一種提取食品中丙烯酰胺的預(yù)處理方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種提取食品中丙烯酰胺的預(yù)處理方法。本發(fā)明以高油脂食品為檢測目標(biāo)，通過脫脂、提取、萃取、旋蒸以及復(fù)溶過濾等前處理操作，盡可能除去體系中的雜質(zhì)。采用本發(fā)明的預(yù)處理方法，省去SPE純化的操作，簡化純化過程；省去Carrez澄清劑的使用，避免對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾；以CaCl2溶液為提取劑，能夠避免乙酸乙酯萃取過程中的乳化現(xiàn)象，同時(shí)溶液中的Ca2+能夠與溶液中的蛋白發(fā)生作用形成鈣橋，可以避免溶液中蛋白對結(jié)果的影響。經(jīng)過預(yù)處理后，再進(jìn)行LC-MS/MS檢測，排除檢測中雜質(zhì)的干擾，使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確、更可靠。
【專利說明】一種提取食品中丙烯酰胺的預(yù)處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提取食品中丙烯酰胺的預(yù)處理方法，屬于食品科學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]丙烯酰胺是一種化工原料，廣泛應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)中，主要用來生產(chǎn)聚丙烯酰胺。2002年瑞典國家食品監(jiān)督管理局聯(lián)合斯德哥爾摩大學(xué)在高溫加工的食品中檢測出較高含量的丙烯酰胺，這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了世界范圍的關(guān)注，各個(gè)國家相繼投入到高溫加工的食品中丙烯酰胺檢測以及含量控制的研究中。
[0003]丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，而且在動(dòng)物試驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)其具有基因毒性以及致癌性，但是人類日常膳食中攝入的丙烯酰胺對人體健康的影響尚不明確。1994年國際癌癥組織已經(jīng)將丙烯酰胺確定為一種對人類“可能的致癌物質(zhì)”。高溫加工食品中丙烯酰胺的發(fā)現(xiàn)引發(fā)了各國對丙烯酰胺危害的進(jìn)一步關(guān)注。
[0004]食品中丙烯酰胺的來源主要集中在高溫加工的過程中，食品中天冬氨酸以及還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)從而間接產(chǎn)生丙烯酰胺。同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)也證明，丙烯酰胺的碳骨架來源于天冬氨酸，而且食品中丙烯酰胺的含量與其中天冬氨酸以及還原糖的含量密切相關(guān)。除此之外，在高油脂食品中，關(guān)于丙烯酰胺的產(chǎn)生依然存在其他的可能:油脂加熱過程中產(chǎn)生的丙烯醛被氧化成丙烯酸，再進(jìn)一步與氨基發(fā)生作用產(chǎn)生丙烯酰胺。
[0005]現(xiàn)階段，食品中丙烯酰胺的確定主要以色譜分離以及質(zhì)譜分析技術(shù)為檢測手段，液相/質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用尤其廣泛，因?yàn)檫@種方法更直接、更簡便。但是，在比較復(fù)雜的食品基質(zhì)中，由于體系中雜質(zhì)離子的干擾，使得這種方法檢測結(jié)果的可靠性大大降低。
[0006]本發(fā)明針對復(fù)雜食品基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾，通過脫脂、提取、萃取、旋蒸以及復(fù)溶過濾等前處理操作提高丙烯酰胺提取液的純度，排除雜質(zhì)干擾，再進(jìn)行LC-MS/MS檢測，使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確、更具有可靠性。本發(fā)明方法可以應(yīng)用于復(fù)雜的高油脂食品體系，排除了高油脂食品中丙烯酰胺檢測的干擾，具有良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種提取食品中丙烯酰胺的預(yù)處理方法。
