專利名稱：：用于癌癥風險評估的膜聯(lián)蛋白的制作方法用于癌癥風險評估的膜聯(lián)蛋白本發(fā)明涉及對癌癥，特別是泌尿生殖道和/或腸道癌癥的治療和/或診斷。癌癥是西方社會人類死亡最主要的原因，其通常與其診斷困難相關。例如，前列腺癌是男性癌癥死亡的最主要原因，但是其是難于診斷的異質(zhì)性(heterogeneous)疾病。預測個體腫瘤的發(fā)展過禾呈幾乎是不可能的。目前，診斷用的前列腺癌標志物基本都基于前列腺癌特異性抗原(PSA)的不同亞型(isoform),總體而言，在假陰性和假陽性方面都不令人滿意(l-4)。近來，已提出了來自體液或前列腺組織的多種替代性分子標志物(5-11)。至少三個不同的前列腺癌亞類已被鑒定出來，它們似乎與肺瘤級別、復發(fā)率和轉移相關(12)。僅僅是脂肪酸合酶單獨就對前列腺癌定義了截然不同的分子標記(13)。然而，人們?nèi)约鼻行枰?、更可靠的治療和診斷參數(shù)，用于根據(jù)病程發(fā)展風險來表征患者，以開發(fā)出新的合適的多模式(multimodel)治療策略，用于改善個體癌癥控制(14-16)。有鑒于此，在第一個方面，已通過使用至少一種膜聯(lián)蛋白(annexm)(優(yōu)選地，膜聯(lián)蛋白A3)來治療癌癥(特別是泌尿生殖道和/或腸道癌癥，優(yōu)選前列腺癌)，解決了本發(fā)明所提出的問題。此外，本發(fā)明包括至少一種膜聯(lián)蛋白(優(yōu)選地，膜聯(lián)蛋白A3)用于制備治療癌癥(特別是泌尿生殖道和/或腸道癌癥，優(yōu)選前列腺癌)的藥物的用途。在優(yōu)選的實施方式中，癌癥治療通過提高至少一種膜聯(lián)蛋白的體內(nèi)豐度來進行，特別是通過提高至少一種細胞外膜聯(lián)蛋白的體內(nèi)豐度來進行。有鑒于此，在另一方面，通過下述方法解決了本發(fā)明提出的問題，所述方法用于i貪斷癌癥，特別是泌尿生殖道和/或腸道癌癥，和/或用于區(qū)分癌性和非癌性組織，所述方法包括以下單獨步驟-測定至少一種膜聯(lián)蛋白的細胞內(nèi)豐度，和/或-測定至少一種膜聯(lián)蛋白的細胞外豐度，特別是使用尿樣或其組分來進行。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的方法包括以下單獨步-驟-測定至少一種膜聯(lián)蛋白的細胞內(nèi)豐度，和-測定至少一種膜聯(lián)蛋白的細胞外豐度，特別是使用尿樣或其組分來進行。在另一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的方法包括以下單獨步驟-測定至少一種膜聯(lián)蛋白的細胞內(nèi)豐度，和-測定至少一種所述膜聯(lián)蛋白的細胞外豐度，特別是使用尿樣或其組分來進行。測定至少一種膜聯(lián)蛋白的細胞內(nèi)和細胞外豐度之后，可以確定細胞豐度相對細胞內(nèi)豐度的比例。獲得的比例是針對癌癥和/或用于區(qū)分癌性和非癌性組織的有利診斷參數(shù)。根據(jù)本發(fā)明，術語"細胞外"應當被理解為包括細胞質(zhì)膜的外表面在內(nèi)的細胞外空間。根據(jù)本發(fā)明，術語"非癌性組織"包括健康組織和發(fā)病組織，特別是良性前列腺增生、慢性前列腺炎、Crohn病、潰瘍性結腸炎、易發(fā)炎組織和纖維化，特別是次級纖維化。根據(jù)本發(fā)明，術語"豐度"應當被理解為蛋白質(zhì)分別的細胞內(nèi)和/或細力包外水平和濃度。根據(jù)本發(fā)明，術語"膜聯(lián)蛋白"和"蛋白"通常包含其亞型、突變體、截短版本和翻譯后修飾形式。翻譯后修飾形式尤其可以包括可通過蛋白水解力。工獲得的蛋白質(zhì)性(proteinaceous)形式。才艮據(jù)本發(fā)明，術語"治療(treatment)"等同于"治療法(therapy)",由此包括治療與癌癥相關的問題。在優(yōu)選實施方式的情況下，膜聯(lián)蛋白至少是由膜聯(lián)蛋白Al、膜聯(lián)蛋白A2、膜聯(lián)蛋白A3、膜聯(lián)蛋白A4、膜聯(lián)蛋白A5、膜聯(lián)蛋白A6、膜聯(lián)蛋白A7、膜聯(lián)蛋白A8和膜聯(lián)蛋白A10構成的組的成員，并且其中，優(yōu)選地，將至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度與至少一種其它蛋白的豐度一起測定。關于所述其它蛋白，參考下文中的描述。在另一實施方式中，將至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度與小分子或核酸標志物的豐度一起測定。膜聯(lián)蛋白是鈣結合蛋白，其被認為能影響多種細胞內(nèi)和細胞外功能，包括膜運輸、淋巴細胞遷移、細胞能動性、鈣流動和信號轉導。它們高度豐富，帶負電荷的膜脂的鈣依賴型體積掩飾(bulkmasking)可能對膜聯(lián)蛋白的功能來說是重要的(17)。在以前的蛋白質(zhì)組學研究中比較了來自31名前列腺癌患者的良性和腫瘤組織之間的蛋白豐度差異，發(fā)明人將膜聯(lián)蛋白A3鑒定為腫瘤中豐度差異更為多樣化的，其可能代表著針對前列腺癌多種亞型的診斷標志物。膜聯(lián)蛋白A3是膜聯(lián)蛋白家族中相對少見的成員，其在所有31名患者中被平均上調(diào)了2.4倍(1.1和5.4倍之間，95%置信度；PKX045)。在聚類(cluster)研究暗示的22名患者的試驗性子聚類中，膜聯(lián)蛋白A3被平均上調(diào)了4.4倍(2.2和9.1倍之間，95%置信度；P=0.008),這暗示在某些類型的胂瘤中，膜聯(lián)蛋白A3豐度可能涉及癌性表型。進一步的細節(jié)參見專利申請PCT/EP2005/001567,其整體并入本文。有人報道，若干種膜聯(lián)蛋白相關于前列腺癌被下調(diào)，包括膜聯(lián)蛋白Al、膜聯(lián)蛋白A2、膜聯(lián)蛋白A4、膜聯(lián)蛋白A7和膜聯(lián)蛋白A10(6)。Alaiyaeta.(18)還報道了惡性和良性前列腺組織之間的一些差異(膜聯(lián)蛋白A3)值。近來，膜聯(lián)蛋白A3已被證實在培養(yǎng)的肝細胞中對于DNA復制來說是必要的(19)，并且看起來在較之肝實質(zhì)細胞具有更高的生長潛力和增殖速率的小肝細胞中表達更高(20)。發(fā)明人的結果暗示，通常為該家族稀有成員的膜聯(lián)蛋白A3因此可能為某些患者的癌癥治療提供生物標志物或靶或治療原則。膜聯(lián)蛋白是細胞質(zhì)性的，但是也在細胞外被發(fā)現(xiàn)，雖然它們?nèi)狈Ψ置谝龑蛄?。例如，Carlssonetal.(24)將膜聯(lián)蛋白A3鑒定為男性不育中涉及的抗精子抗體的抗原。Ohetal.(25)發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白Al暴露于實體肺部肺瘤鄰近的上皮表面，在動物實驗中，施予針對該蛋白的放射標記抗體導致胂瘤消退。事實上，膜聯(lián)蛋白A5遷移到細胞表面與凋亡相關(26),也稱為Upocortm1的膜聯(lián)蛋白Al則作為抗炎性劑以高豐度從嗜中性粒細胞和單核細胞/巨謹細胞釋放到細胞外空間。事實上，膜聯(lián)蛋白Al可能是糖皮質(zhì)激素抗炎性作用的主要介體(27，28)。還沒有關于膜聯(lián)蛋白分泌機制的報道將分泌(尤其是膜聯(lián)蛋白A3的細胞排出，胞外體(exosome)途徑)與對前列&i免疫監(jiān)-見(surveillance)的調(diào)控改變結合起來。胞外體是直徑30至100nm的膜腫瘤抗原向抗原呈遞細胞的轉移，還涉及對特異免疫應答的刺激(21)。膜聯(lián)蛋白家族成員，包括膜聯(lián)蛋白A3和膜聯(lián)蛋白A8，在胞外體中被普遍發(fā)現(xiàn)(21-23)。Hegmannetal.(29)已^f叚定，胞外體涉及不存在細胞壞死時熱休克蛋白向細胞外環(huán)境的釋放。胞外體的腔環(huán)境可能允許對提議的體內(nèi)膜聯(lián)蛋白鈣離子通道來說必需的低pH值，由于與細胞存活不相容，這個觀點已被爭論過U7)。