專利名稱：：一種簡易檢測蛋雞禽流感和新城疫免疫抗體的方法一種簡易檢測蛋雞禽流感和新城疫免疫抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于禽類疫病檢測領(lǐng)域，具體說是一種簡易檢測蛋雞禽流感和新城疫免疫抗體的方法。糊技術(shù)自高致病性禽流感H5N1在國內(nèi)外發(fā)生以來，用疫苗免疫注射提高家禽的特異性免疫力，/工高致病性禽流感的預(yù)防、控制中起到了重要作用。為了切實掌握高致病性禽流感、新城疫等重大動物疫病的流行規(guī)律和疫情動態(tài)，及時發(fā)現(xiàn)和消除疫情隱患，每年省、自治區(qū)、直轄市人民政府獸醫(yī)主管部門根據(jù)國家動物疫病監(jiān)測計劃下達本行政區(qū)域的動物疫病監(jiān)測計劃。雞高致病性禽流感、新城疫免疫效果的監(jiān)測，需要按一定比例采樣，抽取雞血析出血清后，做血凝和血凝抑制試驗來判定結(jié)果。采取雞血需要專業(yè)技術(shù)人員操作，并且需要采取必要的防護隔離措施，如穿戴隔離服、手套、口罩、頭套、腳套等，消耗大量的人力、物力。并且捉雞、采血使雞產(chǎn)生較大的應(yīng)激反應(yīng)，對蛋雞產(chǎn)蛋有一定的影響。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就在于提供一種簡易檢測蛋雞禽流感和新城疫免疫抗體的方法。本方法用雞蛋檢測高致病性禽流感免疫抗體，不需要現(xiàn)場采血，采樣不需要專業(yè)技術(shù)，由養(yǎng)殖戶自己即可完成，不需要幾人進入雞舍，可少用或不用采取防護措施。本發(fā)明技術(shù)方案如下1禽流感血凝(HA)試驗(表格見附表一)1.1在微量反應(yīng)板的l一4排的1—12孔均加入0.025mlPBS液，更換滴頭。1.2吸取0.025ml禽流感H5亞型抗原液加入第1孔，用微量移液器反復(fù)吹吸混勻。1.3從第1孔吸取0.025ml抗原混合液加入第2孔，混勻后吸取0.025ml加入第3孔，如此進行對倍稀釋至第ll孔，至第11孔吸取0.025ml棄之，更換滴頭。1.4每孔再加入0.025mlPBS液。L5每孔均加入0.025ml1%的雞紅細胞懸液。1.6將反映板放在微量振蕩器上振蕩l一3分鐘，置2CTC—25'C室溫(如果環(huán)境溫度太低可放在25"恒溫箱內(nèi))下靜置40分鐘后觀察結(jié)果，對照孔紅細胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。1.7結(jié)果判定將反應(yīng)板傾斜，觀察紅細胞有無淚滴狀流淌。完全血凝(不流淌)的抗原最高稀釋倍數(shù)代表一個血凝單位。以完全血凝的抗原最高稀釋倍數(shù)作為終點，終點稀釋倍數(shù)(取4個結(jié)果的平均值)除以4即為含4個血凝單位的抗原的稀釋倍數(shù)。注新城疫血凝試驗與禽流感血凝試驗操作步驟基本相同，只是在1.2步中抗原液更換為新城疫抗原。2、禽流感血凝抑制(HI)試驗(表格見附表二)2.1把己編好號的雞蛋用消毒劑洗凈，再用清水漂洗干凈，擦千備用。2.2在微量反應(yīng)板的第l孔、第12孔加入0.05mlPBS液、2—11孔均加入0.025ralPBS液。2.3把雞蛋磕開，瀝出蛋清，只留蛋黃在半邊蛋殼中，用5ml注射器(去除針頭)吸取蛋黃().2一0.5ml，滴l滴(0.05ml)于微量反應(yīng)板第l孔內(nèi)。可如此反復(fù)，把其他雞蛋樣品加入微量反應(yīng)板每排的第l孔內(nèi)。2.4把微量反應(yīng)板放在快速混勻器上(用手扶牢以免傾斜溢出)振蕩2—5分鐘，使蛋黃與PBS液充分混合后，吸取0.05ml棄之(或做新城疫抗體檢測)，吸取0.025ml加入第2孔，用微量移液器反復(fù)吹吸混勻吸取0.025ml加入第3孔，依次對倍稀釋至第10孔吸取0.025ml棄之。