[0008]本發(fā)明以高油脂食品為檢測目標(biāo)，通過脫脂、提取、萃取、旋蒸以及復(fù)溶過濾等預(yù)處理操作，盡可能除去體系中的雜質(zhì)。經(jīng)過預(yù)處理后，再進(jìn)行LC-MS/MS檢測，排除檢測中雜質(zhì)的干擾，使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確、更可靠。
[0009]本發(fā)明提取食品中丙烯酰胺的預(yù)處理方法通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0010]一種提取食品中丙烯酰胺的預(yù)處理方法，包括以下步驟:
[0011](I)將待測食品研磨粉碎，稱取l-3g粉碎后的樣品；
[0012](2)向樣品中加入10_40mL正己烷，充分?jǐn)嚢韬蟪闉V，棄去濾液，洗滌濾渣，風(fēng)干濾渣；
[0013](3)向經(jīng)過脫脂后的濾渣中加入5_20mL0.5-2mol/LCaCl2溶液，超聲振蕩10-40min,離心操作A，收集上清液，沉淀中再加入CaCl2溶液重復(fù)提取2_4次，收集上清液，將收集的上清液離心操作B，去除沉淀；
[0014](4)向上清液中加入10-30mL乙酸乙酯進(jìn)行液-液萃取，振蕩2_10min后，靜置待溶液分層，將上層乙酸乙酯轉(zhuǎn)移出來，重復(fù)萃取操作1-5次，合并乙酸乙酯層，再向乙酸乙酯中加入適量無水硫酸鈉，過濾后將乙酸乙酯溶液減壓濃縮至0.5-2mL，將圓底燒瓶中的濃縮液轉(zhuǎn)移到離心管中，再向圓底燒瓶中加入0.5-2mL乙酸乙酯充分洗滌，將洗滌液合并至離心管中，于35-45°C水浴中用氮?dú)獯蹈桑尤雔_4mL超純水復(fù)溶，振蕩2_10min，備用；
[0015](5)將復(fù)溶后的溶液通過水系濾膜后，置于_20°C冰箱中冷凍l_5h，然后取出于0_5°C溫度下解凍，再對溶液進(jìn)行離心處理，去除沉淀；
[0016](6)將上清液再通過水系濾膜，完成預(yù)處理操作。
[0017]所述步驟(2)中重復(fù)洗滌濾渣2-6次。
[0018]所述步驟(3)中離心操作A條件為2000-6000r/min離心10_30min,離心操作B條件為 5000-20000r/min 離心 10_40min。
[0019]所述步驟(5)和(6)中水系濾膜為0.22 μ m水系濾膜。
[0020]本發(fā)明所使用的濾膜為市售產(chǎn)品，購于天津市東康科技有限公司。
[0021]所述步驟(6)完成預(yù)處理操作步驟的樣品能夠直接作為LC-MS/MS樣品。
[0022]本發(fā)明所述的食品包括各種常見食品，本方法特別適用于提取油炸、微波或焙烤食品中的丙烯酰胺，例如，提取油炸馬鈴薯(條)等中的丙烯酰胺，但對于高蛋白食品(如肉類)以及奶粉樣品中丙烯酰胺的提取效率相對較低。
[0023]本發(fā)明的有益效果:
[0024](I)通過一系列前處理操作可以省去SPE純化的操作，簡化純化過程。
[0025](2)樣品前處理過程中省去Carrez澄清劑的使用，避免該試劑對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。
[0026](3)以CaCl2溶液為提取劑，能夠很好避免乙酸乙酯萃取過程中的乳化現(xiàn)象，同時(shí)溶液中的Ca2+能夠與溶液中的蛋白發(fā)生作用形成鈣橋，可以避免溶液中蛋白對結(jié)果的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0027]—種提取食品中丙烯酰胺的預(yù)處理方法，包括以下步驟:
[0028]( I)將待測食品研磨粉碎，稱取l_3g粉碎后的樣品；
[0029](2)向樣品中加入10_40mL正己烷，充分?jǐn)嚢韬蟪闉V，棄去濾液，洗滌濾渣，風(fēng)干濾渣；
[0030](3)向經(jīng)過脫脂后的濾渣中加入5_20mL0.5-2mol/LCaCl2溶液，超聲振蕩10-40min,離心操作A，收集上清液，沉淀中再加入CaCl2溶液重復(fù)提取2_4次，收集上清液，將收集的上清液離心操作B，去除沉淀；
