包括下述步驟:
1)本發(fā)明以60-75%的乙醇作為溶劑，優(yōu)選75%的乙醇為提取溶劑，從中藥材蛇床子中提取主要成分；
2)分別制備花椒毒素對照品(四川維克奇生物科技有限公司購買)溶液、異虎耳草素對照品(上海一基生物技術(shù)有限公司購買)溶液、歐前胡素對照品(中國藥檢所，批號110826-201214)溶液、蛇床子素對照品(中國藥檢所，批號110822-200407)溶液和制備蛇床子提取物供試品溶液；
3)利用HPLC法在雙波長下同時檢測蛇床子提取物中花椒毒素、異虎耳草素、歐前胡素和蛇床子素的含量；
色譜條件為:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充物，以乙腈為流動相A，磷酸緩沖鹽溶液(pH=3.5)為流動相B，梯度洗脫程序為:時間O — 5min — 20min — 40min — 55min ;溶液A:95% — 95% — 65% — 0% — 95% ;溶液 B:5% — 5% — 35% — 100% — 5% ;柱溫 25°C "40°C ;體積流量0.8^1.5ml/min ;檢測波長為250nm和324nm，進樣量Ιμ1~ 15μ1 ;理論塔板數(shù)按蛇床子素峰計算不得低于3000 ；
4)根據(jù)高效液相色譜分析結(jié)果計算蛇床子提取物中花椒毒素、異虎耳草素、歐前胡素和蛇床子素的含量。
[0004]進一步地，本發(fā)明HPLC方法的色譜條件為:色譜柱為Agilent_C18 (250mmX 4.6mm，5Mm)，流動相為乙腈(A) —磷酸緩沖鹽溶液(ρΗ=3.5) (B)，梯度洗脫程序為:時間 O — 5min — 20min — 40min — 55min ;溶液 A:95% — 95% — 65% — 0% — 95% ;溶液 B:5% — 5% — 35% — 100% — 5% ;柱溫 40°C ;體積流量 1.0ml/min ;檢測波長為 250nm 和324nm ;進樣量 10μ1。
[0005]進一步地，本發(fā)明HPLC分析方法中，花椒毒素對照品、異虎耳草素對照品、歐前胡素對照品和蛇床子素對照品溶液制備方法包括:分別取花椒毒素對照品、異虎耳草素對照品、歐前胡素對照品和蛇床子素對照品適量，精密稱定，加甲醇適量，分別配置成濃度為50、50、800和200(^g/ml的對照品溶液。
[0006]進一步地，本發(fā)明HPLC分析方法中，蛇床子提取物供試品溶液制備方法包括:取蛇床子藥材粉末約10g，精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中，精密量取60-75%的乙醇50ml，密塞，稱重，搖勻，超聲波提取3(T40min，放冷，濾過，收集濾液，同法操作2次，合并濾液，置100mL容量瓶中，再用60-75%的乙醇定容，搖勻，微孔濾膜(0.45Mm)濾過，即得。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1為花椒毒素 圖2異虎耳草素 圖3歐前胡素 圖4蛇床子素的結(jié)構(gòu)式
圖5為本發(fā)明蛇床子提取物中主要成分含量測定的HPLC檢測圖譜(1-花椒毒素，2-異虎耳草素，3-歐前胡素，4-蛇床子素)。
【具體實施方式】
[0008]在下面的實施例中進一步說明本發(fā)明的詳細分析方法，但本發(fā)明并不局限于下述詳細分析方法。
[0009]實施例1蛇床子提取物的制備
取蛇床子藥材粉末約10g，精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中，精密量取60-75%的乙醇50ml，密塞，稱重，搖勻，超聲波提取3(T40min，放冷，濾過，收集濾液，同法操作2次，合并濾液，置100mL容量瓶中，再用60-75%的乙醇定容，搖勻，微孔濾膜(0.45Mm)濾過，即得。
[0010]實施例2篩選蛇床子提取物中花椒毒素、異虎耳草素、歐前胡素和蛇床子素含量測定的條件。[0011]蛇床子提取物的制備:按照實施例1所述的方法制備
色譜條件的篩選:采用美國Agilent-1260高效液相色譜儀，Chemstation Edition色
譜工作站
色譜柱的選擇:依次考察 Thermo C18 柱、Kromasil C18 柱、Phenomenex Luna C18 柱、Agilent C18柱,結(jié)果經(jīng)試驗比較，Agilent C18 ( 250mmX4.6mm，5Mm)分離效果最佳。
[0012]流動相:分別考察了乙腈一水、乙腈一0.1%醋酸水溶液、甲醇一水、乙腈一磷酸鹽緩沖液(pH=3.5)、甲醇一乙腈-磷酸鹽溶液等流動相系統(tǒng)，結(jié)果經(jīng)試驗比較，優(yōu)選乙腈一磷酸鹽緩沖液(pH=3.5)梯度洗脫完成以上四種成分的含量測定，結(jié)果見附圖5。
[0013]檢測溫度:考察了25°〇、351:、401:不同柱溫，以及0.8、1.0、1.2、1.51111/1^11不同流速對各成分分離效果的影響，經(jīng)過試驗比較，優(yōu)選柱溫40°C,流速1.0ml/min時分離效果最佳。
