專利名稱：一種評價轉(zhuǎn)基因糙米作為肉仔雞日糧原料飼用免疫安全性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種評價轉(zhuǎn)基因糙米作為肉仔雞日糧原料飼用免疫安全性的方法。
背景技術：
由于轉(zhuǎn)基因作物在抗性、品質(zhì)、產(chǎn)量等改良性狀方面已顯示出巨大潛力，我國于 2008年啟動了轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項，致力于培育、推廣一批有應用潛力的轉(zhuǎn)基因生物新品種，然而大力推廣的必要前提是對其進行安全性評價。轉(zhuǎn)基因作物被用作食品和動物飼料，因而飼用安全性評價是轉(zhuǎn)基因作物安全性評價的一個重要方面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種輔助檢測轉(zhuǎn)基因植物對生物的免疫安全性的方法。本發(fā)明所提供的輔助檢測轉(zhuǎn)基因植物對生物的免疫安全性的方法，包括如下步驟1)比較轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本之間的營養(yǎng)成分的組分及組分含量是否差異顯著；若差異顯著，則候選地確認所述轉(zhuǎn)基因植物對生物是非免疫安全的；若差異不顯著，則進行如下步驟幻至4)以進一步檢測；2)分別用包含所述轉(zhuǎn)基因植物或所述非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的飼料飼喂實驗動物； 將用包含所述轉(zhuǎn)基因植物的飼料飼喂的實驗動物記作實驗動物1，將用包含所述非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的飼料飼喂的實驗動物記作實驗動物2 ；3)對處死后的實驗動物1和實驗動物2分別進行如下指標檢測器官指數(shù)器官指數(shù)=器官重量/活體重；所述器官為肝臟、胸腺和/或法氏囊；全血指標紅細胞數(shù)目、白細胞數(shù)目、中性粒細胞數(shù)目、中性粒細胞百分比、單核細胞數(shù)目、單核細胞百分比、淋巴細胞數(shù)目、淋巴細胞百分比、T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和B淋巴細胞轉(zhuǎn)化率；血清學指標血清溶菌酶活性、新城疫抗體滴度、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性、總蛋白濃度、球蛋白濃度、A/G、免疫球蛋白A濃度、免疫球蛋白G濃度、免疫球蛋白M濃度；小腸絨毛中淋巴細胞數(shù)量；所述小腸為十二指腸、空腸或回腸；空腸組織中IL-2含量、IL-6含量或IFN- γ含量；4)比較步驟3)中的各個指標在實驗動物1和實驗動物2之間是否差異顯著；若所有指標均差異不顯著，則候選地確認所述轉(zhuǎn)基因植物對生物是免疫安全的；若至少一個指標差異顯著，則對差異顯著的指標進行如下步驟5)-7)進一步檢測5)用不含有轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的普通飼料飼喂實驗動物；將用不含有轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的普通飼料飼喂的實驗動物記作實驗動物3 ；
6)對處死后的實驗動物3，分別檢測步驟4)中所述差異顯著的指標；7)比較步驟4)中所述差異顯著的指標在實驗動物1和實驗動物3之間是否差異顯著；若差異均不顯著，則候選地確認所述轉(zhuǎn)基因植物對生物是免疫安全的；若至少有一個指標差異顯著，則候選地確認所述轉(zhuǎn)基因植物對生物是非免疫安全的；所述免疫安全是指所述轉(zhuǎn)基因植物在飼用上對生物的免疫安全。所述處死的動物可以現(xiàn)有的任何非創(chuàng)傷性的處死方法(即非外科手術方法)得到。上述方法中，所述生物為以所述轉(zhuǎn)基因植物為食物的動物。上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物的親本即為制備轉(zhuǎn)基因植物時的出發(fā)植物。上述任一所述方法中，所述營養(yǎng)成分的組分為水、蛋白、脂肪、碳水化合物、無氮浸出物、纖維、灰分、鈣、磷、氨基酸。上述任一所述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物；所述實驗動物為肉仔雞。上述任一所述方法中，所述轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為轉(zhuǎn)基因水稻，具體為轉(zhuǎn)CrylAc/sck基因水稻。上述任一所述方法中，所述肉仔雞為1日齡、體重42克的雞。上述任一所述方法中，從飼喂開始時計起，分別在第21天和第42天進行所述指標檢測，并且分別比較第21天的各個指標和第42天的各個指標；所述飼喂當天記作第1天。上述任一所述方法中，所述飼喂過程中第1天至第21天所用的飼料如下所述不含有轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的普通飼料的組成及質(zhì)量份如下玉米57. 6、非轉(zhuǎn)基因大豆粕31. 27、玉米油2. 52、魚粉4. 79、磷酸氫鈣1. 07、食鹽0. 3、石粉(碳酸鈣)1. 