事實上，生理性膜聯(lián)蛋白離子通道的被報道例子發(fā)生于造骨細胞骨形成中涉及的基質(zhì)嚢泡中，以及軟骨細胞的終末分化和死亡中(30),這是正常細胞存活的兩種非典型情況。根據(jù)發(fā)明人，膜聯(lián)蛋白離子通道可能涉及胞外體嚢泡的滲透性破裂(與細胞質(zhì)膜分泌性融合之前的多嚢泡性嚢泡中，或者細胞外)，由此調(diào)節(jié)胂瘤或其它組織的細胞外環(huán)境，例如，骨質(zhì)疏松癥的情況下的骨。Bondanzaetal.(31)近來報道，受輻射的肺瘤細胞被巨噬細胞高效吞噬，但是當細胞表面磷脂酰絲氨酸被膜聯(lián)蛋白A5掩飾時，巨噬細胞途徑減弱，并且強的CD8+樹突狀細胞依賴性免疫應答被激發(fā)。參照上文所述，膜聯(lián)蛋白Al是抗炎性調(diào)節(jié)子，其能降低嗜中性粒細胞募集，由此減弱組織炎癥。其結合嗜中性粒細胞和巨噬細胞上特異的細胞外ALX(脂氧素A)受體，由此能調(diào)節(jié)巨噬細胞的吞噬作用(27，28)。在組織內(nèi)的作用位點，膜聯(lián)蛋白A1及其N末端肽(Ac2-26)促進了凋亡嗜中性細胞的吞噬作用，由此降低了炎癥水平以及通過抗炎細胞因子(例如TGF(轉化生長因子)-pi)的免疫應答(28)，以及，由此，Thl(T-協(xié)助細胞1)和Th2(T-協(xié)助細胞2)T細胞的抗原誘導的T細胞增殖也被肽Ac2-26抑制(32)。膜聯(lián)蛋白A3在肺瘤中的改變可能通過改變細胞外膜聯(lián)蛋白池的性質(zhì)和/或濃度，以及由此通過調(diào)節(jié)巨噬細胞/粒細胞主導的應答和/或體液應答之間的相互作用，而影響到對前列腺組織的免疫監(jiān)一見。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，將至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度與至少一種另外的膜聯(lián)蛋白(優(yōu)選地，膜聯(lián)蛋白Al、膜聯(lián)蛋白A2、膜聯(lián)蛋白A3、膜聯(lián)蛋白A4、膜聯(lián)蛋白A5、膜聯(lián)蛋白A6、膜聯(lián)蛋白A7、膜聯(lián)蛋白A8和膜聯(lián)蛋白A10構成的組的膜聯(lián)蛋白)的豐度一起測定。在本發(fā)明的又一種實施方式的情況下，將至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度與下述組的至少另一種蛋白的豐度一起測定，所述組由血清淀粉狀蛋白P、異肽酶T、肌肉類型的脂肪酸結合蛋白、半乳糖凝集素l、熱休克蛋白90、Bip(人類蛋白質(zhì)P11021—78kDa的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白前體，GRP78，免疫球蛋白重鏈結合蛋白，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔Ca2+結合蛋白grp78)、蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶、表皮類型的脂肪酸結合蛋白、烯?；o酶A水合酶和核仁碌酸蛋白(nucleophosmin)構成。此外，可以將至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度與下述組的至少另一種蛋白的豐度一起測定，所述組由14-3-3家族、蛋白酶體(特別是前體和/或macropain)、活化因子亞基2、細胞角蛋白家族、KNP-Iot蛋白(NCBI編號BAA85554.1GI:7768772)和KNP-IP蛋白(NCBI編號BAA21139.1GI:2250701)構成。在一些情況下，對于診斷而言傳統(tǒng)腫瘤標志物的診斷價值是有局限的。例如，高或極低的血清前列腺抗原(PSA)值為前列腺癌提供了合理可靠的診斷參數(shù)。但是，在2至10ng/ml之間，尤其是4至10ng/ml，特別是2至6ng/ml之間的手術前PSA值在診斷可靠性的方面極端沒用，特別是在預測放射性前列腺切除術后的術后治愈率方面。因此，在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的實施方式中，將至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度與至少一種血液或血清標志物(特別是Kallikrem蛋白酶家族的至少一個成員，優(yōu)選地，前列腺特異性抗原(PSA))的豐度一起測定。多種形式的PSA豐度，特別是總PSA(tPSA)的豐度、游離PSA(fPSA)的相對或絕對豐度和復合PSA(cPSA)的相對或絕對豐度可與膜聯(lián)蛋白A3的豐度一起測定。Kallikrem蛋白酶家族的其它成員也可用于該方面，這也在實施方式的范圍內(nèi)。這些蛋白質(zhì)相互之間的豐度也可用來與測量或計算得到的一種或多種膜聯(lián)蛋白參數(shù)組合，用于本發(fā)明的診斷目的?？墒褂玫哪ぢ?lián)蛋白參數(shù)明顯不局限于本文/>開的以闡述方式使用的那些。在又一種優(yōu)選的實施方式的情況下，將至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度與至少一種上皮細胞標志物(特別是前列腺特異性膜抗原(PSMA))—起測定。根據(jù)本發(fā)明的一種尤其優(yōu)選的實施方式，使用膜聯(lián)蛋白A3和/或膜聯(lián)蛋白A8，優(yōu)選膜聯(lián)蛋白A3。才艮據(jù)本發(fā)明，待治療和/或4寺it斷的癌癥可來自泌尿生殖道和/或腸道。優(yōu)選地，癌癥選自前列腺癌、腎癌、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、子宮癌或結腸癌構成的組。優(yōu)選地，待i貪斷的癌癥是前列腺癌和/或結腸癌。就前列腺癌而言，本發(fā)明的方法優(yōu)選能夠?qū)η傲邢侔┙M織樣品、良性前列腺增生(BPH)組織樣品、慢性前列腺炎組織樣品、患纖維化的組織樣品和健康的組織樣品加以區(qū)分。對于腸道癌癥，特別是結腸癌，本發(fā)明的方法優(yōu)選能夠?qū)Π┌Y組織^f品和受炎癥性腸病，特別是受Crohns病和/或潰瘍性結腸炎影響的組織才羊品加以區(qū)分。根據(jù)本發(fā)明的又一種實施方式，有可能治療和/或診斷癌癥亞型。此外，可通過本發(fā)明治療和/或診斷不同的癌癥階段。還可以通過本發(fā)明來監(jiān)測非癌性組織向癌性組織的轉化。在本發(fā)明的又一種優(yōu)選實施方式的情況下，在測定至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度之前，對排泄樣品或其組分，尤其是尿液的，特別是exprimate尿進4亍分離工藝，以產(chǎn)生細胞沉淀團(pellet)和上清液。優(yōu)選地，分離工藝通過離心進行，尤其是通過低速離心將細胞從液體培養(yǎng)基中分離(例如，200xg，5分鐘，4°C),這對于本領域?qū)＜襾碚f是顯而易見的。顯然，任何合適的離心方案，包括在不同條件下連續(xù)離心，或者離心與其它方法的組合都可用于將可溶的或與胞外體結合的膜聯(lián)蛋白與細胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白分離，以用于測量。也可使用將可溶的或與胞外體結合的膜聯(lián)蛋白與細胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白分離的其它方法，或者其組合，這對于本領域?qū)＜襾碚f是顯而易見的(例如，磁珠、過濾、色譜等)。根據(jù)本發(fā)明的又一種實施方式，細胞沉淀團被用來測定至少一種膜聯(lián)蛋白(優(yōu)選膜聯(lián)蛋白A3)的細胞內(nèi)豐度。如上文中已提到的，膜聯(lián)蛋白復雜地參與成骨細胞病(osteoblastosis)和骨質(zhì)溶解。