[0014]檢測器:選用全波長掃描，對花椒毒素、異虎耳草素、歐前胡素和蛇床子素對照品溶液全波長紫外掃描(19(T400nm)，結(jié)果測得幾種成分的最大吸收波長不等，例如，蛇床子素在210和324nm處有最大吸收，異虎耳草素在245nm、330nm處有最大吸收，歐前胡素在220、250、304nm處有最大吸收。為了同時進行幾種成分的含量測定，選擇最佳檢測波長，采用二極管陣列檢測器進行多波長檢測，分別使其在最大吸收波長附近進行檢測。
[0015]真空泵:SHB-m循環(huán)水式真空泵
電子天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司提供，規(guī)格為十萬分之一提取溶劑的篩選:分別考察了不同濃度的甲醇和乙醇，其中甲醇提取色譜柱峰型不好，不計算含量，無水乙醇、60%乙醇、75%乙醇提取含量比較結(jié)果見表1，結(jié)果表明75%乙醇最佳。
[0016]表1不同溶劑提取含量比較
【權(quán)利要求】
1.一種蛇床子藥材中主要成分含量測定的高效液相色譜(HPLC)方法，其特征在于以60-75%的乙醇作為溶劑，從中藥材蛇床子中提取主要成分，分別制備花椒毒素對照品溶液、異虎耳草素對照品溶液、歐前胡素對照品溶液、蛇床子素對照品溶液和制備蛇床子提取物供試品溶液；利用HPLC法在雙波長下同時檢測蛇床子提取物中花椒毒素、異虎耳草素、歐前胡素和蛇床子素的含量； 色譜條件為:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充物，以乙腈為流動相Α，磷酸緩沖鹽溶液(ρΗ=3.5)為流動相B，梯度洗脫程序為:時間O → 5min → 20min → 40min → 55min ;溶液A:95% →95% →65% → 0% → 95% ;溶液 B:5% → 5% → 35% → 100% → 5% ;柱溫 25°C "40°C ;體積流量0.8^1.5ml/min ;檢測波長為250nm和324nm，進樣量1μ1~ 15μ1 ;理論塔板數(shù)按蛇床子素峰計算不得低于3000 ； 對照品溶液的制備:分別取花椒毒素對照品、異虎耳草素對照品、歐前胡素對照品和蛇床子素對照品適量，精密稱定，加甲醇適量，分別配置成濃度為50、50、800、200(^g/ml的對照品溶液； 供試品溶液的制備:取蛇床子藥材粉末約10g，精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中，精密量取60-75%的乙醇50ml，密塞，稱重，搖勻，超聲波提取3(T40min，放冷，濾過，收集濾液，同法操作2次，合并濾液，置100mL容量瓶中，再用60-75%的乙醇定容，搖勻，微孔濾膜(0.45Mm)濾過，即得； 測定法:分別精密量取對照品溶液和供試品溶液各10μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定，即得。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于以60-75%的乙醇為溶劑制備蛇床子提取物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于優(yōu)選75%的乙醇為溶劑制備蛇床子提取物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述色譜條件:色譜柱為Agilent-ClS(250mmX 4.6mm，5Mm)，流動相為乙腈(A) —磷酸緩沖鹽溶液(ρΗ=3.5) (B)，梯度洗脫程序為:時間 O → 5min → 20min → 40min → 55min ;溶液 A:95% → 95% → 65%→ 0% →95% ;溶液 B:5% → 5% → 35% → 100% → 5% ;柱溫 25°C "40°C ;體積流量 0.8~1.5ml/min ;檢測波長為 250nm 和 324nm，進樣量 ?μL~15μ1。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述花椒毒素對照品、異虎耳草素對照品、歐前胡素對照品和蛇床子素對照品溶液制備方法包括:分別取花椒毒素對照品、異虎耳草素對照品、歐前胡素對照品和蛇床子素對照品適量，精密稱定，加甲醇適量，分別配置成濃度為50、50、800和200(^g/ml的對照品溶液。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于蛇床子提取物供試品溶液制備方法包括:取蛇床子藥材粉末約10g，精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中，精密量取60-75%的乙醇50ml，密塞，稱重，搖勻，超聲波提取3(T40min，放冷，濾過，收集濾液，同法操作2次，合并濾液，置100mL容量瓶中，再用60-75%的乙醇定容，搖勻，微孔濾膜(0.45Mm)濾過，即得。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于根據(jù)HPLC分析結(jié)果計算蛇床子提取物中花椒毒素、異虎耳草素、歐前胡素和蛇床子素的含量。
【文檔編號】G01N30/02GK103884791SQ201410116055
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】彭學(xué)東, 張梅, 趙金召, 楊艷麗 申請人:張家港威勝生物醫(yī)藥有限公司