2.5l—ll孔均加入含4單位抗原的H5亞型抗原液0.025ml，放在微量振蕩器上振蕩混勻，置20°C—25。C室溫下靜置30分鐘。2.6每孔加入0.025ml的1%的雞紅細胞懸液，放在微量振蕩器上振蕩混勻，靜置40分鐘。2.7結(jié)果判定以完全抑制4個單位抗原的最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。判定結(jié)果時為避免卵黃的影響，可在微量反應(yīng)板反面觀察凝聚圖形，HI價大于或等于5Log2判定免疫良好。注微量移液器可使用單道、8道、12道移液器。3新城疫血凝抑制(HI)試驗(表格見附表三)在微量反應(yīng)板的2—11孔均加入0.025mlPBS液，第12孔加入0.05mlPBS液。把步驟2.4中第1孔中應(yīng)棄去的0.05ml蛋黃液，0.025ml加入第1孔，另0.025ml加入第2孔使蛋黃液與PBS液充分混合后，吸取0.025ml加入第3孔，依次對倍稀釋至第11孔吸取0.025ml棄之。其他依照禽流感檢測進行。試驗用溶液的配制1PBS液的配制磷酸二氫鈉0.316g磷酸氫二鈉1.096g氯化鈉8.5g加蒸餾水至1000ml用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)PH至7.2。滅菌后于4'C保存不超過3周。2阿氏液的配制葡萄糖2.05g檸檬酸鈉0.80g檸檬酸0.055g氯化鈉0.42g加蒸餾水至100ml，用氣氧化鈉或鹽酸調(diào)ra至6.1。滅菌后于4。C保存?zhèn)溆谩?1%雞紅細胞懸液制備采集至少3只SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，洗漆3次，洗滌后用PBS液配成體積分數(shù)為1%的紅細胞懸液，4'C保存?zhèn)溆谩?4單位抗原液的配制以完全血凝的抗原最高稀釋倍數(shù)作為終點，終點稀釋倍數(shù)(取4個結(jié)果的平均值)除以4即為含4個血凝單位的抗原的稀釋倍數(shù)，用PBS液稀釋后備用。本發(fā)明采樣沒有外人進入、不用捉雞、采血，對雞不會造成任何應(yīng)激，產(chǎn)蛋率沒有影響，很好地緩解了養(yǎng)殖戶對采樣的抵觸情緒，有利于免疫監(jiān)測的順利進行。因用雞蛋檢測雞新城疫抗體經(jīng)常使用，自2005年用疫苗免疫注射預(yù)防雞高致病性禽流感以來，能否用雞蛋檢測高致病性禽流感免疫抗體，就成為采樣人員和養(yǎng)殖戶經(jīng)常提出的問題。我們經(jīng)過近3年的努力，做了多次血清與雞蛋檢測高致病性禽流感抗體的對照試驗，改進了檢測方法，取得了滿意的結(jié)果。用雞蛋檢測高致病性禽流感免疫抗體，采樣不需要專業(yè)技術(shù)，由養(yǎng)殖戶自己即可完成。不需要幾人進入雞舍，可少用或不用采取防護措施。本方法科學(xué)地把0.05ml轉(zhuǎn)變?yōu)?.025ml,改變了過去按照新城疫檢測方法檢測與標準不一致的問題，也節(jié)約了抗原的使用量。蛋黃粘稠不預(yù)處理不易混勻，容易造成微量移液器滴頭堵塞，倍比稀釋移液不準確，人為造成離散度偏高，影響檢測結(jié)果，影響多道微量移液器的使用，降低檢測效率。使用快速混勻器，蛋黃液混合均勻無需另作處理，解決了因蛋黃粘稠對倍稀釋不準確的問題。用檢測禽流感應(yīng)棄去的卵黃液與檢測新城疫抗體相結(jié)合，疫病監(jiān)測更方便。提高了用雞蛋檢測抗體水平的科學(xué)性、準確性。本技術(shù)方案簡單、新穎、實用，方法易于掌握。應(yīng)用化驗室的現(xiàn)有設(shè)備與現(xiàn)有技術(shù)水平，適當(dāng)調(diào)整操作方法即可完成。適用于縣級實驗室的常規(guī)監(jiān)測和集中監(jiān)測以及雞場化驗室定期檢測抗體水平提供免疫依據(jù)。試驗優(yōu)點1用雞蛋代替蛋雞血清，降低了采樣難度。