膜聯(lián)蛋白一皮暗示涉及骨的礦物質(zhì)化過程。這是值得注意的，因為前列腺癌的轉移展示出高頻率成骨細胞性骨損傷，這在癌癥中并不常見。大多數(shù)癌癥轉移的特征在于破骨細胞的溶骨(骨溶解)活性，而前列腺轉移則既展示出破骨細胞活性又展示出礦物質(zhì)沉積性成骨活性。生理礦物質(zhì)化是高度復雜并且受調(diào)控的過程。骨礦物質(zhì)化由被稱為基質(zhì)嚢泡的小嚢泡起始，所述嚢泡是從正礦物質(zhì)化的骨骼細胞的質(zhì)膜釋放的。最初的礦物化階段在基質(zhì)嚢泡內(nèi)形成。由于這些是膜封閉的，因此需要通道蛋白用于礦物質(zhì)離子進入。膜聯(lián)蛋白形成Ca^進入基質(zhì)嚢泡的通道，使得磷酸鈣礦物質(zhì)化得以起始。一旦嚢泡內(nèi)晶體達到一定尺寸，它們就會使得膜破裂。這進而與炎癥相關(炎癥是癌癥和膜聯(lián)蛋白生物學的共同特征)，并且還涉及骨和免疫系統(tǒng)之間的相互影響。因此，根據(jù)一種特別優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的方法可用于診斷和/或治療骨質(zhì)疏松癥。在本發(fā)明方法的一種特別的實施方式中，尤其是通過本領域技術人員已知的方法，測定體液、身體分泌物、組織樣品、細胞群或細胞中的膜聯(lián)蛋白豐度，優(yōu)選膜聯(lián)蛋白A3和/或膜聯(lián)蛋白A8的豐度，以診斷和/或治療骨質(zhì)疏松癥。此類治療可包括應用能影響膜聯(lián)蛋白豐度、亞細胞/細胞外定位、翻i,后4奮飾或活性的物質(zhì)。在該方面，活性尤其包括離子通道活性，其可被適當增加或降低?？捎糜谥委煿琴|(zhì)疏松癥的物質(zhì)明確包括膜聯(lián)蛋白A3，其截短形式或突變體形式，或抗體或其它親和試劑，特別是本領域已知的那些。所述物質(zhì)還可包括核酸或化學相關物質(zhì)，例如肽核酸(pNA)，其還可用小干擾RNA(siRNA),特別是本領域已知的那些。圖3、圖4和圖5分別展示了對來自被診斷患有癌癥、良性前列腺增生(BPH)或具有被診斷為與癌癥無關的病癥的對照患者的exprimate按摩得到的前列腺尿細胞沉淀團的蛋白質(zhì)分析例子。圖3至圖5中每張圖的上圖展示了被膜聯(lián)蛋白A3增強的蛋白質(zhì)印跡化學發(fā)光(ECL)信號，下圖展示了用PonceauS染色的全部上樣的蛋白質(zhì)信號("蛋白質(zhì)")。每塊凝膠都含有分子量梯度標記(M)以及作為陽性對照(+C)的7.5)ig總細胞蛋白裂解物(來自前列腺肺瘤，其中含有膜聯(lián)蛋白A3)的雙4分重復。通過相對于重復的各陽性對照的平均值歸一化，來對不同凝膠上來自樣品的膜聯(lián)蛋白A3信號加以比較。本發(fā)明人在初步研究中發(fā)現(xiàn)，癌癥患者的exprimate尿樣的沉淀團所具有的膜聯(lián)蛋白A3比良性前列腺增生(BPH)患者或者健康對照患者都要少得多(圖6)。例如，以PR-26CA中膜聯(lián)蛋白A3信號(豐度)的量的0.2倍作為參考值，癌癥患者中僅5/30(5:25)份exprimate尿樣超過了0.2倍這個參考值，而BPH患者的exprimate尿樣中23/30(23:7)，健康對照患者的expnmate尿樣中18/30(18:12)都超過了該參考值。這些結果顯示，平均而言，較之來自BPH患者或健康對照患者的expnmate尿樣而言，來自癌癥患者的exprimate尿樣的這些細胞沉淀團含有較少的膜聯(lián)蛋白A3。根據(jù)本發(fā)明的又一實施方式，來自對尿樣(特別是expr皿ate尿樣)及其組分進行的分離工藝的上清液被用于測定至少一種膜聯(lián)蛋白(優(yōu)選地，膜聯(lián)蛋白A3)的細胞外豐度。特別優(yōu)選使用上清液用于診斷癌癥(特別是泌尿生殖道和/或腸道癌癥)和/或用于區(qū)分癌性組織和非癌性組織。在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施方式的情況下，在測定至少一種膜聯(lián)蛋白(優(yōu)選膜聯(lián)蛋白A3)的豐度之前，向尿樣或其組分中加入陽離子螯合劑，尤其是Ca^-螯合劑，特別是EDTA和/或EGTA。在一種優(yōu)選的實施方式中，在對樣品或其組分進行分離工藝之前加入陽離子螯合劑。優(yōu)選地，對至少一種細胞外膜聯(lián)蛋白(尤其是膜聯(lián)蛋白A3)豐度的測定在經(jīng)過陽離子螯合劑處理(特別是經(jīng)EDTA和/或EGTA處理)的上清液中進行，并用于與缺乏陽離子螯合劑(特別是EDTA和/或EGTA)的上清液比較。優(yōu)選地，從同樣的尿樣(特別是expnmate尿樣)或其組分獲得上清液。前列腺癌發(fā)展期間，特別是膜聯(lián)蛋白A3從細胞內(nèi)向細胞外的轉移受到不同影響，基于該理由，本發(fā)明包括下述測定測定膜聯(lián)蛋白A3的細胞內(nèi)/細胞外定位是否有與癌癥相關的任何不同。在本文上文中已提及，細胞外環(huán)境應當被理解為包括細胞質(zhì)膜外表面在內(nèi)的細胞外空間。臨床前列腺按摩后獲得的expnmate尿含有從前列腺流出的細胞。與胞外體中細胞外膜聯(lián)蛋白A3的可能性一樣，游離膜聯(lián)蛋白A3能與帶負電荷基團(例如細胞表面上的磷脂)以鈣依賴性方式結合。可通過向培養(yǎng)基中添加EDTA/EGTA以螯合4丐，將后一種膜聯(lián)蛋白A3組分從細胞表面釋放進上清液。在雙盲四中心研究中進行的進一步調(diào)查表明，沉淀團總膜聯(lián)蛋白A3相對上清液的比例能診斷出非癌癥患者組中標記為纖維化的病例。纖維化與良性過程相關，表明非癌癥。對總共103個非癌癥病例而言，關于"pu.anx.tot.ratio"，AUROC為0.7072。該比例的相關性為負，由此上清液中增加的總膜聯(lián)蛋白A3的量對于分選進該組來說是關鍵的。這對于癌癥病例來說也是合理的，上清液中減少的膜聯(lián)蛋白A3被觀察到(見下文)。通過沉淀團/上清液中膜聯(lián)蛋白A3的比例對非癌癥患者(BPH、慢性前列腺炎、纖維化、PIN1-3)的進一步描述是本發(fā)明的一個重要方面，以在癌癥對非癌癥的it斷決定之外還隨后進行依次的和/或多參H步驟的數(shù)據(jù)分析。此外，發(fā)明人針對單獨的、獨立系列的患者測定了上清液和細胞沉淀團中的膜聯(lián)蛋白3的豐度，并對exprimate尿樣的細胞沉淀團和上清液中相對膜聯(lián)蛋白A3豐度進行了比較。針對該不同患者群體，發(fā)明人再次發(fā)現(xiàn)，來自癌癥患者的exprimate尿樣沉淀團中的膜聯(lián)蛋白A3的豐度要低于來自BPH患者或健康患者的expnmate尿樣沉淀團中膜聯(lián)蛋白A3的豐度。在上清液方面，在用EDTA處理過的癌癥患者exprimate尿樣上清液中，來自這些患者的膜聯(lián)蛋白A3豐度比用EDTA處理過的BPH患者或健康患者的exprimate尿樣上清液中的豐度要高。exprimate尿的細胞外(EDTA處理過的上清液)和細胞內(nèi)(1000xg細胞團)組分的各比例給出了更加清晰的圖象，如圖7所示?？傮w考慮，這些數(shù)據(jù)表明了大約或低于10%的假陽性率，此外，上清液(膜聯(lián)蛋白A3-S)對沉淀團(膜聯(lián)蛋白A3-P)中膜聯(lián)蛋白A3表達的比例使得能對癌癥、VPH、對照加以區(qū)分，如表l所示基本上，膜聯(lián)蛋白A3-S在癌癥和BPH中高，在對照中低，而膜聯(lián)蛋白A3-P在BPH和對照中高，在癌癥中低；由此癌癥為高S(或S/P)低P;BPH為高S(或S/P)高P;對照為低S(S/P)和高P;各比例(S/P)較之沉淀團單獨時給出了最為清楚的圖象(圖7)。對于蛋白豐度的額外校正進一步改善了圖象。根據(jù)本發(fā)明的又一實施方式，通過免疫組織化學方法，特別是使用組織樣品，例如組織切片來測定至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度，優(yōu)選地，膜聯(lián)蛋白A3。