[0031](4)向上清液中加入10-30mL乙酸乙酯進(jìn)行液-液萃取，振蕩2_10min后，靜置待溶液分層，將上層乙酸乙酯轉(zhuǎn)移出來，重復(fù)萃取操作1-5次，合并乙酸乙酯層，再向乙酸乙酯中加入適量無水硫酸鈉，過濾后將乙酸乙酯溶液減壓濃縮至0.5-2mL，將圓底燒瓶中的濃縮液轉(zhuǎn)移到離心管中，再向圓底燒瓶中加入0.5-2mL乙酸乙酯充分洗滌，將洗滌液合并至離心管中，于35-45°C水浴中用氮?dú)獯蹈?，加入l_4mL超純水復(fù)溶，振蕩2_10min，備用；
[0032](5)將復(fù)溶后的溶液通過水系濾膜后，置于-20°C冰箱中冷凍l_5h，然后取出于0_5°C溫度下解凍，再對溶液進(jìn)行離心處理，去除沉淀；
[0033](6)將上清液再通過水系濾膜，完成預(yù)處理操作。
[0034]所述步驟(2)中重復(fù)洗滌濾渣2-6次。
[0035]所述步驟(3)中離心操作A條件為2000-6000r/min離心10_30min,離心操作B條件為 5000-20000r/min 離心 10_40min。
[0036]所述步驟(5)和(6)中水系濾膜為0.22 μ m水系濾膜。
[0037]本發(fā)明所使用的濾膜為市售產(chǎn)品，購于天津市東康科技有限公司。
[0038]所述步驟(6)完成預(yù)處理操作步驟的樣品能夠直接作為LC-MS/MS樣品。
[0039]本發(fā)明所述的食品包括各種常見食品，本方法特別適用于提取油炸、微波或焙烤食品中的丙烯酰胺，例如，提取油炸馬鈴薯(條)等中的丙烯酰胺，但對于高蛋白食品(如肉類)以及奶粉樣品中丙烯酰胺的提取效率相對較低。
[0040]回收率的測定方法和計(jì)算方法:
[0041]丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為Cst，LC-MS/MS分析得到丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品以及加標(biāo)樣品(加標(biāo)量為Wst)中丙烯酰胺峰面積分別為H Asa+st
[0042]按下式計(jì)算樣品以及加標(biāo)樣品中丙烯酰胺的濃度csa、csa+st:
[0043]Csa=Cst.(AJAst)
[0044]CSa+st-Cst.(ASa+st/Ast)
[0045]按下式計(jì)算樣品以及加標(biāo)樣品中丙烯酰胺的含量:
_6] Wsa=Vff.Csa
[0047]ffsa+St_Vw.C5a+St
[0048]其中Vw為復(fù)溶時(shí)超純水的體積。
[0049]樣品中丙烯酰胺的回收率為:(Wsa+st-ffsa) /Wst
[0050]下面以油炸馬鈴薯?xiàng)l為例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容和效果，但并非對本發(fā)明的限定。
[0051]在180°C溫度下油炸15min的馬鈴薯?xiàng)l，采用本發(fā)明所述的方法進(jìn)行預(yù)處理。
[0052]實(shí)施例1
[0053](I)將待測食品研磨粉碎，稱取約1.5g粉碎后的樣品，并準(zhǔn)確記錄樣品質(zhì)量。
[0054](2)向上述樣品中加入20mL正己烷，充分?jǐn)嚢韬蟪闉V，棄去濾液，對濾渣重復(fù)洗滌3次后，風(fēng)干濾渣，并將濾渣轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。
[0055](3)向脫脂后的樣品中加入IOmLlm0VLCaCl2溶液，超聲振蕩20min，取出以后離心15min, 4000r/min,將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，待用，再加入10mLlmol/LCaCl2溶液于沉淀中，充分振蕩，超聲20min，重復(fù)提取I次，同樣將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，將收集的上清液再進(jìn)行離心20min，10000r/min，將最后得到的上清液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，混勻。