37、DL-蛋氨酸0. 08、預混料1 ；所述包含所述轉(zhuǎn)基因植物的飼料的組成及質(zhì)量份如下所述轉(zhuǎn)基因植物57. 2、非轉(zhuǎn)基因大豆粕32. 84、玉米油1. 63、魚粉4. 53、(磷酸氫鈣)1. 04、食鹽0. 27、碳酸鈣1. 42、 DL-蛋氨酸0. 07、預混料1 ；所述包含所述非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的飼料的組成及質(zhì)量份如下所述非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本58. 9、非轉(zhuǎn)基因大豆粕31. 35、玉米油1. 4、魚粉4. 56、磷酸氫鈣1. 02、食鹽0. 27、碳酸鈣1. 43、DL-蛋氨酸0. 07、預混料1 ；上述任一所述方法中，所述飼喂過程中第22天至第42天所用的飼料如下所述不含有轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的普通飼料的組成及質(zhì)量份如下玉米58. 8、非轉(zhuǎn)基因大豆粕30. 25、玉米油4. 32、魚粉3. 03、(磷酸氫鈣)1. 1、食鹽0. 22、碳酸鈣1. 27、DL-蛋氨酸0. 01、預混料1 ；所述包含所述轉(zhuǎn)基因植物的飼料的組成及質(zhì)量份如下所述轉(zhuǎn)基因植物58. 6、非轉(zhuǎn)基因大豆粕31. 77、玉米油3.沈、魚粉2. 78、磷酸氫鈣1. 06、食鹽0. 19、碳酸鈣1. 34、預混料1 ；所述包含所述非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的飼料的組成及質(zhì)量份如下所述非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本59. 86、非轉(zhuǎn)基因大豆粕30. 92、玉米油3. 15、魚粉2. 43、磷酸氫鈣1. 11、食鹽0. 2、碳酸鈣1. 33、預混料1 ；所述飼喂過程中第1天至第21天所用的預混料組成及配比如下維生素 A 12500IU、維生素D34400IU、維生素E 15mg、維生素K33. 8mg、維生素B1L 5mg、維生素
5B27. %ig、維生素 2. %ig、維生素B12O. Olmg、泛酸鈣8. 8mg、煙酰胺25mg、葉酸0. 75mg、生物素 0. 10mg、鐵 70mg、銅 llmg、錳 70mg、鋅 65mg、碘 0. 49mg、硒 0. 3mg ；所述飼喂過程中第22天至第42天所用的預混料組成及配比如下維生素 A 10000IU、維生素D33500IU、維生素E Umg、維生素K33. Omg、維生素B1L ang、維生素 B26. Omg、維生素 ang、維生素B12O. 008mg、泛酸鈣7. Omg、煙酰胺20mg、葉酸0. 60mg、生物素 0. 08mg、鐵 63mg、銅 10mg、錳 65mg、鋅 59mg、碘 0. 45mg、硒 0. 28mgo上述任一所述方法在對轉(zhuǎn)基因植物的飼用安全性評價中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明涉及對轉(zhuǎn)CrylAc/sck基因糙米作為肉仔雞日糧原料飼用免疫安全性評價的一種新方法，通過該方法的使用，為轉(zhuǎn)基因糙米作為肉仔雞日糧原料飼用免疫安全提供一套技術評價新方法。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物對食之的動物的免疫安全性的檢測方法，檢測指標更全面， 使檢測結果更符合實際，更加可信。因此，本發(fā)明方法在轉(zhuǎn)基因植物對食之動物的免疫安全性檢測領域及在轉(zhuǎn)基因植物的飼用安全性評價領域具有廣闊的應用前景。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實驗材料如下轉(zhuǎn)CrylAc/sck基因水稻(名稱為MSA)在文獻“轉(zhuǎn)crylAc/sck基因抗蟲水稻對稻田主要非靶標害蟲的田間影響評價”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所獲得；轉(zhuǎn)CrylAc/sck基因水稻的親本(名稱為MH86)在文獻“轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻對水稻害蟲群落的影響”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所獲得；肉仔雞為1日齡、體重42克的雞，購自北京華都種雞廠。實施例1、評價轉(zhuǎn)CrylAc/sck基因水稻對肉仔雞的免疫安全性步驟一、轉(zhuǎn)CrylAc/sck基因糙米與親本糙米的營養(yǎng)成分對比轉(zhuǎn)CrylAc/sck基因糙米與親本糙米生長在相鄰的田地里，生長條件一致，在種植、暴曬、貯存和加工過程中彼此嚴格分開，避免任何可能的混合與污染，試驗前貯藏于陰涼通風干燥處。兩種水稻加工成糙米，粉碎后用于營養(yǎng)成分的測定和配制肉仔雞全價營養(yǎng)日糧。飼料樣品的采集方法(GB/T 14699. 1_93)，分別采集轉(zhuǎn)基因稻谷和其非轉(zhuǎn)基因親本樣品(即谷粒)，粉碎后過40目篩。然后進行如下成分測定，每個樣品測三次重復，最后取其平均值。1、測定樣品中水分、干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分及無氮浸出物含量， 測定方法參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術》(張麗英著)。水分含量將樣品放在105°C烘箱中烘至恒重，樣品的失重即代表水分的含量。粗蛋白含量采用凱氏半自動定氮儀進行滴定。粗脂肪含量以乙醚為提取劑進行索氏提取。粗灰分含量在550°C灼燒后所得殘渣即為粗灰分。