本發(fā)明還包括至少一種抗膜聯(lián)蛋白抗體(特別是抗膜聯(lián)蛋白A3抗體)用于診斷癌癥(特別是泌尿生殖道和/或腸道癌癥)和/或用于區(qū)分癌性和非癌性組織的用途。在一種優(yōu)選的實施方式中，用抗膜聯(lián)蛋白抗體對組織樣品(特別是組織切片)進行病理組織-診斷染色?？梢酝ㄟ^活檢或完全組織切割獲得樣品。特別地，在切除(protectomy)之后，從前列腺活檢或前列腺組織獲得待通過抗膜聯(lián)蛋白抗體染色的組織樣口卩0獲得含有針對膜聯(lián)蛋白A3的抗體的多克隆兔血清，將其用于通過免疫組織化學在前列腺組織中對膜聯(lián)蛋白A3加以定位。因為膜聯(lián)蛋白家族有大量成員，發(fā)明人在免疫組織化學之前通過蛋白質(zhì)印跡分析了抗膜聯(lián)蛋白A3多克隆抗體的特異性。通過對前列腺良性和癌癥組織細胞裂解物進行蛋白質(zhì)印跡獲得的信號的絕大部分都來自膜聯(lián)蛋白A3(圖1)。對于更高分子量的蛋白，觀察到了信號的較小豐度，這被推定為膜聯(lián)蛋白A6。在同樣的條件下使用大約120ng重組的60kDAGST(谷胱甘肽-S-轉移酶)-膜聯(lián)蛋白A3,該抗體產(chǎn)生了強且清楚的條帶?；趤碜曰顧z的2D凝膠的放射活性值、來自活檢和exprimate尿的1D和2D蛋白質(zhì)染色以及1D和2D凝膠蛋白印跡，完全定量導致將exprimate尿樣蛋白濃度檢測限確定為0.02至>15ng/ml的范圍。該檢測限略低于但接近O.Olng/ml。就蛋白質(zhì)含量而言，范圍為從O.OOl至超過0.3ngg總蛋白。因此，該抗體在免疫組織化學里主要識別膜聯(lián)蛋白A3是可能的，如圖2所示，其中相對應的膜聯(lián)蛋白A3信號在健康前列腺中局限于上皮細胞，但在胂瘤中還出現(xiàn)于癌性細胞。早期癌癥中，間質(zhì)細胞展示出了增強的染色。在前列腺癌和BPH組織中膜聯(lián)蛋白A3存在差異的機制原理試驗性地表明較之對照而言，存在從更局部的、細胞內(nèi)的總體較低的表達向細胞外的、總體較高的表達的轉變。膜聯(lián)蛋白A3染色分布暗示了胞質(zhì)和膜定位(圖2)，雖然癌癥病例中單個細胞中染色的總體水平看起來比良性組織的要低(圖2)，但在同樣的癌癥組織中膜聯(lián)蛋白A3的總體水平卻更高(例如圖1)，這可通過下述理由來解釋在癌性組織中存在更多的含有膜聯(lián)蛋白A3的細胞，和/或在癌性組織中存在更多的細胞外膜聯(lián)蛋白A3。在廣泛的研究(四中心、雙盲)中，觀察到在患有癌癥的患者的exprimate尿上清液中膜聯(lián)蛋白A3水平降低，該研究考慮并首次測量了250名患者exprimate尿上清液和沉淀團中膜聯(lián)蛋白總量，并且還對嗜中性粒細胞對膜聯(lián)蛋白A3信號的可能貢獻進行了定量(通過對嗜中性粒細胞標志物NGAL進行平行定量來實現(xiàn))?？傮w而言，該結果表明，在具有纖維化/EPH的非癌癥患者的exprimate尿中觀察到了比癌癥患者更高水平的膜聯(lián)蛋白A3,但是，在非exprimate常規(guī)尿中，這些水平顯著降低至可以忽略。因此，我們推斷，在exprimate尿中測量的膜聯(lián)蛋白A3主要來自前列腺，并且作為前列腺按摩過程的后果釋放進尿。上文已顯示膜聯(lián)蛋白A3主要在健康前列腺的導管上皮細胞中表達。為單獨區(qū)分癌癥和非癌癥，本發(fā)明的數(shù)據(jù)表明，上清液中膜聯(lián)蛋白A3的量具有最大診斷價值(對于初始PSA值在4-10之間的前列腺癌患者的expnmate尿的上清液中總的膜聯(lián)蛋白A3以及每fig蛋白中的膜聯(lián)蛋白A3的組合讀數(shù)而言，AUROC值為0.78-0.82)。在更高NGAL值的情況下觀察到了沉淀團-膜聯(lián)蛋白A3的波動；由此對于沉淀團膜聯(lián)蛋白A3而言相應的AUROC值在0.55至0.65的范圍內(nèi))。還已知，在患有癌癥的前列腺中，僅一'卜部分上皮導管細胞是癌性的，因此，根據(jù)邏輯推理，測量得到的、細胞外膜聯(lián)蛋白A3豐度的差異應當不顯著。但是，在癌癥患者的exprimate尿中，觀察到了相對于非癌性患者而言相當大并且顯著的平均膜聯(lián)蛋白A3豐度降低。為何出現(xiàn)這種情況無法從原理上解釋，因為根據(jù)直覺上的傳統(tǒng)觀點，非癌性上皮細胞應當持續(xù)分泌膜聯(lián)蛋白A3。可能是，癌癥的存在導致分泌反式作用物質(zhì)(例如細胞因子)，所述反式作用物質(zhì)影響膜聯(lián)蛋白A3從具有癌性損傷的前列腺中的大量上皮細胞分泌。這種反式作用因子是來自癌性細胞本身還是來自其它細胞尚不清楚。有大量文獻表明反式作用因子影響癌性細胞及其間葉(mesenchymal)/間質(zhì)環(huán)境，反之亦然。無論何種機制使然，這種經(jīng)驗性的觀察雖不明確，但是卻令人吃驚地清楚表明，exprimate尿中膜聯(lián)蛋白A3的較低水平提供了針對患者前列腺中有肺瘤細胞的可能性的預測手段。exprimate尿中膜聯(lián)蛋白A3水平的診斷用途可與其它診斷參數(shù)(例如前列腺特異性抗原(PSA))組合，如實施例所示。這些結果還表明，膜聯(lián)蛋白A3蛋白的存在與健康表型相關。因此，可以通過提高細胞外膜聯(lián)蛋白A3的水平，將膜聯(lián)蛋白A3蛋白應用于治療手段中，以治療癌癥。觀察到的結果的機制尚在研究中，它們可能反映了完全健康的前列腺上皮細胞向非癌性階段(纖維化/BPH)的某種類型的轉變，這與膜聯(lián)蛋白A3在exprimate尿的沉淀團和上清液中升高的水平相關，總膜聯(lián)蛋白A3的上述比例(p/s)具有最高診斷價值。在癌癥中，與癌癥患者exprimate尿上清液中膜if關蛋白A3的量減少有著明顯且令人吃驚的關系；沉淀團膜聯(lián)蛋白A3的量看起來是有NGAL陽性白細胞/嗜中性粒細胞的污染貢獻。因此，最好測量沉淀團和上清液中的膜聯(lián)蛋白A3水平。蛋白質(zhì)水平上的這種信息并不能通過基因組的方法獲得，例如，如美國專利申請US2003/0108963A1簡單提及但并未證實的?？偠灾?，膜聯(lián)蛋白A3顯示為一在健康組織中主要是細胞內(nèi)染色，在早期癌性組織中為上皮外分布而晚期癌癥則顯示為癌癥細月包中膜聯(lián)蛋白A3染色顯著降低。根據(jù)本發(fā)明的又一實施方式，從尿，特別是從exprimate尿(前列腺按摩之后回收的，特別是直腸手指插入后)中獲得尿樣或其組分。在本發(fā)明的又一實施方式中，對尿樣或其組分加以純化，特別是使其不含嗜中性粒細胞、單核細胞或外周血單核細胞(PMBC),尤其是通過磁珠來純化。優(yōu)選地，使用晨尿樣品或其組分。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，在糞便或腸道上皮細胞中測量膜聯(lián)蛋白水平。此外，膜聯(lián)蛋白水平可用于在糞便的任何組分或制備物(任何可能是產(chǎn)生胞外體的上皮表面)中治療和/或診斷胃腸道上皮癌癥。膜聯(lián)蛋白水平還可用于治療和/或診斷結直腸癌癥。才艮據(jù)一種優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的方法可與對嗜中性粒細胞，特別是鈣衛(wèi)蛋白(calprotectm)和/或與嗜中性粒細胞白明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)的測定組合，以區(qū)分炎癥(Crohn病或潰瘍性結腸炎)和癌癥。至少一種膜聯(lián)蛋白，優(yōu)選地，膜聯(lián)蛋白A3和/或膜聯(lián)蛋白A8,特別是膜聯(lián)蛋白A3可用作本說明書公開的疾病的(特別而言，針對前列腺癌、結直腸癌和/或骨質(zhì)疏松癥，優(yōu)選針對其亞型的)診斷標志物和/或治療靶標，這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。才艮據(jù)本發(fā)明，可對癌癥，特別是泌尿生殖道和/或腸道癌癥加以治療。