[0056](4)向上述提取液中加入15mL乙酸乙酯進(jìn)行液-液萃取，漩渦振蕩5min后，靜置待溶液分層，將上層乙酸乙酯轉(zhuǎn)移出來，重復(fù)以上操作3次，合并乙酸乙酯層，再向乙酸乙酯中加入適量無水硫酸鈉。過濾后將乙酸乙酯溶液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，將圓底燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋蒸30°C，減壓濃縮至約lmL，將圓底燒瓶中的濃縮液轉(zhuǎn)移到4mL離心管中，再向圓底燒瓶中加入ImL乙酸乙酯充分洗滌，將洗滌液合并至離心管中，于40°C水浴中氮吹至干，最后加入2mL超純水復(fù)溶,并鏇潤振蕩5min,備用。
[0057](5)將上述復(fù)溶后的溶液通過0.22 μ m水系濾膜后,置于_20°C冰箱中冷凍3h,然后取出于4°C溫度下解凍，再對溶液進(jìn)行離心處理，棄去沉淀，轉(zhuǎn)移出上清。
[0058](6)將上清液再通過0.22 μ m水系濾膜，即得LC-MS/MS樣品。
[0059](7)對(6)中所得的樣品進(jìn)行LC-MS/MS分析，計(jì)算得到樣品中丙烯酰胺的含量為1526.26 μ g/kg,回收率 95.21%。
[0060]實(shí)施例2
[0061]( I)將待測食品研磨粉碎，稱取約1.5g粉碎后的樣品，并準(zhǔn)確記錄樣品質(zhì)量。
[0062](2)向上述樣品中加入20mL正己烷，充分?jǐn)嚢韬蟪闉V，棄去濾液，對濾渣重復(fù)洗滌3次后，風(fēng)干濾渣，并將濾渣轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。
[0063](3)向脫脂后的樣品中加入IOmL0.5mol/LCaCl2溶液，超聲振蕩20min，取出以后離心15min, 4000r/min,將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，待用，再加入IOmL0.5mol/LCaCl2溶液于沉淀中，充分振蕩，超聲20min，重復(fù)提取I次，同樣將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，將收集的上清液再進(jìn)行離心20min，10000r/min，將最后得到的上清液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，混勻。
[0064](4)向上述提取液中加入15mL乙酸乙酯進(jìn)行液-液萃取，漩渦振蕩5min后，靜置待溶液分層，將上層乙酸乙酯轉(zhuǎn)移出來，重復(fù)以上操作3次，合并乙酸乙酯層，再向乙酸乙酯中加入適量無水硫酸鈉。過濾后將乙酸乙酯溶液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，將圓底燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋蒸30°C，減壓濃縮至約lmL，將圓底燒瓶中的濃縮液轉(zhuǎn)移到4mL離心管中，再向圓底燒瓶中加入ImL乙酸乙酯充分洗滌，將洗滌液合并至離心管中，于40°C水浴中氮吹至干，最后加入2mL超純水復(fù)溶,并鏇潤振蕩5min,備用。
[0065](5)將上述復(fù)溶后的溶液通過0.22 μ m水系濾膜后，置于_20°C冰箱中冷凍3h，然后取出于4°C溫度下解凍，再對溶液進(jìn)行離心處理，棄去沉淀，轉(zhuǎn)移出上清。
[0066](6)將上清液再通過0.22 μ m水系濾膜，即得LC-MS/MS樣品。
[0067](7)對(6)中所得的樣品進(jìn)行LC-MS/MS分析，計(jì)算得到樣品中丙烯酰胺的含量為1236.38 μ g/kg,回收率 81.03%。
[0068]實(shí)施例3
[0069](I)將待測食品研磨粉碎，稱取約1.5g粉碎后的樣品，并準(zhǔn)確記錄樣品質(zhì)量。
[0070](2)向上述樣品中加入20mL正己烷，充分?jǐn)嚢韬蟪闉V，棄去濾液，對濾渣重復(fù)洗滌3次后，風(fēng)干濾渣，并將濾渣轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。
[0071](3)向脫脂后的樣品中加入10mL2mol/LCaCl2溶液，超聲振蕩20min，取出以后離心15min，4000r/min,將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，待用，再加入10mL2mol/LCaCl2溶液于沉淀中，充分振蕩，超聲20min，重復(fù)提取I次，同樣將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，將收集的上清液再進(jìn)行離心20min，10000r/min，將最后得到的上清液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，混勻。