粗纖維含量采用酸堿法進行測定。無氮浸出物含量=1-水分含量-粗蛋白含量-粗脂肪含量-粗灰分含量-粗纖維含量。氨基酸含量的測定采用酸水解(6mol/L鹽酸，110°C水解Mh)和氧化水解(蛋氨酸、胱氨酸使用過氧甲酸進行氧化處理)對兩種糙米進行處理，使用Beckman 6300型氨基酸自動分析儀測定17種氨基酸含量。每個樣品測三次重復，最后取其平均值。結果營養(yǎng)成分及含量比對中，各個指標均無顯著差異，表明轉(zhuǎn)CrylAc/sck基因水稻與親本水稻具有實質(zhì)等同性。具體結果如表1和表2.轉(zhuǎn)基因糙米及其親本的常規(guī)營養(yǎng)成分見表1。從表中可看出轉(zhuǎn)基因糙米中常規(guī)營養(yǎng)成分中粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、碳水化合物、無氮浸出物和粗纖維、鈣和磷的含量，與其親本略有差異，均低于親本糙米中各成分的含量，但差異不顯著(P > 0. 05)。表1、轉(zhuǎn)基因水稻及其親本的常規(guī)營養(yǎng)成分
權利要求
1.一種輔助檢測轉(zhuǎn)基因植物對生物的免疫安全性的方法，包括如下步驟1)比較轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本之間的營養(yǎng)成分的組分及組分含量是否差異顯著；若差異顯著，則候選地確認所述轉(zhuǎn)基因植物對生物是非免疫安全的；若差異不顯著， 則進行如下步驟2)至4)以進一步檢測；2)分別用包含所述轉(zhuǎn)基因植物或所述非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的飼料飼喂實驗動物；將用包含所述轉(zhuǎn)基因植物的飼料飼喂的實驗動物記作實驗動物1，將用包含所述非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的飼料飼喂的實驗動物記作實驗動物2 ；3)對處死后的實驗動物1和實驗動物2分別進行如下指標檢測器官指數(shù)器官指數(shù)=器官重量/活體重；所述器官為肝臟、胸腺和/或法氏囊；全血指標紅細胞數(shù)目、白細胞數(shù)目、中性粒細胞數(shù)目、中性粒細胞百分比、單核細胞數(shù)目、單核細胞百分比、淋巴細胞數(shù)目、淋巴細胞百分比、T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和B淋巴細胞轉(zhuǎn)化率；血清學指標血清溶菌酶活性、新城疫抗體滴度、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性、總蛋白濃度、球蛋白濃度、A/G、免疫球蛋白A濃度、免疫球蛋白G濃度、免疫球蛋白M濃度；小腸絨毛中淋巴細胞數(shù)量；所述小腸為十二指腸、空腸或回腸；空腸組織中IL-2含量、IL-6含量或IFN- γ含量；4)比較步驟3)中的各個指標在實驗動物1和實驗動物2之間是否差異顯著；若所有指標均差異不顯著，則候選地確認所述轉(zhuǎn)基因植物對生物是免疫安全的；若至少一個指標差異顯著，則對差異顯著的指標進行如下步驟幻-7)進一步檢測5)用不含有轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的普通飼料飼喂實驗動物；將用不含有轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的普通飼料飼喂的實驗動物記作實驗動物3 ；6)對處死后的實驗動物3，分別檢測步驟4)中所述差異顯著的指標；7)比較步驟4)中所述差異顯著的指標在實驗動物1和實驗動物3之間是否差異顯著； 若差異均不顯著，則候選地確認所述轉(zhuǎn)基因植物對生物是免疫安全的；若至少有一個指標差異顯著，則候選地確認所述轉(zhuǎn)基因植物對生物是非免疫安全的；所述免疫安全是指所述轉(zhuǎn)基因植物在飼用上對生物的免疫安全。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述營養(yǎng)成分的組分為水、蛋白、脂肪、碳水化合物、無氮浸出物、纖維、灰分、鈣、磷、氨基酸。
3.根據(jù)權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物；所述實驗動物為肉仔雞。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為轉(zhuǎn)基因水稻，具體為轉(zhuǎn)CrylAc/sck基因水稻。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述肉仔雞為1日齡、體重42克的雞。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于從飼喂開始時計起，分別在第21 天和第42天進行所述指標檢測，并且分別比較第21天的各個指標和第42天的各個指標； 所述飼喂當天記作第1天。