這優(yōu)選通過提高至少一種膜聯(lián)蛋白(例如，至少一種細胞外膜聯(lián)蛋白)的體內(nèi)豐度來實現(xiàn)。此外，本發(fā)明-使得能對癌癥，特別是泌尿生殖道和/或腸道癌癥進行診斷，和/或允許區(qū)分癌性和非癌性組織。這具體是通過分別測定膜聯(lián)蛋與其它蛋白質(zhì)相應比例的測定組合。優(yōu)選地，對癌癥的診斷和/或?qū)Π┬院头前┬越M織的區(qū)別基于至少一種膜聯(lián)蛋白的細胞外豐度。測得的蛋白質(zhì)比例和豐度分別揭示了癌性和非癌性組織之間的差異，由此允許對患者作出分析。因此，膜聯(lián)蛋白，特別是膜聯(lián)蛋白A3是可靠的診斷標志物，其甚至可以完全取代傳統(tǒng)用于癌癥it斷的腫瘤標志物。為對本發(fā)明進行更為詳細的描述，現(xiàn)在將參考附表和附圖表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表l:對診斷結果的概括，癌癥患者exprimate尿樣沉淀團中膜聯(lián)蛋白A3的豐度(膜聯(lián)蛋白A3-P)低，而在BPH患者和健康患者exprimate尿樣相應的沉淀團中則較高。對于exprimate尿樣上清液中膜聯(lián)蛋白A3的豐度(膜聯(lián)蛋白A3-S)而言，存在不同的情況對健康患者來說它們較低，而對于癌癥和BPH患者來說則較高。組合起來的讀數(shù)能以表的靠下部分所示的lt量正確分選出三種情況。更多細節(jié)參見上文的詳細+兌明。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表2.從exprimate尿上清液和沉淀團組分測量的蛋白參數(shù)表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3:對實施例4中所用縮寫和變量的說明。表4:<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表4:針對給出的變量參數(shù)的ROC曲線分析結果(描述見表3),這是在根據(jù)4-10ng/mL之間的PSA值分組的患者上進行的。試驗參數(shù)、得到的AUROC值以及每項分析包括的患者數(shù)被列為表格。表5:<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表5:針對給出的變量參數(shù)的ROC曲線分析結果(描述見表3)，這是在根據(jù)2-6ng/mL之間的PSA值分組的患者上進行的。試驗參數(shù)、得到的AUROC值以及每項分析包括的患者數(shù)被列為表格。表6:<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表6:針對給出的變量參數(shù)的ROC曲線分析結果(描述見表3)，這是在所有患者(包括所有PSA值)上進行的。試驗參數(shù)、得到的AUROC<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>Sens=壽丈感性Spec.二敏感性特異性+01=陽性似然比例-LR二陰性似然比例十PV^陽,)"生予貞測(predictive){直-PV—月性預測值表7:對應于圖9的ROC曲線的數(shù)據(jù)。表8和9描述了最大似然估值模型。表8:參數(shù)DF估計誤差(標準)卡方(Wald)Pr>ChiSq截距1-2.38601.74611.86730.1718UgPUANXtot1-0.47470.139411.59080.0007LogPSAini13.29421.019810.43430.0012表8:針對logit模型的筒明(condensed)SAS輸出，其產(chǎn)生了comb.var.anx.psa2:只于最大4以然4古i十的分沖斤。表9:<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表9:針對logit模型的簡明SAS輸出，其產(chǎn)生了comb.var.anx.psa2:優(yōu)勢比估計。圖1:通過蛋白質(zhì)印跡對抗膜聯(lián)蛋白A3兔多克隆抗血清的分析。(A)1-DSDS湊是月交的蛋白質(zhì)印跡。泳道l:MagicMark(Invitrogen)分子量標記，每泳道3pg，其l合出了120、100、80、60、50、40、30和20kDa的質(zhì)量。重復的泳道含有從患者29的癌癥(泳道2-4)和良性(泳道5-7)前列腺提取的15全組織蛋白。使用抗膜聯(lián)蛋白3多克隆血清(1:20,000)孵育濾器。泳道l-7展示出來自整個濾器的信號的假彩色圖像?？蛑械牟迦氩糠?泳道l'和2')展示了泳道1和2的單色圖案。示出了膜聯(lián)蛋白A3以及接著的膜聯(lián)蛋白A6條帶的位置。(B)對來自患者29的癌癥樣品的蛋白質(zhì)100(ig提取物進行的2D-PAGE蛋白質(zhì)印跡以假彩色顯示了與多克隆血清具有交叉反應性的蛋白質(zhì)分布。通過MALDI-TOFPMF驗證了三個最強(紅色)的膜聯(lián)蛋白A3點的身份(數(shù)據(jù)未示出)，其中最強的對應于我們蛋白質(zhì)組分析中檢測到的蛋白質(zhì)點。圖2:對膜聯(lián)蛋白3的免疫組織化學分析在A)良性前列腺組織的上皮細胞中發(fā)現(xiàn)了抗膜聯(lián)蛋白A3多克隆血清(1:100稀釋)的膜聯(lián)蛋白A3免疫反應性。在B)cribbnform前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)和C)癌癥組織中，對上皮細胞和癌細胞加以染色。還觀察到了升高水平的擴散的上皮外定位。棕色表示膜聯(lián)蛋白A3特異性過氧化物酶染色。藍色代表用Gill蘇木精溶液(Sigma)進行的組織復染。圖3:對從癌癥患者前列腺按摩之后獲得的尿的expnmate沉淀團中的月莢聯(lián)蛋白A3的蛋白質(zhì)印跡定量。上圖展示了印跡蛋白質(zhì)的化學發(fā)光膜聯(lián)蛋白A3信號。下圖展示了用PonceauS("蛋白質(zhì)")染色的上樣蛋白質(zhì)。每塊凝膠都含有分子量梯度標記以及作為陽性對照的雙份7.5pg總細胞蛋白裂解物(來自前列腺肺瘤，其中含有膜聯(lián)蛋白A3)(+C)。圖4:對BPH患者前列腺按摩之后獲得的尿的expnmate沉淀團中的膜聯(lián)蛋白A3的蛋白質(zhì)印跡定量。其它細節(jié)遵循圖3。圖5:對非癌癥對照患者前列腺按摩之后獲得的尿的exprimate沉淀團中的膜聯(lián)蛋白A3的蛋白質(zhì)印跡定量。其它細節(jié)遵循圖3。圖6:如圖3至圖5所示的、來自前列腺按摩后患者尿的細胞沉淀團的標準化膜聯(lián)蛋白A3信號。來自不同凝膠的膜聯(lián)蛋白A3值被標準化為7.5Hg總細胞蛋白裂解物(來自前列腺腫瘤，PR-26CA,含有膜聯(lián)蛋白A3，作為圖3至圖5中每一幅的陽性對照)的任意單位。圖7:前列腺按摩后(另外的患者材料，不包含在圖6中)，患者exprimate尿樣的經(jīng)EDTA處理后的上清液和細胞沉淀團的膜聯(lián)蛋白A3含量之比，a.u.是^壬意單^立。圖8:ROC曲線-兩步程序1:"UseU一ANX—totif2.5sPSA—inis12,mostobviousdecisionotherwise"圖例變量(VARIABLE)=IF(PSA—ini<2.5;100000;IF(PSA—mi<=12;u—anx—tot;0))twostepvar1分類變量(CLASSIFICATIONVARIABLE):PCa陽性組PCa=l樣本大小=137陰性組PCa=0樣本大小=101發(fā)病率(％)=57.6ROC曲線下的面積=0.740標準差=0.03395%置信區(qū)間=0.679至0.794P(面積=0.5)<0扁1圖9:ROC曲線-Tcomb.var.anx.psa2:5-2.386+3.2941og(1+PSA—ini)-0.4751og(1+PU一ANXtot)圖例選擇AND(PSA—im〉=2;PSA—mi<=6)分類變量PCa陽性組PCa=l，樣本大小=57陰性組PCa=0，樣本大小=52發(fā)病率(％)=52.3ROC曲線下面積=0.791標準差=0.04395%置信區(qū)間=0.703至0.863P(面積=0.5)<0扁1實施例雖然將參照實施例對本發(fā)明進行更詳細的描述，但是本發(fā)明并不會以任4可方式受限于這些實施例。