2科學(xué)地把0.05ml改為0.025ml,與國標一致，也節(jié)約了抗原的使用量。3蛋黃液混合均勻無需另作處理，解決了因蛋黃粘稠對倍稀釋不準確的問題。4可與新城疫抗體檢測相結(jié)合疫病監(jiān)測更方便。注意事項1用雞蛋檢測抗體略有一定的滯后性，可后延1-2天采樣。本方法適用于免疫蛋雞群的常規(guī)監(jiān)測和集中監(jiān)測，不適用于發(fā)病蛋雞群的抗體檢測。禽流感、新城疫抗體檢測可單獨進行，也可調(diào)換順序。2試驗要使用110°有機血凝板，嚴禁使用一次性血凝板。用過的血凝板及時用水龍頭沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗2次，甩干水后，放在37'C恒溫箱內(nèi)干燥備用。3試驗前應(yīng)先把血凝板編號，同時清楚標記所做樣品的編號，并分別標記出禽流感、新城疫。4每次檢測要做陰性、陽性對照，每板做抗原對照、稀釋液對照，為了結(jié)果可以讀到11Log2抗原對照、稀釋液對照可集中在12孔分段進行。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>附表三:禽流感試驗取出的0.05ml新城疫P制試驗單位ml<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1、一種簡易檢測檢測蛋雞禽流感免疫抗體的方法，其包括如下步驟禽流感血凝抑制試驗步驟1，把已編好號的雞蛋用消毒劑洗凈，再用清水漂洗干凈，擦干備用；步驟2，在微量反應(yīng)板的第1孔、第12孔加入0.05mlPBS液、2-11孔均加入0.025mlPBS液；步驟3，把雞蛋磕開，瀝出蛋清，只留蛋黃在半邊蛋殼中，用5ml注射器吸取蛋黃0.2-0.5ml，滴0.05ml于微量反應(yīng)板第1孔內(nèi)，如此反復(fù)，把其他雞蛋樣品加入微量反應(yīng)板每排的第1孔內(nèi)；步驟4，把微量反應(yīng)板放在快速混勻器上振蕩2-5分鐘，使蛋黃與PBS液充分混合后，吸取0.05ml用做新城疫抗體檢測，再吸取0.025ml加入第2孔，用微量移液器反復(fù)吹吸混勻吸取0.025ml加入第3孔，依次對倍稀釋至第10孔吸取0.025ml棄之；步驟5，1-11孔均加入含4單位抗原的H5亞型抗原液0.025ml，放在微量振蕩器上振蕩混勻，置20℃-25℃室溫下靜置30分鐘；步驟6，每孔加入0.025ml的1％的雞紅細胞懸液，放在微量振蕩器上振蕩混勻，靜置40分鐘；步驟7，結(jié)果判定以完全抑制4個單位抗原的最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度，判定結(jié)果時為避免卵黃的影響，可在微量反應(yīng)板反面觀察凝聚圖形，HI價大于或等于5Log2判定免疫良好；新城疫血凝抑制試驗在微量反應(yīng)板的2-11孔均加入0.025mlPBS液，第12孔加入0.05mlPBS液，把上述步驟4中第1孔中吸取的0.05ml蛋黃與PBS混合液取0.025ml加入第1孔，另0.025ml加入第2孔使之與PBS液充分混合后，吸取0.025ml加入第3孔，依次對倍稀釋至第11孔吸取0.025ml棄之，其他依照上述禽流感血凝抑制試驗進行，只是將步驟5中H5亞型抗原液換成新城疫抗原液。全文摘要本發(fā)明公開了一種簡易檢測蛋雞禽流感和新城疫免疫抗體的方法，本方法不需要現(xiàn)場采血，可節(jié)省大量的醫(yī)療器械。本發(fā)明采樣沒有外人進入、不用捉雞、采血，對雞不會造成任何應(yīng)激，產(chǎn)蛋率沒有影響，很好地緩解了養(yǎng)殖戶對采樣的抵觸情緒，有利于免疫監(jiān)測的順利進行。文檔編號G01N33/543GK101320043SQ20081001525公開日2008年12月10日申請日期2008年4月14日優(yōu)先權(quán)日2008年4月14日發(fā)明者秦鳳云申請人:秦鳳云