7.根據(jù)權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述飼喂過程中第1天至第21天所用的飼料如下所述不含有轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的普通飼料的組成及質(zhì)量份如下玉米 (57.6、非轉(zhuǎn)基因大豆粕31. 27、玉米油2. 52、魚粉4. 79、磷酸氫鈣1. 07、食鹽0. 3、碳酸鈣 1. 37、DL-蛋氨酸0. 08、預混料1 ；所述包含所述轉(zhuǎn)基因植物的飼料的組成及質(zhì)量份如下所述轉(zhuǎn)基因植物57. 2、非轉(zhuǎn)基因大豆粕32. 84、玉米油1. 63、魚粉4. 53、磷酸氫鈣1. 04、食鹽0. 27、碳酸鈣1. 42,DL-蛋氨酸0. 07、預混料1 ；所述包含所述非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的飼料的組成及質(zhì)量份如下所述非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本58. 9、非轉(zhuǎn)基因大豆粕31. 35、玉米油1. 4、魚粉4. 56、磷酸氫鈣1. 02、食鹽(0. 27、碳酸鈣 1. 43、DL-蛋氨酸0. 07、預混料1 ；所述飼喂過程中第22天至第42天所用的飼料如下所述不含有轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的普通飼料的組成及質(zhì)量份如下玉米(58.8、非轉(zhuǎn)基因大豆粕30. 25、玉米油4. 32、魚粉3. 03、磷酸氫鈣1. 1、食鹽0. 22、碳酸鈣 1. 27、DL-蛋氨酸0. 01、預混料1 ；所述包含所述轉(zhuǎn)基因植物的飼料的組成及質(zhì)量份如下所述轉(zhuǎn)基因植物58. 6、非轉(zhuǎn)基因大豆粕31. 77、玉米油3. 26、魚粉2. 78、磷酸氫鈣1. 06、食鹽0. 19、碳酸鈣1. 34、預混料1 ； 所述包含所述非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的飼料的組成及質(zhì)量份如下所述非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本(59.86、非轉(zhuǎn)基因大豆粕30. 92、玉米油3. 15、魚粉2. 43、磷酸氫鈣1. 11、食鹽0.2、碳酸鈣 1. 33、預混料1 ；所述飼喂過程中第1天至第21天所用的預混料組成及配比如下維生素A 12500IU、 維生素D344 00IU、維生素E 15mg、維生素K33. 8mg、維生素B1L 5mg、維生素Β27· 4mg、維生素Β62· 4mg、維生素B12O. Olmg、泛酸鈣8. 8mg、煙酰胺25mg、葉酸0. 75mg、生物素0. 10mg、鐵 70mg、銅 IlmgJl 70mg、鋅 65mg、碘 0. 49mg、硒 0. 3mg ；所述飼喂過程中第22天至第42天所用的預混料組成及配比如下維生素A 10000IU、 維生素D33500IU、維生素E lang、維生素K33. Omg、維生素B1L ang、維生素Omg、維生素 ang、維生素B12O. OOang、泛酸鈣7. Omg、煙酰胺20mg、葉酸0. 60mg、生物素0. 08mg、鐵63mg、 銅 IOmgJl 65mg、鋅 59mg、碘 0. 45mg、硒 0. 28mg。
8.權利要求1-7中任一所述方法在對轉(zhuǎn)基因植物的飼用安全性評價中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種評價轉(zhuǎn)基因糙米作為肉仔雞日糧原料飼用免疫安全性的方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟1)比較轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本之間的營養(yǎng)成分的組分及組分含量是否差異顯著；若差異不顯著，則進行如下步驟2)至4)以進一步檢測；2)分別用包含所述轉(zhuǎn)基因植物或所述非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼H本的飼料飼喂實驗動物；3)對處死后的實驗動物1和實驗動物2分別進行指標檢測；4)比較步驟3)中的各個指標在實驗動物1和實驗動物2之間是否差異顯著；若所有指標均差異不顯著，則候選地確認所述轉(zhuǎn)基因植物對生物是免疫安全的。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物對食之動物的免疫安全性的檢測方法，檢測指標更全面，使檢測結果更符合實際，更加可信。因此，本發(fā)明方法在轉(zhuǎn)基因植物對食之動物的免疫安全性檢測領域具有廣闊的應用前景。
文檔編號G01N33/48GK102346180SQ201110151089
公開日2012年2月8日 申請日期2011年6月7日 優(yōu)先權日2011年6月7日
發(fā)明者劉陽, 秦海峰, 邢福國 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所