實施例1對前列腺按摩后的尿進4于處理在對血液前列腺特異性抗原(PSA)豐度的篩選顯示了升高的癌癥風險后，從經(jīng)歷臨床檢查的患者獲得前列腺按摩exprimate尿。將通過直腸手指插入進行劇烈前列腺按摩之后獲得的47ml尿加入預先冷卻至0。C的3ml0.5MEDTA,pH8，立即冷卻至0°C。如果尿體積小于47ml,用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液補足體積。在0。C,于3000rpm下對冷卻的樣品進行30分鐘離心，以產(chǎn)生細胞沉淀團。移出lml上清液小份試樣，冷凍于液氮中，貯藏于-8(TC直到使用。將細胞沉淀團溫和地重懸于2ml冰冷的PBS中，轉移至冰上的Eppendorf管，4妄著于4°C在12000rpm離心5分鐘。移出上清液，沉淀-故冷凍于液氮中，貯藏于-8(TC直到使用。實施例2:蛋白質(zhì)印跡分析按照廠商說明書，使用BioRad-Mini凝膠裝置和帶有1mm間隔和15個孔的12%T聚丙烯酰胺凝膠，來制備用于蛋白質(zhì)印跡分析的SDS-PAGE凝膠?？鼓ぢ?lián)蛋白A3(膜聯(lián)蛋白A3)與下文所述的抗體相同。l:20,000稀壽,。重組GST-膜耳關蛋白A3購自AbnovaCorporation(#ABV0040710002;Lot:T04G01-ANNEXINA3，0.05pg/pl,61kDa)。^吏用ECL檢測方法(Peerce)和基于DIANAIIICCD照相機的化學發(fā)光檢測器(Raytest,Straubenhardt，德國)，用山羊抗兔IgG(SigmaA3937,lot#121K9151)來觀察抗體結合。針對通過重組細菌表達的膜聯(lián)蛋白A3的兔多克隆血清展示出了對于膜聯(lián)蛋白A3的主要特異性，以及針對膜聯(lián)蛋白A6的一些交叉反應性。實施例3:免疫組織化學按照標準的馬辣根過氧化物酶免疫組織化學方案，使用ZymedPicTurePLUS試劑盒(BroadSpectrum，DAB,Zymed,SouthSanFransisco,CA)，使用多克隆抗膜Jf關蛋白A3血清，用5pm石蠟組織切片來進行免疫組織化學分析。在免疫染色后，用Gill蘇木精溶液(Sigma)進4亍復染。實施例使用250名患者的expnmate尿進行臨床研究在針對存在前列腺癌(PCa)被診斷為陽性或陰性的臨床患者exprimate尿中測定膜聯(lián)蛋白A3水平。檢測多種額外參數(shù)，例如血液中的前列腺特異性抗原(PSA)水平以及下文列出的其它變量。按照實施例1所述來收集樣品，但是不向尿中加入EDTA。在前列腺按摩后，收集全部exprimate尿體積并進行記錄。立即在尿的小份試樣上進行Combur-10-Test(RocheDiagnosticsCat.No.11203479),以記錄比重、pH、白細胞數(shù)和亞硝酸鹽、蛋白質(zhì)、葡萄糖、酮、尿膽素原(urobilinogen)、膽紅素和紅細月包的水平。然后在室溫下以1000xg對尿進4亍15分鐘離心。分開才喿作該上清液的細月包沉淀團和上清液。在去除最后的痕量上清液后，將沉淀團重新懸浮于1ml冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水，冷凍于液氮中或者冰凍C02上。2x1.8ml的單獨小份試樣和大至2x50ml的上清液被類似地冷凍。解凍冷凍的蛋白樣品，加入1/100體積的2%脫氧膽酸鹽，接著進行震蕩，然后加入1/10體積的三氯乙酸，震蕩，在0。C孵育10分鐘。這之后是在4。C于10000xg離心is分鐘以沉淀蛋白質(zhì)。取出上清液，通過劇烈震蕩沉淀團，用冰冷的80%丙酮對沉淀團進行三次洗滌，以完全除去殘余的TCA，在每次洗滌后之后是按照前文所述于10000xg重新離心。最后一次離心之后，取出上清液，令沉淀團空氣干燥2分鐘，注意不要使得沉淀團完全脫水。將沉淀團重新懸浮于煮沸的XT樣品緩沖液(1xXT-緩沖液141mMTris-Base;106mMTns-HCl;2%SDS;BPB;pH大約8.5;50mMDTT;35%甘油)中。按照廠商說明書，通過將給定體積的每種樣品上樣至一維SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠(CriterionXT-precast凝膠BioradCat#345-0119,lot#CX070706B2)(其含有校正量的來自全肝細胞裂解物的大鼠蛋白質(zhì)的一系列稀釋液)，以及在BioRadCriterion電泳設備上進行電泳，來估計每份樣品的蛋白濃度。根據(jù)廠商說明書，使用SyproRuby對凝膠進行染色。筒言之，在含有50%甲醇、7%乙酸的水性溶液中對凝月交固定2x30分鐘，接著在SyproRuby溶液(MolecularProbes，#S12001)中染色過夜。在10%甲醇、7%乙酸中對凝膠洗30分鐘，然后再在水中洗2x5分鐘。用基于DianaIIICCD的數(shù)字成像儀(RaytestIsotopenmessgerateGmbH,Streaubenhard,德、國SyproFilter,605nm)對用SyproRuby染色蛋白質(zhì)進行定量。在標準蛋白質(zhì)和患者尿樣之間比較SyproRuby染色的凝膠泳道的蛋白質(zhì)染色強度。對于上清液而言，使用整條泳道來進行測定。對于尿沉淀團樣品而言，僅考慮主要的尿調(diào)素(uromodulm)條帶下的泳道面積，產(chǎn)生"經(jīng)尿調(diào)素校正的蛋白濃度"。通過將標準化的蛋白量上樣至上文描述過的SDS-PAGE凝膠，來定量膜聯(lián)蛋白A3和嗜中性粒細胞白明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL，SWISSPROT編號P80188，嗜中性粒細胞標志物)的水平，由此每塊凝膠含有三條重復的2|ig經(jīng)標準化的蛋白質(zhì)提取物(來自PC3人前列腺癌細胞系)泳道，其含有方便的參考量的膜聯(lián)蛋白A3和NGAL。按照標準方法，將來自這些凝膠的蛋白質(zhì)轉印到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，在15V恒定電壓和3mA/cm2的限度下運行1.5小時。通過在含有5%重新溶解的干燥奶粉的TBS(175mMNaCl、3.5mMKC1、20mMTris,pH7.4)中輕柔振蕩下孵育2小時，封閉轉印膜上非特異性蛋白結合位點。加入特異于膜聯(lián)蛋白A3(1:20000稀釋，多克隆兔抗人膜聯(lián)蛋白A3)或NGAL(1:500稀釋，抗人Lipocalm,多克隆的，來自山羊，R&DSystems,Nr.AF1757,lotJBH025051)的一抗。在室溫下溫育2小時后，移除緩沖液，用TBS洗三次，每次10分鐘，然后與合適的針對兔IgG(山羊抗兔IgG，用人IgG和小鼠IgG預吸收過，與馬辣根過氧化物酶偶聯(lián)。SantaCruz,#sc-2054，lot#G2005.1:5000稀釋)或山羊IgG(抗山羊IgG,來自兔，用人IgG和小鼠IgG預吸收過，與馬辣根過氧化物酶偶聯(lián)。SantaCmz，#sc-2922,lot#C1405.1:5000稀釋)的各自的二抗孵育。在加入SuperSignalWestDura,Pierce(0.1ml/cm2)后測量增強的化學發(fā)光(ECL)。將NGAL或膜聯(lián)蛋白A3信號的值標準化至每塊凝膠上的三條參考PC3泳道中的每一條的平均信號，將經(jīng)標準化的膜聯(lián)蛋白A3或NGAL值進行統(tǒng)計分析。從這些值計算相對于絕對樣品體積而言的兩種蛋白水平，并標準化至蛋白濃度。分別針對沉淀團和上清液計算這些值，以及針對沉淀團/上清液之比來計算。表2概括了與癌癥相關并且與PSA值相比較的參數(shù)。