[0072](4)向上述提取液中加入15mL乙酸乙酯進(jìn)行液-液萃取，漩渦振蕩5min后，靜置待溶液分層，將上層乙酸乙酯轉(zhuǎn)移出來，重復(fù)以上操作3次，合并乙酸乙酯層，再向乙酸乙酯中加入適量無水硫酸鈉。過濾后將乙酸乙酯溶液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，將圓底燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋蒸30°C，減壓濃縮至約lmL，將圓底燒瓶中的濃縮液轉(zhuǎn)移到4mL離心管中，再向圓底燒瓶中加入ImL乙酸乙酯充分洗滌，將洗滌液合并至離心管中，于40°C水浴中氮吹至干，最后加入2mL超純水復(fù)溶,并鏇潤振蕩5min,備用。
[0073](5)將上述復(fù)溶后的溶液通過0.22 μ m水系濾膜后，置于_20°C冰箱中冷凍3h，然后取出于4°C溫度下解凍，再對溶液進(jìn)行離心處理，棄去沉淀，轉(zhuǎn)移出上清。
[0074](6)將上清液再通過0.22 μ m水系濾膜，即得LC-MS/MS樣品。
[0075](7)對(6)中所得的樣品進(jìn)行LC-MS/MS分析，計(jì)算得到樣品中丙烯酰胺的含量為1311.74 μ g/kg,回收率 86.74%。
【權(quán)利要求】
1.一種提取食品中丙烯酰胺的預(yù)處理方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將待測食品研磨粉碎，稱取l-3g粉碎后的樣品；w2 (2)向樣品中加入10-40mL(優(yōu)選20_30mL)正己烷，充分?jǐn)嚢韬蟪闉V，棄去濾液，洗滌濾渣，風(fēng)干濾渣； (3)向經(jīng)過脫脂后的濾渣中加入5-20mL0.5-2mol/LCaCl2溶液，超聲振蕩10_40min，離心操作A，收集上清液，沉淀中再加入CaCl2溶液重復(fù)提取2-4次，收集上清液，將收集的上清液離心操作B,去除沉淀； (4)向上清液中加入10-30mL乙酸乙酯進(jìn)行液-液萃取，振蕩2_10min后，靜置待溶液分層，將上層乙酸乙酯轉(zhuǎn)移出來，重復(fù)萃取操作1-5次，合并乙酸乙酯層，再向乙酸乙酯中加入適量無水硫酸鈉，過濾后將乙酸乙酯溶液減壓濃縮至0.5-2mL，將圓底燒瓶中的濃縮液轉(zhuǎn)移到離心管中，再向圓底燒瓶中加入0.5-2mL乙酸乙酯充分洗滌，將洗滌液合并至離心管中，于35-45°C水浴中用氮?dú)獯蹈?，加入l_4mL超純水復(fù)溶，振蕩2_10min，備用； (5)將復(fù)溶后的溶液通過水系濾膜后，置于_20°C冰箱中冷凍l_5h，然后取出于0-5°C溫度下解凍，再對溶液進(jìn)行離心處理，去除沉淀； (6)將上清液再通過水系濾膜，完成預(yù)處理操作。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)處理方法，其特征在于，所述步驟(2)中的洗滌濾渣為重復(fù)洗漆2-6次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)處理方法，其特征在于，所述步驟(3)中離心操作A條件為2000-6000r/min 離心 10_30min,離心操作 B 條件為 5000-20000r/min 離心 10_40min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)處理方法，其特征在于，所述步驟(5)和(6)中水系濾膜為0.22 μ m水系濾膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)處理方法，其特征在于，所述步驟(6)完成預(yù)處理操作步驟的樣品能夠直接作為LC-MS/MS樣品。
【文檔編號(hào)】G01N1/28GK103499478SQ201310484363
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】劉元法, 李曉丹, 李進(jìn)偉 申請人:江南大學(xué)