專利名稱：一種乙基香蘭素抗原和抗體的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫分析測試領(lǐng)域，涉及一種乙基香蘭素抗原和抗體的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香蘭素，3-甲氧基-4-羥基苯甲醛，又稱香草醛；甲基香蘭素(Vanillin) 3，4-二甲氧基苯甲醛，又稱藜蘆醛、綠藜蘆醛、香草醛甲醚；乙基香蘭素(EthylVanillin)，3-乙氧基-4-羥基苯甲醛，又稱乙基香草醛、乙基凡尼林，三者均為白色或微黃色結(jié)晶性粉末，微溶于水，溶于乙醇、甘油、乙醚、氯仿及香料中；皆具有香莢蘭香氣及濃郁的奶香，是重要的食品添加劑，廣泛用作食品、飲料以及日化用品等領(lǐng)域。但是，大劑量使用香蘭素等香料將有害健康。目前，給嬰兒添加配方奶粉成為世界各地普遍采用的做法，而嬰幼兒是對有害物質(zhì)最敏感的群體。近年來由于嬰幼兒食品特別是配方奶粉的質(zhì)量優(yōu)劣或真假問題而引發(fā)的重大食品安全事件屢見不鮮。目前關(guān)于乙基香蘭素的測定方法主要有分光光度法、電化學(xué)法、高效液相色譜法、氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用法。這些分析方法具有高靈敏度和特異性的特點，但操作繁瑣，需要精密儀器和受過專業(yè)培訓(xùn)的操作人員，且耗時長。而特異性的結(jié)合反應(yīng)，例如抗原-抗體反應(yīng)，已經(jīng)廣泛用于檢測生物樣品中存在的各種物質(zhì)的免疫測試中。其中，膠體金免疫層析技術(shù)發(fā)展迅速，已被人們所熟知，與儀器分析法比較，膠體金層析技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、簡單快捷、易于操作等優(yōu)點。在膠體金免疫層析分析試紙的制備上，最為重要的環(huán)節(jié)是被測物的免疫源性物質(zhì)，即被測物的免疫抗原和免疫抗體的制備，而制備高特異性的抗體首先是要有純度較高，結(jié)構(gòu)合理的免疫原。因此，研究和篩選特異性更強(qiáng)、靈敏度更高的乙基香蘭素免疫分析抗原抗體和對于提高和完善本領(lǐng)域檢測手段具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種乙基香蘭素半抗原及其制備方法。本發(fā)明的目的之二提供一種乙基香蘭素完全抗原及其制備方法，乙基香蘭素完全抗原是在乙基香蘭素半抗原的基礎(chǔ)上進(jìn)一步制備得到。本發(fā)明的目的之三提供一種乙基香蘭素抗體及其制備方法。本發(fā)明的目的之四在于提供一種乙基香蘭素檢測用膠體金免疫層析分析試紙及其制備方法。本發(fā)明的目的還在于利用上述乙基香蘭素半抗原、乙基香蘭素完全抗原及乙基香蘭素抗體在應(yīng)用膠體金免疫層析分析技術(shù)檢測乙基香蘭素中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一種乙基香蘭素半抗原，具有如式(I)所示的結(jié)構(gòu):
權(quán)利要求
1.一種乙基香蘭素半抗原，其特征在于具有如式(I )所示的結(jié)構(gòu):
2.權(quán)利要求1所述的乙基香蘭素半抗原的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將乙基香蘭素和4-溴丁酸乙酯或5-溴戊酸乙酯溶解于強(qiáng)極性有機(jī)溶劑中，加入碳酸鉀和四丁基碘化銨，15 25V反應(yīng)12 16h ;反應(yīng)結(jié)束后加入冰水溶解反應(yīng)液,用乙酸乙酯萃取，水洗滌后收集有機(jī)相，干燥得到粗品； (2)將步驟(I)所得粗品溶于無水乙醇中，加入氫氧化鋰15 25V反應(yīng)2 4h，加水稀釋，乙醚萃取，取下層，再加入酸調(diào)pH至4 6.0，有固體析出，經(jīng)氯仿洗滌、抽濾、蒸干得到乙基香蘭素半抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙基香蘭素半抗原的制備方法，其特征在于: 步驟(I)中所述的強(qiáng)極性有機(jī)溶劑為N，N-二甲基甲酰胺或乙腈； 步驟(I)中所述的乙基香蘭素、4-溴丁酸乙酯或5-溴戊酸乙酯、碳酸鉀的摩爾比為1:1 2:3 5 ; 步驟(I)中所述的四丁基碘化銨的投料量為乙基香蘭素質(zhì)量的10 20% ； 步驟(I)中所述的干燥為通過30 40°C旋轉(zhuǎn)蒸干20分鐘干燥； 步驟(2)中所述的氫氧化鋰的用量為乙基香蘭素質(zhì)量的20 40%。
4.一種乙基香蘭素完全抗原，其特征在于具有如式(II)所示的結(jié)構(gòu):