在標準的直腸指才全(digitalrectalexamination,DRE)期間，i己錄的臨床參數(shù)包括血液PSA值、游離的總PSA水平以及復合PSA水平以及對前列腺組織活檢的組織學評估，這些是在取得expnmate尿之后獲得的。在高水平的血清PSA和DRE表明了前列腺切除術的必要性的情況下，在該材料上進行組織學評估，而無須生物活檢。上述數(shù)據(jù)參數(shù)被包括于統(tǒng)計學分析中，該分析還包括醫(yī)院記錄的臨床數(shù)據(jù)。從所有患者獲得前列腺活檢或前列腺切除物，臨床醫(yī)師基于對所述組織的組織學才全查進行PCa陽性或陰性的診斷。血液PSA水平也是根據(jù)標準臨床操作獲得的。美國食品與藥品管理局(FDA)已批準將PSA試驗用于在年齡50歲及以上的男性中進行的前列腺癌篩查。4至10ng/mL(納克每毫升)之間的PSA水平被認為是可疑的，應當之后進行直腸超聲顯像，并且，如果有所指示的話，進行活檢。PSA在假陽性和假陰性方面都是易錯的。在具有4.0ng/mL或更少的PSA水平的男性中通過活檢發(fā)現(xiàn)前列腺癌(包括高級別的癌癥)的現(xiàn)象并不少見，盡管這樣的PSA水平通常被認為在正常范圍內(nèi)。數(shù)據(jù)組由來自250名患者的組合數(shù)據(jù)文件構成。最初的PSA值在250患者的243名中都是可獲得的，但7名患者缺少該數(shù)據(jù)。此外，這7名患者中的2名以及另外5名患者缺少活檢組織學結果(是否為前列腺癌癥)。因此，本文給出的所有結果僅使用了PCa狀態(tài)已知的243名患者的數(shù)據(jù)140名患者具有陽性PCa診斷，而103名具有陰性PCa診斷。在圖8和9中，使用針對所有ROC曲線而非PSA的相反數(shù)(inversevalue)給出了使用臨床結果產(chǎn)生的接收者工作特征(ROC)曲線，即，觀察到ROC曲線下的面積與癌癥患者中較高的PSA值相關，并且與針對癌癥患者測量的較低的平均膜聯(lián)蛋白A3信號相關。針對PSA的ROC曲線下面積(AUROC)為0.684,這與0.5的AUROC顯著不同，但是人為地略高是由于進入診所的患者招募所致(對于本領域每位專家來說這是已知的)。但是我們確實注意到，我們的患者群體具有不尋常高比例的癌癥患者(57%),因為一些患者是在其它中心提供了高PSA讀數(shù)后被我們的試驗診所檢查的。針對測量的基于個體膜聯(lián)蛋白A3的變量的AUROC值在同樣的范圍內(nèi)(最大為PU—ANX-tot，AUROC0.666;數(shù)據(jù)未示出)，并且也顯著不同于0.5。因此，考慮到PSA值的整個范圍，還可使用膜聯(lián)蛋白A3完全代替PSA，因為在PSA的關鍵的灰色區(qū)域(2-6ng/ml和4-10ng/ml),膜聯(lián)蛋白3具有相當大的優(yōu)勢(見表4-6中的ROC曲線0.78和0.791),在可接受的敏感性下具有高特異性，并且展示出相似的總體表現(xiàn)。在我們的患者選擇中沒有針對膜聯(lián)蛋白A3的預選擇，在膜聯(lián)蛋白A3值和PSA值之間也沒有關聯(lián)，這表明膜聯(lián)蛋白A3表達/分泌和PSA進入血流是通過不同的機制調(diào)控的。我們沒有觀察到PSA或膜聯(lián)蛋白A3水平與患者年齡之間的聯(lián)系。我們推測，可能是高比例的癌癥陽性患者(其中一些是基于在其它中心測量到的可疑的高PSA值而被預選出來的)擾亂了隨著年齡增加而預計的更高PSA水平豐度。但是，因為膜聯(lián)蛋白A3沒有被預選過，因此我們推斷，其水平可能并非年齡相關的。我們對最初PSA值在2ng/mL至6ng/mL區(qū)間內(nèi)的患者亞群體的統(tǒng)計分析投入了特別的關注。針對測量到的個體參數(shù)的所有七個AUROC值與0.5顯著不同，雖然僅有57名PCa患者和52名非PCa患者達到了定義該亞群的PSA判斷標準。與總體結果相反，PSA—im的AUROC不再是最大的一個，而是低于基于膜聯(lián)蛋白A3變量的六個AUROC值中的五個(P—ANX—ug是唯一例外)。最高的AUROC值，0.735是PU—ANX—tot獲得的。除了2ng/mL陽6ng/mL的PSA范圍之外，2.5mg/mL-12ng/mL也是被特別關注的在該亞群中，PSA—mi自身表現(xiàn)很差(AUROC0.580),而U—ANX-tot表現(xiàn)最好(AUROC0.693)。因此，該PSA范圍看起來適于評估下述兩步程序(通過方法性闡述示出)的特征在第一步中，根據(jù)其最初的PSA值將患者分入三組之一PSA—im<2.5—〉低PCa風險，PSA—mi〉12—>高PCa風險，PSA—mi在[2.5，12]—>應用基于U—ANX—tot的試驗作為第二步，確定是否要進行侵入性診斷程序。(在圖8的標題中前兩種情況被稱為"最明顯的決定")。然后通過下述定義，將該兩步程序包括進單個變量，此處稱為twostepvarl<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>低的U—ANX—tot值表明前列腺癌風險增加，而高的該值表明較低的風險。100000這個值被選用來確保其應當始終高于實際測得的最大U—ANX—tot值。在圖8中可以看到twostepvarl的表現(xiàn)。(針對低于2.5和超過12的PSA—mi值，恒定的twostepvarl使得ROC曲線以可注意到的直線片斷開始和結束)。0.740的AUROC當然與0.5非常不同。此外，強調(diào)了與傳統(tǒng)PSA試驗的比較例如，"PSAjm〉4，，的判斷標準在該分析數(shù)據(jù)組中導致80.3%的敏感性以及49.5%的特異性。而使用"twostepvarK450"的判斷標準獲得了同樣的敏感性一80.3%,但是卻獲得的了57.4%的特異性。圖8的例子證實了分步AUROC值的原理，其依賴于取決于PSA水平的不同的測量(PSA或膜聯(lián)蛋白A3值)。對專家而言顯而易見的是這些原理與表4-6中列出的若干結果中所用的相同，并提供了更高的AUROC值。通過對具有中間PSA值的患者考慮基于膜聯(lián)蛋白A3的多個變量，進一步證實了膜聯(lián)蛋白A3變量在具有中間水平的血清PSA的患者中預領'J癌癥的優(yōu)秀表現(xiàn)。根據(jù)上面闡述的方法和策略，對表3-6中展示的參數(shù)進行ROC曲線分析。除了這些變量之外，使用通過邏輯回歸分析產(chǎn)生的下述參數(shù)進行ROC曲線分析。anx.comb.var基于按照下述關系用組合的U—ANX_ug和U—ANX—tot作為變量進行的邏輯回歸分析。s4.463+2.906log(1+U_ANX—ug)-0.7901og(1+U一ANX—tot)comb.var.anx.psal基于4安照下述關系用組合的PSAjm和U—ANX—tot作為變量進行的邏輯回歸分析。s0.254+1.0461og(1+PSAJm')-0,342log(1+PU—ANX—tot>comb.var.anx.psa2基于4要照下述關系用組合的PSA—im和PU—ANX—tot作為變量進行的邏輯回歸分析。s-2,386+3.294，og(1+PSAJni)-0.4751og(1+PU一ANX一tot)雖然極高或極低的PSA值提供了對癌癥/非癌癥狀況相對可靠的的判定，但是表4-6的結果清楚表明，基于膜聯(lián)蛋白A3的參數(shù)的多種組合在用于PSA的中間值時要比PSA表現(xiàn)更好。因此，對exprimate尿上清液或沉淀團中膜聯(lián)蛋白A3水平(包括上清液與沉淀團之比)的測量提供了改善的診斷可靠性。為證實這些結果的用途，在圖9和表7中詳細展示了針對comb.var.anx.psa2的ROC曲線。該ROC曲線僅基于具有2ng/mL至6ng/mL之間的PSA值的患者，并且給出了非常顯著的AUROC值一0.791，盡管只使用了該范圍中的109名患者用于研究。此外，該ROC曲線展示出敏感性(真陽性部分)相對特異性(真陰性部分)的非常陡峭的上升，這對于預測值來說相當有利。例如，在54%的敏感性水平時，特異性為96%(圖9,表7)。針對anx.comb.var的ROC曲線類似，對于4ng/mL至10ng/mL之間的PSA而言，每文感性為38%,特異性為91%(AUROC0.78)。本文公開的數(shù)據(jù)令人信服地證實，膜聯(lián)蛋白A3是用于前列腺癌的新的有效的標志物，其在PSA值最不可靠的那些患者中尤其有效。總而言之，雙盲、多中心的第三種復雜研究顯示，最可靠的和統(tǒng)計學上顯著的診斷讀數(shù)是前列腺按摩后exprimate尿上清液中膜聯(lián)蛋白A3的量，該exprimate尿上清液是在適合于可能的前列腺癌患者的標準臨床程序(DRE)期間用標準低速離心獲得的。這是非常有用的，因為這允許直接進行基于ELISA的試驗或者基于抗體的其它試驗，而無需先溶解沉淀的樣品(存在去垢劑、鹽、化學物質(zhì)等干擾的危險)。上清液中這種膜聯(lián)蛋白A3的量與癌癥反相關，在非癌癥中，膜聯(lián)蛋白A3的量較高，有些跡象表明，對非癌癥病例的額外及隨后的分析可以進一步才是高總體診斷價值。結果完全與前兩項研究一致，前兩項規(guī)模更小，并且在某些方面，對于樣品收集和樣品控制并不完全。第一項研究^又包括了沉淀團(圖6),但是我們發(fā)現(xiàn)了對于癌癥患者而言的反相關性。在該研究中包括了一組健康志愿者，他們并非用于進行隨后研究的病例。在第二項研究期間，考慮到了上清液-膜聯(lián)蛋白A3和沉淀團膜聯(lián)蛋白A3(雖然采用了太小的樣品數(shù)，無法獲得統(tǒng)計學上顯著的解決方案)，其呈現(xiàn)這樣的趨勢較之BPH和其它非癌癥患者，癌癥患者中上清液與沉淀團之比更高。這與第一項和第三項研究完全一致，因為很明顯地，癌癥患者中低沉淀團膜聯(lián)蛋白A3的量組合具有稍高的膜聯(lián)蛋白A3的量給出較大的比例(圖7)。在非癌癥患者中(例如BPH、纖維化和其它)，顯然，總體上大得多的沉淀團和上清液中膜聯(lián)蛋白的量組合起來，給出了較低的總體比例。上清液中膜聯(lián)蛋白A3信號的可靠性提供了實驗上和臨床上有利且容易的診斷讀數(shù)。權利要求1.至少一種膜聯(lián)蛋白，優(yōu)選膜聯(lián)蛋白A3在治療癌癥，特別是在治療泌尿生殖道和/或腸道癌癥中的用途。2.診斷癌癥，特別是泌尿生殖道和/或腸道癌癥，和/或區(qū)分癌性和非癌性組織的方法，所述方法包括如下獨立步驟-測定至少一種細胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白的豐度，和/或-測定至少一種細胞外膜聯(lián)蛋白的豐度，尤其是使用尿樣或其組分來進行。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述膜聯(lián)蛋白至少是由膜聯(lián)蛋白Al、膜聯(lián)蛋白A2、膜聯(lián)蛋白A3、膜聯(lián)蛋白A4、膜聯(lián)蛋白A5、膜聯(lián)蛋白A6、膜聯(lián)蛋白A7、膜聯(lián)蛋白A8和膜聯(lián)蛋白A10構成的組的成員，并且其中優(yōu)選將所述至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度與至少一種其它蛋白的豐度一起測定。4.如權利要求2或3所述的方法，其特征在于，將所述至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度與至少另一種膜聯(lián)蛋白的豐度一起測定。5.如權利要求2至4中任一項所述的方法，其特征在于，將所述至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度與下述組的至少另一種蛋白的豐度一起測定，所述組由血清淀粉狀蛋白P、異肽酶T、肌肉類型的脂肪酸結合蛋白、半乳糖凝集素1、熱休克蛋白90、Bip、蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶、表皮類型的脂肪酸結合蛋白、烯酰基輔酶A水合酶和核仁磷酸蛋白構成。6.如權利要求2至5中任一項所述的方法，其特征在于，將所述至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度與下述組的至少另一種蛋白的豐度一起測定，所述組由14-3-3家族、蛋白酶體、活化因子亞基2、細胞角蛋白家族、KNP-1oc蛋白和KNP-I(3蛋白構成。7.如權利要求2至6中任一項所述的方法，其特征在于，將所述至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度與至少一種血液或血清標志物，特別是Kallikrem蛋白酶家族的至少一個成員，優(yōu)選前列腺特異性抗原(PSA)的豐度一起測定。8.如權利要求2至7中任一項所述的方法，其特征在于，將所述至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度與至少一種上皮細胞標志物，特別是前列腺特異性膜抗原(PSMA)—起測定。9.如權利要求2至8中任一項所述的方法，其特征在于，使用膜聯(lián)蛋白A3和/或膜聯(lián)蛋白A8,優(yōu)選膜聯(lián)蛋白A3。1.如權利要求2至9中任一項所述的方法，其特征在于，癌癥選自前列腺癌、腎癌、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、子宮癌或結腸癌構成的組。2.如權利要求2至10中任一項所述的方法，其特征在于，在測定所述至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度之前，使尿樣或其組分接受分離過程，以產(chǎn)生細胞沉淀團和上清液。3.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述沉淀團被用來測定至少一種膜聯(lián)蛋白的細胞內(nèi)豐度。4.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述上清液被用來測定至少一種膜聯(lián)蛋白的細胞外豐度。5.如權利要求2至13中任一項所述的方法，其特征在于，在測定所述至少一種膜聯(lián)蛋白的豐度之前，加入陽離子螯合劑，特別是EDTA和/或EGTA。6.如權利要求2至14中任一項所述的方法，其特征在于，通過免疫組織化學方法測定所述蛋白豐度。7.如權利要求2至15中任一項所述的方法，其特征在于，從尿，特別是,人expnmate尿中獲得所述尿樣或其組分，所述exprimate尿是前列腺按摩之后回收的，特別是直腸手指插入后。8.如權利要求2至16中任一項所述的方法，其特征在于，對所述尿樣或其組分加以純化，特別是使其不含嗜中性粒細胞、單核細胞或外周血單核細胞(PMBC)，尤其是通過磁珠來純化。9.如權利要求2至17中任一項所述的方法，其特征在于，使用晨尿樣品或其組分。119.如權利要求1至15中任一項所述的方法，其中在糞便或腸道上皮細胞中測量膜聯(lián)蛋白水平。10.如權利要求1至15和19中任一項所述的方法，其中膜聯(lián)蛋白水平被用于在糞便的任何組分或制備物(任何可能的產(chǎn)生胞外體的上皮表面)中診斷胃腸道上皮癌癥。11.如權利要求1至15和19-20中任一項所述的方法，其中膜聯(lián)蛋白水平用于i拿斷結直腸癌癥。12.如權利要求2至21中任一項所述的方法，其中所述方法與對嗜中性粒細胞，特別是4丐衛(wèi)蛋白和/或嗜中性粒細胞白明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)的測定組合，以區(qū)分炎癥(Crohn病或潰瘍性結腸炎)。全文摘要本發(fā)明涉及至少一種膜聯(lián)蛋白治療癌癥，特別是治療泌尿生殖道和/或腸道癌癥的用途，本發(fā)明還涉及診斷癌癥，特別是診斷泌尿生殖道和/或腸道癌癥的方法，和/或區(qū)別癌性和非癌性組織的方法。文檔編號G01N33/574GK101213454SQ200680023883公開日2008年7月2日申請日期2006年5月22日優(yōu)先權日2005年5月21日發(fā)明者A·施拉坦霍爾茨,M·卡希爾申請人:蛋白質(zhì)系統(tǒng)股份公司