5.權(quán)利要求4所述的乙基香蘭素完全抗原的制備方法，其特征在于包括如下步驟: 將權(quán)利要求1所述的乙基香蘭素半抗原溶解于N，N- 二甲基甲酰胺中，加入DEC鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，15 25°C反應(yīng)12 16小時，加入到由PBS溶解的載體物質(zhì)溶液中，15 25°C下反應(yīng)4 8小時，反應(yīng)液用PBS在4 20°C下透析2 3天，離心收集上清液，冷凍干燥得乙基香蘭素完全抗原； 所述的乙基香蘭素半抗原、DEC鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺與載體物質(zhì)的摩爾比為1:1 2:1 2:0.05; 所述的載體物質(zhì)為牛血清蛋白、雞蛋白蛋白或鑰孔戚血藍(lán)蛋白；所述的 PBS 為 10mM、pH7.2 7.4 的 PBS ； 所述的離心為4°C、8000r/min離心10分鐘。
6.一種乙基香蘭素抗體，其特征在于:所述的乙基香蘭素抗體利用權(quán)利要求4所述的乙基香蘭素完全抗原制備雜交瘤細(xì)胞，通過特異性篩選、體外培養(yǎng)、純化而獲得。
7.權(quán)利要求6所述的乙基香蘭素抗體的制備方法，其特征在于包括如下步驟:體外通過次黃嘌呤H、氨基蝶呤A和胸腺嘧啶核苷T選擇性培養(yǎng)基篩選乙基香蘭素雜交瘤細(xì)胞；通過ELISA方法檢測雜交瘤細(xì)胞上清液中抗體效價，選擇高效價高特異性的孔擴(kuò)大培養(yǎng)；將抗體陽性細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋克隆篩選；選出只有一個克隆生長的孔，擴(kuò)大培養(yǎng)，同樣方法篩選三次以上，得到穩(wěn)定分 泌抗體的陽性細(xì)胞株，即得到乙基香蘭素抗體。
8.—種乙基香蘭素檢測用膠體金免疫層析分析試紙，其特征在于包括墊襯和墊襯上依次搭接的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊；所述的金標(biāo)墊包被有膠體金標(biāo)記的乙基香蘭素抗體；所述的硝酸纖維素膜上有檢測線和質(zhì)控線，檢測線區(qū)包被有乙基香蘭素完全抗原，質(zhì)控線區(qū)包被有羊抗鼠IgG多抗。
9.權(quán)利要求8所述的乙基香蘭素檢測用膠體金免疫層析分析試紙的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)金標(biāo)墊的制備 用PBS將膠體金標(biāo)記的乙基香蘭素抗體配制成濃度0.5 1.0mg/mL的溶液,均勻地涂布在玻璃纖維素紙上，涂布量為30 80μ L/cm2，25 37°C真空干燥12h ； (2)檢測線和質(zhì)控線的制備 檢測線:用PBS將乙基香蘭素完全抗原配制成濃度0.5 1.0mg/mL的溶液,噴在硝酸纖維素膜的檢測區(qū)域上； 質(zhì)控線:用PBS將羊抗鼠IgG多抗配制成濃度0.5 1.0mg/mL的溶液,噴在硝酸纖維素膜的質(zhì)控區(qū)域上； 硝酸纖維素膜在50°C干燥12h ； (3)膠體金免疫層析分析試紙的組裝 將樣品墊、包被有膠體金標(biāo)記的乙基香蘭素抗體的金標(biāo)墊、包被有乙基香蘭素完全抗原和羊抗鼠IgG多抗的硝酸纖維素膜、吸水墊依次搭接組裝成測試條，將測試條置于墊襯上固定得到乙基香蘭素檢測用膠體金免疫層析分析試紙； 步驟(I)和(2)中所述的PBS為10mM、pH7.2 7.4的PBS。
10.權(quán)利要求1所述的乙基香蘭素半抗原、權(quán)利要求4所述的乙基香蘭素完全抗原、權(quán)利要求6所述乙基香蘭素抗體或權(quán)利要求8所述的乙基香蘭素檢測用膠體金免疫層析分析試紙在檢測乙基香蘭素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙基香蘭素抗原和抗體的制備方法及其應(yīng)用，屬于免疫分析測試領(lǐng)域。乙基香蘭素半抗原是在乙基香蘭素的羥基上連接上一連接臂，其結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示，R為碳鏈長度為C1～C6的亞烷基，X是羧基、巰基或氨基。乙基香蘭素完全抗原在乙基香蘭素半抗原的基礎(chǔ)上偶聯(lián)了載體物質(zhì)而得到。再利用完全抗原制備雜交瘤細(xì)胞，通過特異性篩選、體外培養(yǎng)、純化而獲得其抗體。本發(fā)明通過抗原抗體高效特異性競爭結(jié)合特性，制備乙基香蘭素檢測用膠體金免疫層析分析試紙，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡單快捷、易于操作等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/566GK103172525SQ20131005151
公開日2013年6月26日 申請日期2013年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月17日
發(fā)明者丁煥中, 賈慧勤, 沈祥廣, 古小燕, 曾振靈, 劉雅紅, 黃顯會 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)